1 Sophie LEDRU Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement dun biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct délectrons

1

Sophie LEDRU

Relation formulation / propriétés Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement d’un électrochimiques dans le développement d’un

biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct d’électronsd’électrons

Travail réalisé sous la direction de

Mohammed BOUJTITA

28 Octobre 2005

2

Objectifs de cette étudeObjectifs de cette étude

Préparation de biocapteurs sérigraphiés adaptés à l’analyse par injection en flux continu

Introduction

Projet global:

Questions préliminaires:

Caractéristiques des encres conductrices ?

Transfert direct possible?

Utilisation en AIFC ?

3

Analyse par injection en flux continuAnalyse par injection en flux continu

Introduction

4

Analyse par injection en flux continuAnalyse par injection en flux continu

Introduction

Contraintes

Mise au point d’une cellule d’analyse adaptée

Optimisation des méthodes d’immobilisation des composants

Avantages

Analyse rapide et automatisable

Appareillage simple et peu coûteux

Technique dynamique

Détection ampérométrique

5

1. Les électrodes sérigraphiées

2. Caractérisation électrochimique du transducteur

3. Modification de l’encre par la HRP

4. Application à la détection du L-lactate

Plan de la présentationPlan de la présentation

1.1. Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées

2. Caractérisation électrochimique du transducteurCaractérisation électrochimique du transducteur

3. Modification de l’encre par la HRPModification de l’encre par la HRP

4. Application à la détection du Application à la détection du LL-lactate-lactate

6

La sérigraphie: principe généralLa sérigraphie: principe général

raclette

écran

substrat

Porte-substrat

Film imprimé

cadre

encre


7

DEK 245: Machine semi-automatiqueDEK 245: Machine semi-automatique

Pompe

Porte-substrat

Support écran

Raclette


8

Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées

Support

Contre Électrode

Électrode de Référence

Électrode Indicatrice

Couche Diélectrique

Électrodes prêtes à l’emploi jetables

Facilité d’utilisation

Production à grande échelle rapide et peu coûteuse


9

La cellule de détectionLa cellule de détection


Cellule de type « wall-jet »

entrée

sortie

10

Différentes configurations possiblesDifférentes configurations possibles

I II III

C

E

S

L

Albareda-Sirvent M., Merkoçi A., Alegret S. Sensors and Actuators B 69 (2000) 153-163


11

Encre biocompositeEncre biocomposite

Impression de l’électrode en une seule étape

Optimisation indispensable de la composition

Encre biocomposite

Particules conductrices Graphite

Enzyme

Peroxydase de raifort (HRP)

SolvantCyclohexanone

Polymère Acétate de cellulose


12


1. Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées

2.2. Caractérisation électrochimique du transducteurCaractérisation électrochimique du transducteur



13

Préparation de l’encre conductricePréparation de l’encre conductrice

Homogénéisation par malaxage mécanique

Vérification de la rhéologie (viscosité, stabilité,…)

Poudre de graphite + Liant = Encre

(27 %) (73 %)


14

Conditions expérimentalesConditions expérimentales

• Voltampérométrie cyclique

• Spectroscopie d’impédance électrochimique

• Couple Fe(CN)63-/Fe(CN)6

4-

• Solution 1 ou 2 mM dans KCl 1 mol.L-1

• Encres de différentes compositions: 14, 23 ou 30 % de polymère

Acétate de cellulose (AC)

PVC


15

Étude par voltampérométrie cyclique

AC 14% 23% 30%

103*k°(cm.s-1)

1,4 ± 0, 3 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1

« Méthode de Nicholson »

Nicholson R. S. Analytical Chemistry 37 (1955) 1351-1355

ΔEp

vk°

Ψ = γα k° (πaDo)-1/2

γ = (Do/Dr)1/2 et a = nFv/RT

ΔEp > 60mV

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

E/V vs. Ag/AgCl

Étude des cinétiques de transfert électroniqueÉtude des cinétiques de transfert électronique


16

« Équation de Butler-Volmer »

0,24±0,060,38±0,10,55±0,09α

1,4 ± 0,31,3 ± 0,21,3 ± 0,3103*k°Butler-Volmer

Nicholson

30%23%14%AC

0,4 ± 0,10,7 ± 0,11,4 ± 0,3103*k°

Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’

c )

Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C

α

Ak°



17

« Équation de Butler-Volmer »

Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’

c )

Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C

α

Ak°



α 14% 23% 30%

AC 0,55±0,09 0,38±0,10 0,24±0,06

PVC 0,23±0,08 0,24±0,06 0,13±0,05

Limitation du transfert électronique par le polymère

A = 2,0 ± 0,4.10-2 cm2

k° = 1,5 ± 0,4.10-3 cm.s-1

18

Étude morphologique de la surface de l’électrodeÉtude morphologique de la surface de l’électrode

MEBÉlectrode sérigraphiée (AC 14%)

x 200Rugosité de la surface

CPE

n

1Z =Q jω

dcQ

Qjg

Rjg

Rm Qdc

Re(Z)/

0 10000 20000 30000 40000 50000

-Im

(Z)/

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

CA 14%CA 23%CA 30%


19

Modélisation du comportement électrochimique de la surfaceModélisation du comportement électrochimique de la surface

χ² < 10-4

Qdc

Rtc Qdif

Circuit de Randles

Circuit proposé :

Qjg

Rjg

Rm

Qdc

Rtc

Qdif

Rdif

Masse de l’électrode

Surface et solution


Re(Z) / k

0 2 4 6 8 10 12 14

-Im

(Z)

/ k

0

2

4

6

8

10

14% AC

20

Modélisation du comportement électrochimique de la surfaceModélisation du comportement électrochimique de la surface

Circuit proposé :

Qjg

Rjg

Rm

Qdc

Rtc

Qdif

Rdif

Masse de l’électrode

Surface et solution

2. Caractérisation électrochimique du transducteurRe(Z)/

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

-Im

(Z)/

0

10000

20000

30000

40000

50000

0,25V0,2V0,1V

Re(Z)/

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000

-Im

(Z)/

0

1000

2000

3000

4000

5000

0,25V0,2V0,1V

21



3.3. Modification de l’encre par la HRPModification de l’encre par la HRP



22

Système étudiéSystème étudié

HRP(red)H202

H20 HRP(ox)

I (nA)

Biocapteur de troisième génération

Transfert direct d’électrons


23

Préparation de l’encre modifiéePréparation de l’encre modifiée

Encre modifiée

Matériau conducteur: Carbone/graphite

=

Récepteur(s) biologique(s): Enzyme(s) (HRP, LOD,…)+Liant polymère +

« Encre standard »


0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 200 400 600 800 1000

[H2O2]/µM

I/nA

Mode1

Mode2

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 5 10 15 20

Nombre d'injections

I/I0

Mode1

Mode20

100

200

300

400

500

600

700

800

0 200 400 600 800 1000

[H2O2]/µM

I/nA

Mode1

Mode2

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 5 10 15 20

Nombre d'injections

I/I0

Mode1

Mode2

« Poudre modifiée »

24

25 nA

5 min

60

Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl

30

Utilisation en AIFC Utilisation en AIFC


20012,5 nA

5 min

50

100

20012,5 nA

5 min

12,5 nA

5 min

50

100

25

Fonctionnement de l’électrode enzymatique


26

Transfert direct HRP / graphiteTransfert direct HRP / graphite

Vitesse de balayage 20 mV/s

Tampon Phosphate 0,1M pH 7,2

+ 0,1M KCl


E / V vs. Ag/AgCl

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

I / µ

A

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

Ledru S., Boujtita M. Bioelectrochem. 2004 64 71-78 E°’= -0,17 ± 0,05 V vs. Ag/AgCl

Étude similaire pour la pâte de carbone:

Couple de la HRP

Hème- Fe(III) / Hème-Fe(II)

E°’= -0,16 ± 0,04 V vs. Ag/AgCl

27

E / V vs. Ag/AgCl

-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,40

100

200

300

400

Mécanismes électrocatalytiquesMécanismes électrocatalytiques

Voltamogramme hydrodynamique

H2O2

H2O

2e-

ks

k1

3+ 4+12 2 2

4+ + - 4+2

4+ + - 3+32

HRP native (Fe ) + H O Composé-I (Fe =O; )+ H O

Composé-I (Fe =O; ) + H + Composé-II (Fe =O; )

Composé-II (Fe =O; ) + H + HRP native (Fe ) + H O

k

k

k

e

e




Vitesse de balayage: 20 mV/s

Tampon phosphate désoxygéné 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl

E/V vs. Ag/AgCl

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

I/µA

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

H2O2

TPE / V vs. Ag/AgCl

-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

-I / n

A

0

100

200

300

400

29

E/V vs. Ag/AgCl

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

I/µA

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

Mécanisme proposé

2 2 2

2 2 2

-

2 2

- +2 2 2

HRP-Fe(III) + H O Composé I + H O

Composé I + H O HRP-Fe(III) + O

HRP-Fe(III) + HRP-Fe(II)

HRP-Fe(II) + O HRP-Fe(II)-O

HRP-Fe(II)-O + 2 + 2H HRP-Fe(II) + H O

e

e

R. Huang et N. Hu Bioelectrochem., 2001, 54 75-81



E/V vs. Ag/AgCl

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

I/µA

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

O2

TP

H2O2

TP

30

Optimisation de l’encre biocomposite


31

Influence du polymèreInfluence du polymère

Acétate de cellulose (AC) ou PVC

14%, 23% ou 30%

[H2O2] / µmol.L-1

0 200 400 600 800 1000 1200I/

nA

0

200

400

600

800 AC

PVC

[H2O2] / µmol.L-1

0 200 400 600 800 1000 1200

I/n

A

0

200

400

600

80014%

23%

30%

sensibilité

linéarité

Limitation de la diffusion


AC

32

Influence du solvant organiqueInfluence du solvant organique

Influence du solvant sur l’adsorption

HRP

Mélange au solvantSéchage

Électrode de référence

Mélange au solvantSéchage

Adsorption sur le graphite

Électrode “ avant adsorption”

Électrode“après adsorption”

Malaxage avec l’huile de paraffine

81,8 8,6% 46,5 5,8 %

Électrodes à pâte de carbone

100 %

/nm

250 300 350 400 450 500 550

DC

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

HRP native HRP-CH


33

Modification chimique de la HRPModification chimique de la HRP

• Comment ? Oxydation par le NaIO4

(Formation de fonctions aldéhydes par oxydation des résidus glucidiques)

• Pourquoi ? Couplage avec la LOD (lactate oxydase)

• Diminution de l’activité enzymatique en solution

[H2O2]/µmol.L-1

0 200 400 600 800 1000 1200

I/n

A

0

200

400

600

800

1000

Nombre d'injections

0 20 40 60 80 100

100*

(I/I

0)

50

60

70

80

90

100

HRP native

HRP oxydée


34

Étude quantitative du transfert direct d’électrons Étude quantitative du transfert direct d’électrons

Théorie de « Koutecky-Levich » adaptée à l’AIFC

[H2O2]-1 / µM-1

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

I cin

-1 /

nA

-1

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Pente (Med)

Pente (TDE)=

HRP en TDE

HRP totale

TDE

Médiateur

A. Lindgren, F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, T. Ruzgas, L. Gorton, J. Electroanal. Chem., 1998, 458 113-120

Ordonnée à l’origine

1/Ilim = f (V-3/4)

1/Icin

TDE 1 11 1

1 2 2k H O kI nFE skin DET

Med 1 11 1

2 1 2 2 3 21 k H O k AHI n FEkin

2 /3 5/12 3/ 4 1/ 2 3/ 41.38lim 2 2I nF H O D V a R


35

47 ± 119 ± 1ΓHRP totale (pmol.cm-2)

17 ± 111 ± 1ΓHRP TDE (pmol.cm-2)

36 ± 558 ± 5% de HRP en TDE

HRP oxydéeHRP native

Constante de vitesse relative au TDE:

ks ≈ 3 s-1

*A. M. Azevedo, V. Vojinovic, J. M. S. Cabral, T. D. Gibson, L. P. Fonseca, J. Mol. Cat. B, 2004, 28 121-128

Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption


Modification chimique de la HRPModification chimique de la HRP

Hypothèses: k1(nat) = 1,3.105 s-1.mol-1.L ; k1(ox) = 0,8 . k1(nat) = 1,04.105 s-1.mol-1.L

A = 0,0314 cm2

S. Ledru, N. Ruillé, M. Boujtita, Biosens. Bioelectron., 2005, sous presse

36





4.4. Application à la détection du Application à la détection du LL-lactate-lactate

37

Système étudiéSystème étudié

Électrode sérigraphiée bienzymatique


L-lactate

Pyruvate

LODox

LODred

H2O2

O2+ 2H+

2H2O HRPox

HRPred2e-L-lactate

Pyruvate

LODox

LODred

H2O2

O2+ 2H+

2H2O HRPox

HRPred2e-

38

Plan d’expériencesPlan d’expériences

Choix des paramètres à étudier:

Critères d’optimisation:

Sensibilité

Zone de linéarité


OuiNonOxydation de la HRP

2314AC (% )

3,52,4LOD (U/mg)

Niveau haut (+)Niveau bas (-)Paramètre

OuiNonOxydation de la HRP

2314AC (% )

3,52,4LOD (U/mg)

Niveau haut (+)Niveau bas (-)Paramètre

39

Plan d’expériencesPlan d’expériences

Essais1

LOD2

AC3

Oxydation1-2 1-3 2-3 1-2-3

Sensibilité(nA.mol.L-1)

Linéarité (µmol.L-1)

1 - - - + + + - 1,30 (0,46) 8 - 76 68 (26)

2 + - - - - + + 0,70 (0,24) 5 - 40 35 (17)

3 - + - - + - + 0,73 (0,23) 5 - 73 68 (68)

4 + + - + - - - 0,62 (0,21) 7 - 117 110 (56)

5 - - + + - - + 0,87 (0,07) 10 - 180 170 (28)

6 + - + - + - - 0,88 (0,01) 17 - 147 130 (51)

7 - + + - - + - 0,27 (0,01) 30 - 195 165 (21)

8 + + + + + + + 0,37 (0,01) 20 - 250 230 (71)

Effets E1 E2 E3 E12 E13 E23 E123


2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC;

Oxydation de la HRP

négatif positif

40

ValidationValidation

Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence)


[lactate] par UV / mmol.L-1

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

[lac

tate

] p

ar A

IFC

/ m

mo

l.L-1

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

y = 1,10x + 0,005

Solutions standards

41


Echantillons réels (UV = Méthode de référence)


Produits laitiers(riches en lactate)

Yaourt fruits

Crême café

Yaourt rhubarbe

Fromage blanc

Yaourt nature

Yaourt aux fruitsYaourt noix

[L-l

ac

tate

] /

mm

ol.

L-1

0

20

40

60

80

100

120

140

160

UVAIFC

42


Echantillons réels (UV = Méthode de référence)


Produits à base de tomates(pauvres en lactate)

[L-lactate] ajoutée /µM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

[L-la

ctat

e] r

etro

uvée

/µM

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

soupe à la tomatecoulis de tomates

43

E/V vs. Ag/AgCl

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

I/ nA

0

200

400

600

800

1000

ES nueHRP-ES LOD/HRP-ES

Interférences à la détection du lactateInterférences à la détection du lactate

Interférent modèle: l’acide ascorbique


Voltamogramme hydrodynamique

(Acide ascorbique ) )

Réduction

AL 1:0

AA 0:1

1:0,5

1:2

1:1

44

Mécanisme des interférencesMécanisme des interférences


E / V vs. Ag/AgCl

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

I / µ

A

-40

-20

0

20

40

60

Oxydation catalytique

P. Ugo, V. Zangrando, L. M. Moretto, B. Brunetti, Biosens. Bioelectron., 2002, 17 479-487

S. Ledru, M. Boujtita, Bioelectrochem., 2004, 64 71-78

Mécanisme EC’

[HRP-Fe(II)](n-1)+ → [HRP-Fe(III)]n+ + e-

[HRP-Fe(III)]n+ + Asc- → [HRP-Fe(II)](n-1)+ + P

AA / ES nue

AA / HRP-ES

TP / HRP-ES

45

ConclusionsConclusions

• Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère

• Transfert direct d’électrons entre le graphite et la HRP immobilisée– Mise en évidence du couple hème-Fe(III) / hème-Fe(II)

– Augmentation de la quantité de HRP en TDE par oxydation

• Influence des composants de l’encre sur les propriétés du biocapteur– Limitation de la diffusion du substrat par le polymère

– Désorption de la HRP due à la présence d’un solvant organique

• Application à la préparation d’une électrode bienzymatique– Méthode validée pour les produits laitiers

– Problème d’interférences avec l’acide ascorbique pour les produits pauvres en L-lactate

46

PerspectivesPerspectives

• Poursuivre les études en impédance

• Caractériser la rhéologie des encres

• Etudier l’effet de l’oxydation sur l’activité de la HRP

• Comprendre l’influence du solvant

• Augmenter la stabilité de stockage des électrodes modifiées par la HRP

• Résoudre le problème des interférences

• Adapter le procédé à la détection d’autres analytes

47

RemerciementsRemerciements

• Dr F. Fleury (Université de Nantes)

• Dr C. Cougnon (Université du Maine)

• N. Ruillé

• F. Ghamouss

48

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