ACTIVITES PYROPHOSPHATASIQUES ACIDE ET ALCALINE DE LA PLAQUE

DENTAIRE HUMAINE

J. VREV~N et R. M. FRANK

Centre de Recherches, FacultC de Chirurgie Dentaire, Strasbourg, France

R&um&Deux pits d’activite pyrophosphatasique sont mis en ividence dans la fraction acellulaire de la plaque dentaire. L’un, sit& en zone acide, est activt par le Co”; I’autre, situ6 en zone alcaline. cst trt% sensible au Mg’ ‘. Les conditions optimales de dosage sont determinies. Les activitis enzymatiques maxi- males se situent essentiellement dans la fraction stdimentable B 5000 g, suggkrant une origine bacttirienne.

Le pyrophosphate inhibe classiquement la precipi- tation et la dissolution des sels phosphocalciques (Fleisch et Russell, 1972). Les mkcanismes contr8lant sa destruction pourraient intervenir, par suite, au tours de divers processus se dlroulant en bouche. Le pyro- phosphate mis en Cvidence dans 1’Cmail et la dentine (Bisaz, Russell et Fleisch, 1968) pourrait influencer la dissolution de la phase minCrale lors de la carie den- taire. Les diphosphonates (Regolati et Miihlemann, 1970) et divers phosphates condens& (Harris, Das et Nizel, 1965) diminuent la frtquence carieuse chez le rat. Cependant, les pyrophosphates ne se r&&lent que faiblement protecteurs envers la carie dentaire, peut- ?tre. par suite de leur destruction rapide par les pyro- phosphatases de la bouche.

La prCsence de pyrophosphate a Cgalement pu itre mise en Cvidence dans la salive, la plaque et le tartre (Vogel et Amdur, 1967; Hausmann et al., 1970; Edgar et Jenkins, 1972). Les concentrations mesurCes varient selon les techniques utilisles, mais une corrklation entre, d’une part, une forte teneur en pyrophosphate dans la salive (Vogel et Amdur, 1967), et la plaque den- tair (Edgar et Jenkins, 1972) et d’autre part, une faible tendance B la formation du tartre a pu ttre observCe. Les diphosphonates, utilisCs en bains de bouche (ML% lemann et al., I970), dans les pttes dentifrices (Sturzen- berger. Swancar et Reiter, 1971) ou dam le rCgime (Francis et Brinner, 1973), semblent efficaces dans la privention du tartre. Aucun effet n’a pu itre observC avec le pyrophosphate (Kinoshita et Mtihlemann, 1966), bien qu’in vitro il paraisse actif. 11 semble que la salive soit responsable de son inactivation (Draus, Les- niewski et Miklos, 1970).

La pr6sence dans la plaque dentaire d’enzymes hyd- rolysant le pyrophosphate peut expliquer ces phCno- mknes.

MATERIEL ET METHODES

Prt;purutim.s rnzymuriyues

(a) Fruction ace/h&ire dr plaque dmtuire. De la plaque supra-gingivale. d’Pge indCtermint provenant des faces ves-

tibulaires et palatines ou linguales saines, prt+levCe g l’aide de spatules mousses sttriles, est recueillie dans du s&urn physiologique a 0°C chez I000 sujets, Bgts de 6-14 ans. La matrice interbactirienne de la plaque est obtenue selon la mCthode de fractionnement d&rite par Krembel, Frank et Deluzarche (1969) et stockCe a moins 35’C jusqu’au moment de son utilisation. Dans certains cas, l’elimination des sels et la concentration des protCines sont obtenueb par ultra- filtration dans une cellule Amicon, iquipie d’une membrane PM IO.

(b) Plaque dmtairr prr’lrueh chpz le m&w patiem. De la plaque dentaire supragingivale est prClevCe tous les matins pendant 15 jours sur les faces vestibulaires de toutes les dents d’un mime sujet s’abstenant de toute hygitne buccale pendant cette pdriode. La plaque est mise en suspension, a 0 ‘C, dans du NaCl 0.9 pour cent. tamponnC B pH 7.0 par du tris-HCI. Apris centrifugation $ 5000 9 pendant I5 min dans unc centrifugeuse rtfrigkrie Beckman J 21. le liquide de lavage est recueilli. Le culot, remis en suspension dans la quantitl initiale de tampon (100 mg de plaque,;ml). est soumis B une sonication de 3 fois I min B la position moyenne d’un dtsintigrateur ultrasonique M.S.E. 150 W. Entre chaque sonication, un repos de I min est respect6 pour tviter I’Cchauffement de I’Cchantillon. qui reste con- stamment plongC dans de la glace fondante. Apr& une nou- velle centrifugation B 2O.OOOg pendant 30 min. le surna- geant et le culot resuspendu sont ricuptrCs.

(c) &live miute. parotidirnw et sous-,nuui//cri~r du n&w

patimt. La salive mixte, stimulke par mastication de paraf- fine, subit un traitement similaire. Apris centrifugation h 5000 y pendant I5 min, le surnageant est concentrC 10 fois par ultrafiltration. Le culot est resuspendu dans un volume de solution saline tamponnte, 10 fois moindre que le volume initial. II est soniqui et centrifugC h 20.000 9, selon le pro- cessus dPcrit plus haut.

La salive parotidienne est recueillie sur de la glace g&e g une cupule de Lashley (I 9 16). La salive sous-maxillaire est prilevte. B l’aide d’une cupule de caoutchouc. analogue h celle de Schneyer (1955). La salivation est stimulCe B I’aide de bonbons acidults.

La plaque dentaire, Ies salives mixtes. parotidienne et sous-maxillaire sont prtlevees le matin chez le mime patient. Les salives sont concentrtes IO fois par ultra- filtration.

(d) Cultures hucte’riennes. Des souches pures de Strep. rnurans (OMZ 61), Strep. sanguis (OMZ 19) et Strep. sali- ~rmius (OMZ 26). dues g I’obligeance du Dr. Guggenheim de

203

204 _). VKI VI ‘\1 cl R. M. t;KAsjh

Zurich et des Actinortl~ccs riacows (X,) et Acliwrn~ce.\ IYUCS- lundii (X,) (Frank. Guillo et Llory, 1972) sont cuitivts g 37’C dans un milieu “Brain Heart” (Difco, Detroit) pendant un temps suffisant pour provoquer une lyse bactlrienne. L’elimination des sels du milieu de culture est rtalisle par dialyse a 4 ‘C, 54 hr B 4 C dans un tampon tris-- HCI 0.005 M. b pH 7.0 renouvell 3 fois.

L’activitt pyrophosphatasique (pyrophosphate phospho- hydrolase EC.3.6. I, I .) (PPi-ase) est dCterminCe par mesure du phosphate lib&C i partir du pyrophosphate de sodium (Sigma Chemical Co.. St. Louis). En zone acide. un tampon 0.1 M. acide acCtique-a&ate de Na. pH 5.5 est utilist!. La concentration cn suhatrat est 6 mM et en cobalt dc I mM. En Tone alcaline. le milieu est tamponnt par du tris-HCI 0.1 M (pH X.5). La concentration en pyrophosphate et en magnisium est respectivement de 2.5 mM et 5 mM.

Afin de prCvenir la multiplication bactCrienne. 0.01 pour cent de thimcrosal (Fluka A. G., Buchs) est alout& aux prep- arations. Le volume final est de 200 111. dont IO0 111 d’cxtrait enzymatique. L’incubationb 37°C se poursuit pendant 16 hr. temps compatible avec la cinCtique temps. La rCaction est interrompue par addition de 0.8 ml d’acide trichlorac&que B 5 pour cent glacP.

Le phosphore lib&t: est dos& soit par une modification de la technique de Fiske et Subbarow (I 925). soit par celle de Marinetti et ul. (1959) lorsqu’une plus grande sensibilitd est ntcessaire. Les mesures sent rCalisies en double ou en triple. La correction pour I’hydrolyse spontan@e du pyrophosphate et le phosphate contenu dans les prtparations est obtenue par soustraction de la valeur des contrBles appropriCs.

Les protCines sent dosies par la mtthode de Lowry et ~1. (I 95 I) en utilisant la serum albumine bovine comme italon.

Lcs prlparations enrymatiqucs de plaque dentairc. salive mihte. salive parotidicnnc ct salive sous-maxillaire sont soumisca II unc ilcctrophorc%e scion la technique d’ornstein et Davies (1962). en utilisant un gel de polyacrylamide h 7.5 pour cent et un tampon de migration tris-Glycine B pH 8.3. Apris ilimination du persulfate. 1’Cchantillon de 100 /tl dana le sdccharose est soumis fi un courant de I mA par gel pen- dant 30 mln, puis dc 2.5 mA par gel pendant le temps ntces- saire ii la migration du colorant marqueur, le bleu de bromo- ph&ol. jusqu’h un rep&e. Une source Beckman Duostat maintient I’amp&age constant. Pour rCduire la diffusion et la ddnaturation. I’clectrophor&se a lieu ~1 4 C. Apres migration. les gels sont dbbarrassCs de lcur support et in- cub& dans un milieu semblable & celui utilisie pour la mise en Cvidence en tubes j essai, mais contenant en plus du nitrate de plomb. Celui-ci est ajoutb au milieu Jusqu’B for- mation d’un Ieger prlcipite qui est PliminP par filtration. L’incubation du gel a lieu h 37 C pendant 12 hr. La r&t-la- tion des pr&zipitt% se fait par le sulfure d’ammonium en solution diluCe. Un contrBle est effect& en omettant le sub- strat dans le milieu d’incubation.

RESULTATS

(LI) Etude tics trc./ir.i/is c~rl~yr??ufir/uc3

(i) Ejjh du pN sur I’uctiuitL: et Iu stahiliti Dans un milieu ne contenant que le substrat et le tampon, une activitk centrCe sur pH 5,5. en tampon adtate, apparait

et dkroit progressivement vers la zone alcaline. En prCsence de magksium, l’activitk en zone acide est llgkrement dCprimCe et un optimum alcalin apparait B pH 8,5:9,0 en tampon tris-HCl (Fig. I). L’lpaulement B pH 7.0 pourrait correspondre B une autre enzyme.

Les prkparations enzymatiques, prkincubkes 2 hr h 37 C. B divers pH, en I’absence de leur substrat, sont ensuite incubies g pH 5.5 et 8.5. Dans ces conditions. la pyrophosphatase acide se r&Ye d’une mkdiocre sta- bilitl. tandis que la pyrophosphatase alcaline se rkkle moins affectCe, sauf par les pH trtfs acides (Fig. 2).

(ii) J@ctrur.s. Pyropho,sphatn.sc~ acidr. La pyrophos- phatase acide est sensible B divers cations bivalents 5mM. Le Mg2+, le Ca2+ et le Mn’+ I’inhibent tandis que le Zn’+ et surtout le Co2’ I’activent (Table 1). La concentration optimale en Co2 + se situe entre I ,5 et 2 mM (Fig. 3). mais pour kiter la formation d’un prC- cipitC. une valeur ICgtrement plus faible (I mM) a ItC adopt& pour les dosages habituels.

L’EDTA provoque une inhibition. Comme la plu- part des phosphatases acides, la pyrophosphatase acide est sensible au fluor.

Pgrophosphatasr alcclline. En zone alcaline, tous les cations bivalents utilisls augmentent la vitesse d’hyd- rolyse du pyrophosphate. Le magnksium est le plus efficace. Le substrat rCel des pyrophosphatases inor- ganiques. ktant un complexe pyrophosphate-cation di- valent (Josse, 1966a,b), un rapport Mg’+/PPi &gal B 1 est en glnCra1 optimal. Cependant un exc&s d’ions magnksium augmente encore considlrablement I’acti-

30

20

2

IC

Fig. I. Effet du pH sur I’activitC pyrophosphatasique de la fraction acellulaire de plaque dentaire. Les incubations ont lieu& 37”C, dansdes tampons0.l M:(~)AcCtatedeNa--acide acCtique, (0) Cacodylate de NapHC1, (V) tris-HCl et (0) GlycineeNaOH. La courbe B optimum alcalin correspond $ des essais effect&s en prksence d’un rapport Mg’+/PPi de 2; I’autre courbe est r&al&e en I’absence de Mg’+.

mU = mpM PPi hydrolys&es/mg/min.

Activites pyrophosphatasiques acide 205

I I I I I I I 4 5 6 7 0 9 IO

PH

Fig. 2. Effet de I20 min de preincubation de la preparation enzymatique a divers pH et a 37°C. La prtincubation sans substrat est effect&e dans des tampons 0,05 M: (0) Acetate, (0) Cacodylate, (V) Tris et (0) Glycine. L’incubation avec substrat se fait dans les conditions optimales en tampon

0.2 M Acetate 5,5 (-) ou Tris 8.5 (--).

Table I. EtTet de dwers cations bivalents, de I’EDTA et du Ruor SW I’activlti pyrophosphatasique

Effecteurs 5 mM Pyrophosphatase aode Pyrophosphatase alcalme

Mg’+ _ +++ Co’ + ++ +++ ZIl” + + C‘,‘. _ + Mn’+ _ +++

EDTA NaF _

L’activatton de l’enzyme est symbolis& par les signes (c), l’inhihrtion par les sngnes , 1.

4oc

a-” /j\

5 ‘0 ; c 1.

0”

2oc

I 2 3 4 5

Co”, mM

Fig. 3. Etfet de la concentration en cobalt sur l’activite pyro- phosphatasique en zone acide. Les resultats sont exprimes en pourcentage de I’activite mesuree en l’absence de

l’activateur.

Fig. 4. Effet du rapport magnesium/pyrophosphate sur I’hydrolyse du pyrophosphate a pH 8,5 par la fraction

acellulaire de plaque dentaire.

vite pyrophosphatasique alcaline (Fig. 4), qui est prati- quement nulle en son absence (Fig. 1). L’optimum se situe entre 1,75 et 23: les rapports superieurs sont moins favorables.

L’inhibition marquee par I’EDTA, s’explique par la chelation des cations indispensables a I’activite enzy- matique.

(h) Distribution des activiths enzymatiques

Le lavage au NaCl 0,9 pour cent, tamponne a pH 7,0 par du tris-HCl, de la plaque provenant d’un seul patient ne contient qu’une trts petite partie (infer- ieure a 10 pour cent) de l’activite presente dans la plaque totale. La majeure partie de celle-ci est like a la fraction sedimentable a 5000 g principalement consti- tuee de microorganismes, mais aussi de quelques cel- lules Cpitheliales desquamees et de polynucleaires.

Table 2. Distrlbutmn de I’activit6 pyrophosphatawque dans la plaque et la salive mmte. Les r&ultats sent exprimk en pourcentagc de la somme da actr-

wtCs mew&s dam les 3 frxtions

Plaque Sabve m,xtr

Acide AlC~llll~ Aclde Aloehne

I 5.5 4.1 I2.X 4.h 2 49. I 50.9 SO..5 47.5

3 4x4 45 xl.7 479

I = Lsvage de plaque dcntawr separC du culot par u,,c ocr,tr~lr~gat,o~, $

5 MUI9 x 15 mm ou surnageant dc salive mixtc xwm~sc au mike tra~tcmcnt. 2 = Surnageant de la centnlugation b ?O.ooOg x 30 ,,,I” des culot\ ohtenus

prCddemment et soniquk pendant 2 min. 3 = Gdots des centrdugationa h ?O.OOOJ rcrms en wspenrmn.

2 3

J. VKEVEN et R. M. FKANK

DISCUSSION

II ressort ainsi qu’une activitC pyrophosphatasique nette existe dans la plaque dentaire. Selon les con- centrations en divers constituants, et principalement en cations bivalents, I’activitl est profondiment modi- fiCe. surtout en zone alcaline. Le pyrophosphate Ctant formi: ;ILI tours de la synthise des protCines et des acides nuclCiques, ii n’est pas Ctonnant que les enzymes capahles de les mktaboliser soient tres r+andues aussi bicn dans les cellules que dans les bactCries.

Fig. 5. Localisation de la pyrophosphatase alcaline sur dea gels de polyacrylamide h 7.5 pour cent. Le gel (I) correspond a la fraction acellulaire de plaque dentaire. le gel (2) au surnageant de plaque IavCe et soniquke et le gel (3) au culot de plaque soniquke. L’intensitC relative des diverses bandes

Apr&s sonication de ce culot et une centrifugation Li 20.000 g, on retrouve environ 50 pour cent de l’activitk dans le surnageant (Table 2). Le culot resuspendu con- tient encore une part importante d’enzyme adsorbCe ou like, mais accessible au substrat. La rkpartition des activitCs ne diffirent pas sensiblement en zone acide ou alcaline, dans la plaque ou la salive.

La pyrophosphatase acide a Ctl mise en Cvidence dans divers tissus: le foie (Ragab, Brightwell et Tappel. 196X). Ic cartilage (Alcock et Shils. 1969) et 1’0s (Lie- berherr. Vreven ct Vaes. 1972). Elles sont IocalisCes essenticllement. avec les autres hydrolases acides dans les Iysosomes (Ragab rt [II., 1968; Vreven, Lieberherr et Vaes. 1972). De nombreuses bactlries, dont les strep- tocoques (Clark et Frattali, 197 I, 1973) prCsentent Cga- lement une activitC pyrophosphatasique. La pyrophos- phatase acide de la plaque peut done a priori provenir dc sources diverses. Sa prlsence dans la fraction sCdi- mentable B 5000 g. d’oti elle n’est partiellement lib&de quc par dcs moyens trts inergiques comme les ultra- sons (alors clue dcs congClations d&ongClations SLIC- cessives sent pratiquement sans effet) suggere une ori- gine essentiellement bactdrienne. La microscopic Ilec- tronique confirme la prisence de pyrophosphatase acide ILI niveau de nombreuses bactCries Gram positif et nigatif de la plaque dentaire (Vreven et Frank, 1973a).

n’a pas tktt indiquke.

La migration des 3 fractions de la plaque dentaire &pare plusieurs mollcules ayant une activitl pyro- phosphatasique B pH 8,5 (Fig. 5). Les 3 enzymes, mises en Cvidence dans le liquide de lavage, migrent au mCme niveau que certaines enzymes lib&&es par la sonica- tion. La premitre bande migrant au deli de Rm 0.5 est commune aux 3 prPparations. tandis que celle prCsente au pale d’application, n’apparait que dans le culot final et correspond vraisemblablement B des moltcules 1iCes & des structures de haut poids mol&ulaire (Fig. 5).

L’activiti pyrophosphatasique dc la salive mixte est Cgalement Clevke dans une fraction skdimentable i 5000 g. d’oti elle peut ?tre 1ibCrCe en grande partie par sonication (Table 2).

Les bactCries Ctant le constituant essentiel de la plaque et du culot de salive mixte. plusieurs souches d’origine buccale, g savoir Strep. rnutans OMZ 61. Strep. sanguis OMZ 19, Strep. saharius OMZ 26. Actinomyces ~iscosu.s (X,) et Actinon~yes naeslundii

(X2). ont CtC cultivCes pendant un temps prolongC cor- respondant B leur phase de dlclin. Une activitC pyro- phosphatasique,acide et alcaline a pu Ctre dCmontre dans ces 5 souches tant dans le milieu de culture, que dans le culot bactCrien. soumis B la sonication.

La presence de pyrophosphatases, ayant leur opti- mum d’activite en zone neutre ou alcaline, a Iti dcmontree dans divers tissus dont les globules rouges humains (Pynes et Younathan, 1967), le foie et l’intes- tin (Iric e’t al.. 1967: Moss ct al.. 1967), mais elles ont t:tG principalement itudiies dans les tissus calcifiis adultcs ou en voie de calcification comme le cartilage (Alcock et Shils, 1969) et 1’0s (Cox. Gilbert et Griffin, 1967; Lieberherr et ul., 1972). L’activiti phosphatasi- qur alcaline Clevle. observle lors de la minCralisation (Robison. 1923). pourrait strc lile h la pr&ence d’une enrymc agissant kgalement sur le pyrophosphate, que ce soit dans 1’0s (Cox et d., 1967; Lieberherr ct al.. 1972) ou la dent (Woltgens. Bonting et Bijvoet, 1970). Cepcndant une activite pyrophosphatasique peut exis- ter en I’ahsence de phosphatase alcaline (Alcock et Shils, 1969). Dans la plaque dentaire. I’activitC pyro- phosphatasique alcaline. mise en lvidence sur gel de polyacrylamide, montre existence de plusieurs hydro- lases migrant a des niveaux diffirents des phosphatases alcalines dPjh d&rites (Vreven et Frank. 1973b). Les m?mes bandes, retrouvCes apr&s sonication du culot de plaque. la prisence de pyrophosphatase alcaline dans des souches pures de bactCries buccales (Clark ct Frat- tali. 1973) ainsi’que l’activitl tr&s faible ou nulle recon- trCc dans les salives parotidiennes et sous-maxillaire pures suggtrent une origine principalement bactlr- ienne pour la pyrophosphatase alcaline de la plaque dentaire. II faut cependant remarquer la prtsence d’une pqrophosphatase active ;I pH 7.7 dans les Crythrocytes

Acttvites pyrophosphatasiques acide 207

(Pynes et Younathan, 1967) et que les diverses cellules libertes dans la cavite buccale ont probablement une activite pyrophosphatasique.

La presence de pyrophosphatase dans la matrice de la plaque dentaire pourrait provenir de la lyse des bac- teries ou pourrait s’expliquer par la liberation de I’en- zyme a partir de batteries intactes, comme cela a pu etre demontre pour plusieurs souches de Strep. mutans

(Clark et Fratalli, 1971, 1973). L’absence de phosphate dans le milieu peut egalement induire la formation d’enzyme hydrolysant le pyrophosphate (Josse, 1966).

L’existence d’une enzyme hydrolysant le pyrophos- phate dans la plaque dentaire est importante a plus dun titre. Dans les conditions favordbles a la deminer- alisation, a pH acide, les pyrophosphatases pourraient favoriser l’attaque carieuse, en hydrolysant le pyro- phosphate de Ternail et de la dentine.

Par contre, a des pH plus Clew%, et en presence du

Mg’+, les pyrophosphatases intrabacterienne ou extrabacterienne, pourraient supprimer I’inhibition de la calcification, liee a la presence du pyrophosphate. Les plus faibles concentrations en pyrophosphate dans la plaque (Edgar et Jenkins, 1972) sont peut-etre liees a l’activite pyrophosphatasique plus Clevee observee chez des sujets formant beaucoup de tartre (Draus, Tarbet et Miklos, 1968). Des etudes ulterieures cher- chant a determiner une correlation entre pyrophos- phate, pyrophosphatase, concentration en Mg” sont necessaires pour tester cette hypothtse.

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Summary-Two peaks of activity in pyrophosphatase were demonstrated in the human dental plaque. The first, in the acid zone, was activated by Co” : the second. in the alkaline zone, was very sensitive to Mg’+. The optimal dosage conditions were determined. The highest enzymatic activities were mainly located in the 5000 g sedimenting fraction. suggesting a bacterial origin of the enzymes.

ZusammenfassungpZwci Hohepunkte pyrophosphatasischcr Aktivitiit werdcn in dem nicht xllularen Tcil der Zahnplaque offensichtlich. Der eine. der in der SBureyone liegt. wird durch Co“ aktiviert, dcr andere, der in der alkalischen Zone liegt, ist auf Mg” sehr empfindlich. Es werden die besten Bed- ingungen der Dosierung bestimmt. Die griiBten enzymatischen Aktivitlten liegen hauptsachlich in dem in 5000 g sedimentbildenden Teil, was auf Bakterienursprung schlieBen 1IBt.