European J. Biochem. 9 (1969) 189-198

Comparaison de la composition chimique d’une fraction lipopolysaccharidique et d’une fraction polysaccharidique isol6es de BruceZZa melitensis

C. LACAVE et J. ASSELINEAU

Laboretoire de Chimie Biologique, FacultA dea Scienm, Univemit.4. de Toulouae

A. SERRE et J. Roux

Laboratoire de Microbiologie, Facult4 de MBdecine, Univereit4 de Montpellier

( R e p le 16 octobre 1968/22 janvier 1969)

Westphal’s procedure was found the most suitable for the isolation of lipopolysaccharide fractions from Brucella melitensis cells; only the fraction obtained in the aqueous layer (LPS) is studied in this paper. Beside LPS, an extracellular polysaccharide fraction (PS) was extracted from the culture medium of the bacteria, and the chemical composition of both fractions, LPS and PS, has been compared.

In both cases, nucleic acid contaminants were eliminated either by alcohol precipitation or by use of cetavlon. These treatments also removed an acidic polysaccharide containing mainly galactosaminuronic acid, which might be Vi antigen.

The main difference between LPS and PS ia the presence of a small amount of lipid A in LPS (ca. 1 As in the case of lipid A isolated from LPS of Enterobacteria, Brucella lipid A contains glucosamine and fatty acids, but B-hydroxymyristic acid could not be detected.

The behaviour of LPS and PS fractions on DEAE-cellulose columns is very similar, end the small differences that could be observed may be explained by solubility changes due to the lipid moiety present in LPS.

Both fractions contain 2-keto-3-hydroxy-octulosonic acid, a mixture of D- and L-glycero- D-mannoheptoses, a high amount of glucose, galactose, a 3,6-dideoxyhexose (cofitme or abequose), and a methylated sugar behaving as a methylated derivative of dideoxyhexose. Small amounts of rhamnose in PS and of arabinose in LPS seem to be due to contaminants.

En raison du rale jou6 par la pmoi cellulaire des Brucella dans certains phbnomhnes biologiques (anti- gBnicit6, toxicit&, pouvoir protecteur . . .) [i] il nous a paru intkressant d’ktudier la composition chimique de cette paroi. D’une manihre gkndrale, la composition chimique de la paroi de certaines bactdries B gram nkgatif a BtB bien btudihe, surtout chez les EnMro- bactCriacBes, et a fait, l’objet de revues d6taillBes [2] ; cependant, peu d’informations sont actuellement disponibles dans le caa des parois de BrwUa. Ant& rieurement, nous avions m i s en Bvidence dans les

Abrhiatiom nun w e l l e s . Dam la suite de l’expod, nous utilberons les abrbviations suivantes: LPS et Ps pour les prbparations de lipopolysaccharidea et polysaccharides respectivement, telles qu’elles eont dbfiniee dans le texte; LPSc et PSc pour lea mernes prbparationa ap& traitement par le catavlon; LPS.t et PSd pour lea pr6psrationa ob- tenues apSs traitement par 1’6thanol; KDO: acide c6to-2 d6eoxy-3 D-manno-octuloeonique; R,lC = RF raffortb au Rp du glucose.

Ce memoire comtitue une partie de la these de Doctorat- &-Sciences Natureues qui wra eoutenue par c. h a v e , en 1969, devant la Faculte dea Sciencea de Toulouse, enregist& au C.N.R.S. EOUS le No A.O. 2983.

parois de Br. abortus et Br. melitmie un peptido- glycane de composition semblable it celle des peptido- glycanes dkjit isolks d‘autres bactkries [3]; il a B t B Btudih ulthrieurement par Mardarowicz dans Brucella abortus S-19 [a]. Chez les Brucella, le peptidoglycane ne reprbsente qu’une treB faible proportion des con- stituants de la paroi.

Un groupe de substances, localisees dans les parois de bactkries $, gram nkgatif, a fait l’objet de nombreux travaux, en raison des propriBt6s biologiques varides qu’elles manifestent : ce sont les lipopolysaccharides et polysaccharides [ 11 responsables de l’antigBnicit0 et de la spBcificit6 de nombreuses bactbries [2,5]. Dans les Brucella, des travaux anciens dbcrivent des polysaccharides antigkniques, mais de nature chimi- que obscure [6]. Plus rbcemment, Westphal[7] a Lo16 un lipopolpccharide biologiquement inactif sans donner d‘information sur sa composition; Dubrovskaya et al. [8] ont compare les propriktes serologiques et la composition en sucres des lipopoly- aaccharides de souches R et 5. Enfin, Redfearn[9] d’une part, Parnaa ef al. [lo] d‘autre part, ont BtudiB

190 Lipopolysaccharide de Brucella melitensis European J. Biochem.

ces composes essentiellement au point de vue biolo- gique. On relhve de nombreuses contradictions entre ces divers auteurs en ce qui concerne la nature des constituants : tandis que Dubrovskaya mentionne des Werenoes entre lea formes R et S, Parnas n’en trouvc pas, et attribue les proprietds biologiques aux pro- teines plut6t qu’aux polysaccharides.

Dens ce travail, nous avons cherche it identifier lea principaux constituants d’une fraction lipopoly- saccharidique de Brucelb melitensis, designee dans ce qui suit par LPS, et it Btablir un parallkle entre LPS et une fraction polysaccharidique extra-cellulaire, designee par PS. I1 faut faire certaines restrictions cependant, it cause des fluctuations relevees au cours de l’experimentation : certaines fractions n’apparais- sent pas de fapon constante, de trhs 16gAres modifica- tions des conditions de culture (pH, temperature, dude) ou du processus d’extraction se repercutent sur les resultats obtenus. Ce fait n’est pas exceptionnel et a BtB souligne par Nowotny et al. [ill. Lea resultats ci-aprh ne tiennent compte que des donnees con- stantes et reproductibles.

MAaRIEL ET MgTHODES BactkPies

Elles proviennent de la souche Brucella melitensis M 15 isolee dans le Laboratoire de Microbiologie de la Facult6 de MBdecine de Montpellier 06 les premiers lots de bacteries ont Btt5 cultives. D’autres lots de la m6me souche bacterienne ont 6th cultivds it 1’Institut Merieux de Lyon. Le milieu de culture et les conditions de la recolte sont decrits dans une prhcedente publi- cation[12]. Les batteries en provenance de Mont- pellier Btaient repues en suspension dans un melange alcool-ether (l:l, v/v) et celles fournies par l’In- stitut Mdrieux sont en suspension dans un melange tampon phosphate de pH 7,24thanol (1 : 1, v/v). L’intervalle de temps separant le moment de la recolte de celui oh le materiel est trait6 eat inferieur it 48 heures.

Extraction Lipplysaccharide. Les methodes de Boivin [13]

et de Ribi [14] n’ont pas 6th retenues, la premiere donnant un melange trop complexe et la seconde ayant un tree faible rendement. Nous avons utilise Le mbthode de Westphal[15] : aprhs trois extractions successives 8. 65” par un melange phenol-eau (1 : 1, v/v), la phase aqueuse est dialyde pour 6liminer les traces de phenol ; le lipopolysaccharide en solution est prdcipit6 par l’ethanol en presence de MgC1, (on ajoute une solution de MgC1, 8. 20°/, dans l’6thanol jusqu’8 concentration de 0,2 A titre indicatif, les rendements moyens obtenus par rapport aux cellules entihres, ont 6th les suivants: (a) fraction isolee de la phase aqueuse (LPS): S o l 0 ; (b) phase intermediaire entre l’eau et le ph6nol: 180/,; (c) fraction soluble

dans le phenol (obtenue par precipitation par 1’Qther) : 2601,; (d) fraction insoluble dans le phenol: 470/0 (pour ses propri&t6s, voir [12]).

Polysacchuride extra-cellukzire. Les bacteries pro- venant de 1’Institut MBrieux sont centrifugees 1 4”, B l’aide d’une centrifugeuse Sorvall (15000 x g), puis lades avant extraction par le phenol. Le surnageant est concentre sous pression reduite (elimination de l’alc001 et reduction du volume), puis dialyse (3 jours contre eau courante et 2 jours contre eau distillke). On precipite le materiel en solution par 1’8thanol et on centrifuge pour recueillir le precipite (PS).

PrCcipitation par un sel d’ammonium quatermire (bromure de cay1 trimkthyl ammonium ou cetavlon). Aux PS ou LPS en solution it 0,5O/, dans le sulfate de sodium 20 mM, on ajoute une solution de cetavlon it 1,5 O l 0 dans l’eau ; par centrifugation, on recuphre le surnageant qui contient lea polysaccharides neutres d6barrassBs des acides nuclkiques. Les polysaccharides acides qui ont precipite avec le cetavlon peuvent 6tre dissocids avec une solution de NaCl 4 M [16,17].

Hydrolyses Les lipides sont liberes par hydrolyse par chau Rage

A, reflux dans l’acide acetique 0,l N ou HC1 0,Ol N 8. 100” pendant 1 h ; les sucres simples, par HC12 N ou H,SO, 2 N pendant 2 h A 110” en tube scell6; les desoxysucres par HC1 0,Ol N pendant 15 min it 100” en tube scellt5 ; les sucres amines, par HC14 N pendant 4 h 1 110” en tube scelle; enfin, lea acides amines, par HC1 6 N pendant 18 h it 110” en tube scelle et lea acides aminohexuroniques par HCl concentre pendant 2 h 8. 110” en tube scelle. Apres hydrolyse, on ajoute de l’eau distillee et on concentre sous pression reduite, en ajoutant plusieurs fois de l’eau pour chasser HCl; on laisse ensuite les hydrolysats au dessiccateur sous vide en presence de P,O, et de KOH. H,SO, est &mine sous forme de sel de baryum apres centrifugation.

Chromatographies Sur papier. Nous avons employe du papier What-

man no 1 pour les chromatographies ordinaires et no 3 pour les chromatographies preparatives. On utilise la chromatographie descendante avec les sysMmes de solvants suivants : (A) butanol-1 -acide acetique-eau (4: 1 : 1, v/v/v); (B) acetate d’ethyle- acide acktique-eau (3: 1 :3, v/v/v); (C) acetate d’ethyle-pyridine-eau (12:5:4, v/v/v); (D) buta- nol-1-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v); (E) butanol-1- pyridine-HC10,l N (5:3:2, v/v/v); (F) butanol-1- ethanol-eau (12:5:4et 5:1:4,v/v/v); (G) pyridine- pentanol-1-eau (7 :7 :6), v/v/v).

Les reactifs utilises pour la revelation des diffe- rents composes sont les suivants: la p-anisidine (301, dans l’acetone), le phtalate acide d’aniline [18] et le nitrate d’argent [19] pour les sucres; le reactif

Vol.9, No.2,1969 C. LACAVE. J. ASSELINEAW, A. SERRE et J. Ronx 191

$Elson-Morgan [20] et la ninhydrine 0’1 O/,, dans l’acetone pour les sucres amines, la ninhydrine pour les acides amines; l’o-phhylkne-diamine (chlorhy- drate) est caracteristique des acides cBt0-2 d6soxy-3 oniques (colorations Bvoluant du jaune au violet en passant par le vert-jaune et le rouge [21]). Pour les dBsoxysucres, nous avons utilisB les m6thodes d6crites par Edward et Waldron [22] et la mkthode d’Ander- son [23] qui est l’application sur papier de la reaction de Waravdekar et Saslaw [24].

Sur plaques. Nous avons utilisd des couches minces de cellulose 300 NM (Macherey, Nagel et Co) ; les solvants et rdactifs de rBv6lation sont lee memes que sur papier.

Sur colonnes. a) Fractionnement des LPS et PS sur colonnes de DEAE-cellulose (Touzart & Matig- non-CAP 0,87) : aprks lavage de 1’Bchangeur par la soude N, on fait passer de l’eau jusqu’3 neutralit6 et on Bquilibre avec le tampon servant au debut de 1’6lution (tampon Tris/HCl 0’05 M de pH 8,2). L’Blution se fait avec trois tampons de molaritds croissantes : 0’05 M, 0,02 M et 0,2 M. Concentration des produits 3 analyser : 50 mg dans 4 ml d’eau ; les fractions recueillies sont de 5 ml.

b) Fractionnement d’hydrolysats de PS et LPS sur colonnes de DEAE-cellulose selon la technique decrite par Osborn [25].

MCthodes andytiques

Les monosaccharides sont examines par la mB- thode de Dische [26] et les spectres d’absorption sont mesurks au spectrophotomktre Zeiss PMQ 11. Les hexoses sont doses par la methode 3 l’anthrone (modifi6e par Montreuil et Spik [27]); les pentoses sont recherches par la mkthode 3 l’orcinol[27]; les heptoses par la mbthode de Dische modifiee par Os- born [25]; les acides uroniques par la methode au carbazole [27] ; les 3,6-did6soxysucres par la methode de Ashwell [28]; les cBto-2 d6soxy-3 sucres par la methode de Waravdekar et Saslaw modifiee [28]. Les sucres amin& sont recherchee par la methode de Rondle et Morgan [29] et identifies aprks degradation en pentoses par la ninhydrine [30] ; les acides aminks sont doses B l’aide de l’Autoanalyseur Technicon. L’oxydation periodique selon Bagdian et al. [31] a Bt6 utilisee pour l’identification des heptoses.

par la m6thode de Westphal et par la papaine ont BM comparees et les resultatis feront l’objet d’une publica- tion ulMrieure [33]. Les extraits obtenus 3 l’aide du phenol induisent des titres en anticorps agglutinants plus eleves que les extraits traiMs par les enzymes; d’autre part, ces derniers contiennent un contaminant protbique decelable par immunodiffusion [33]. Enfin la methode au phenol a l’avantage d’gtre applicable aux formes R et S alors que les autres ne sont utili- sables qu’avec les formes S; c’est pour ces raisons que nous l’avons halement retenue. Seul, le lipopoly- saccharide extrait de la phase aqueuse (LPS) est Btudie dans ce qui suit, comparativement au poly- saccharide extra-cellulaire (PS). La composition et les propriBt6s des autres fractions de l’extrait ph6no- lique seront d6crites ultxirieurement.

PURIFICATION DES EXTRAITS

Braun et al. [34] ont decrit l’extraction d’un DNA par le phhol dans les Brucella; il n’est donc pas btonnant que les extraits obtenus selon Westphal contiennent des acides nucl6iques. Les solutions aqueuses 3 la concentration de presentent une forte absorption Q 260mp; les solutions de PS montrent aussi une absorption Q cette longueur d’onde, mais plus faible. Nous avons utilid, pour l’klimination des acides nucl6iques’ deux procBdBs Bgalement efficaces :

a) la precipitation par l’alcool : un volume d’6tha- no1 ajoutB 3 un volume d’une solution aqueuse (1 de PS ou LPS suffit 3 Bliminer la totalit6 des acides nucleiques ;

b) l’emploi d’un sel d’ammonium quaternaire: aprks action du cetavlon, il n’y a plus d’absorption dans le surnageant Q 260 mp.

Outre les acides nuclbiques, les preparations peuvent &re souill6es de proteines entrainees lors de l’extraction. L’examen des courbes d’absorption en ultra-violet ne montre pas d‘absorption de 275 B 280 mp, il n’y a donc pas de quantiMs importantes de prot6ines; ce resultat est confirm6 par un dosage des acides amin& lib&& par hydrolyse (Tableau 1).

Tableau 1. A d y s e d‘un hydrdysat de LP& b l’autoadyseur Technicon

Acide amin6 Concentrations

Rl%ULTATS ET DISCUSSION EXTRaCTION

Nous avons compare les mbthodes d’extraction des antigknes lipopolysaccharidiques les plus utilis6es : celles de Boivin et al. [13], de Westphal et al. [15], et de Ribi et al. [14]. Nous avons en outre essay6 une mBthode d’extraction prbconide par Scott [32] pour les polysaccharides, employant la papaine activh. Les propri6tds biologiques des pdpitrations obtenues

Acide aspartique ThrBonine SBrine Acide glutamique Proline Alanine Glucosamine Isoleucine Leucine Lysine Tymsine, phenylalanine, histidine

moles/lOO mg

0,45 0,30 0,50 1.05 0960 1’05 0’60 0,20 0’25 0’50

tram

w/100 mg 60 35 52

173 79 93

101 26 33

145 -

192 Lipopolysaccharide de Bnteelb melitem& European J. Biochem.

Le total des acides correspond B un taux de prothines infdrieur B l o l o ; les composes les plus abondants sont la lysine, l’acide glutamique, l’alanine et la glucosamine.

H I ~ T J ~ R O O J ~ N I ~ I T ~ DES EXTRAITS

(dhbarrass6s des acides nucldiques) Nowotny et al. [i l l ont beaucoup insist6 sur

l’h6t6rogenhitk des prkparations d‘endotoxine de Xer- ratia mrcescens quelle que soit la methode d’obten- tion utilisee. Les resultats que nous avons obtenus avec Brucellu melitensis confirment ces observations :

a) fractionnement par l’alcool: en utilisant des quantites croissantes d‘bthanol, on pr6cipite diverses fractions de la phase aqueuse (solutions de PS ou LPS) de compositions Werentes et correspondant vraisemblablement it des composds de poids mold- culaires diffbrents ;

b) fractionnement par le cetavlon: la chromato- graphie sur papier d’un hydrolysat de PS ou LPS montre l’existence d‘acides uroniques ou amino- uroniques, dont le comportement est le meme. Or, aprhs pr6cipitation des acides nucleiques par le cetavlon, ces deriv6s uroniques ont disparu de la fraction surnageante : il y avait donc un (ou plusieurs) polysaccharide(s) acide(s) dans la. pdparation initiale.

I1 est donc tres probable que PS comme LPS soient des melanges. Ceci confirmerait les r6sultats de Hinsdill et Berman [35] qui trouvent 9 antighes (par immunoelectrophorhse) en extrayant Brucella abortus par le phenol et les observations de Nowotny [ll]: &ant donne le grand nombre de reactions biologiques dont les endotoxines sont responsables, il est plausible de supposer que plusieurs types de substances interviennent .

Polysaccharide acide Sa recherche est plus facile avec la prbparation

de PS, car les complexes precipit6s par le sel d’am- monium quaternaire contiennent beaucoup moins d’acides nuclkiques ; mais ces rdsultats restent valables pour LPS,.

On rdcupere le polysaccharide acide B partir du precipit6 en le dissolvant dans une solution de NaCl4 M. Aprh hydrolyse hergique (HC1 concentr6 pendant 2 h B 1 lo”), on trouve un compose qui reagit comme les acides uroniques, mais qui se colore aussi par la ninhydrine (en jaune, puis vire au violet aprbs 24 ou 48 h). En utilisant le solvant G prkconisd par Heyns [36] pour &parer les acides hexosaminuroni- gues, et en comparant avec un t6moin d‘acide glu- cosaminuronique, on constate qu’on est en presence d’un acide migrant moins rapidement et dont le RF correspond ti celui de l’acide galactosaminuronique. En recherchant les sucres neutres, on ne trouve que le glucose (en faible quantie). Brownlee [37] a decrit

un rtntighne Vi dans diverses batteries dont Brucella melitensis, qu’elle obtient aprBs extraction par le phenol selon Westphal, et precipitation de la solution aqueuse par 2 volumes d’kthanol, ou par le cetavlon. Elle a identifib l’acide galactosamkuronique et il est connu que tous les antigenes de ce type sont de hauts polymhres d’acides hexosaminuroniques [38]. I1 est donc probable que le polysaccharide acide que nous obtenons est l’antigkne Vi; il est connu que cet antigbne prkcipite avec lee acides nucl6iques lors du fractionnement par l’ethanol.

COMPARAISON DES FRACTIONS POLY SACCHARIDIQUES (PS)

ET LIPOPOLYSACCRARIDIQUES (LPS)

Les deux preparations sont solubles dens l’eau. On les compare apr&s Blimination des acides nucl6i- ques: PS, et LPS, ou PS,t et LPSet.

Analyses de N et P Les t enem trouvdes sont semblables it celles

signalkes dans la litgratwe dans le cas d‘autres genres bacteriens.

Teneurs en O l 0

N P PSC 0 0’9-1’06 LPS, 0’29-0’33 1,M-1’18

Heymann et d. [39] trouvent par exemple 0,86 ti 1’1 Ol0 de phosphore.

Teneurs en sucres rdducteurs Exprimbes en glucose, aprBs dosage par l’anthrone.

Elles pr6sentent de l6gBres variations d’un extrait B l’autre. Un glucosane extrait par l’eau froide et bio- logiquement inactif a 6tB signal6 dans les Brucella [40] et il est possible gue ce constituant soit entrain6 au cows de nos extractions, en proportions variables. En moyenne, on obtient 50 B 60°/, de glucose dans LPSc et 40 h, 50°/, dans PSc.

Sucres neutres Les chromatogrammes sur papier des hydrolysats

de PS, et PSet d’une part, LPS, et LPSet d‘autre part, presentent de grandes analogies. On peut faire les remarques suivantes (les valeum de R G ~ ~ Btant relatives au solvant D) :

a) le compose de R ~ l c 1,15 (arabinose) n’existe que dans LPS, ou LPSet; il est beaucoup plus visible apres une hydrolyse sulfurique ;

b) le constituant de RalC 1,70--1’80 (rhamnose) est toujours present dans PSc ou PSet, mais plus net aprhs une hydrolyse plus Bnergique. Dans LPS, ou et , sa pr6sence n’est pas constante selon les prkparations;

vo1.9, No.2, I989 C. LACAVE, J. ASSELINEAU, A. SERRE et J. Ronx 193

c) le constituant de R G ~ ~ 2,l (did6soxysucre) n’est pas toujours visible;

d) le compost5 le plus rapide (RclC = 2,8 B 2,9) se colore imm6diatement en jaune avec la panisidhe (avant chauffage) et la coloration s’atthue apr&s un chauffage trop long ou avec le temps.

Cinktique d’hydrolyse La comparaison des chromatogrammes correspon-

dant ti dit€&entes conditions d’hydrolyse con6rme la similitude de composition entre PSc ou PS,t et LPS, ou LPSet, ainsi qu’il ressort de la Fig.l (voir aussi Tableau 2).

Une hydrolyse mdnagke fait apparaitre sur les chromatogrammes une serie de constituents migrant moins vite que le glucose, mais plusieurs disparaissent

016 iv6s0.08 036053075 1 135 1.75

Conditions d’hydrolyse

RGIC

PS 0 0 0 0 HCI 4 N -4 h

LPS 0 0 0 0 0 0

PS 0 00 0 0 0 HCLGN-2h LPS 0 0 7 0 0 0 0

I I

PS 0 0 ; 0 0 0 0 0 HC12N-2h

LPS y p p j pop I 0 ? I l l I 1 I I I

I I I

I HCL 0.05N-30min I I I

I , a 0 2 0.32 0.63 0.88 13 175’ 21 ’ 2 8 RG* (solvant D)

0.11 a45 1

Fig. 1. Repbentation s&matique dea princiypaux conetituants apparaiasant au c a r s des hydrolysea d a m Pi3 et LPS. Les acidea nuclbiques et lee polysaccharidea acides ont Btk prbalablement BliminBs. 0 , constituents dont la presence n’est pas constants sur lea chromatogrammea (Role = 0,16 et 0,76). Les valeurs de &lc dans le solvant D representent: 0,02,0,08, et O,ll=oligosaccharides ( ?); 0,32=KDO; 0,45= disaccharide ( ? lactose); 0,53 = glucosamine; 0.63 = di- saccharide ( ? maltose); 0,88 = galectose; 1 = glucose + heptoses; 1.15 = arabinose; 1,75 = rhamnose; 2,l = 3,6-

did6soxghexose; 2,8 = sucre 4 rapide

Tableau 2. Rendemenb en de la prbipitation par l’ethml LPS, = extrait d‘un lot de bacillea cultivh B Montpellier. LPS, = extrait d‘un lot de bacillea cultivb B 1’Institut

MBrieux

Hexoses Rendement Concentration en6th8nOl ps LPS, ~ p s , d8nB LPS.

vol ‘1. ‘I. ‘1. ‘I . 1 0 80 40 4.2 2 9 495 16 66

3-5 78 8

5-10 3 3 5 40 66

10 0,5 4 4 66

par hydrolyse plus Bnergique; ce sont, soit des com- poses peu stables dBtruits par un acide plus concentre, soit des oligosaccharides qui se scindent ensuite en monosaccharides. En revanche, une hydrolyse plus forte fait apparaitre de nouveaux composbs decelables par la ninhydrine: les sucres amines. En conclusion, PSc ou PSet et LPSc ou LPSet ont un comportement similaire, sauf dans les hydrolyses mknagdes. Ceci pourrait s’expliquer, soit par la liberation d’oligo- saccharides difFt5rents si les enchainements des unites ne sont pas identiques dans les composes initiaux, soit parce que la partie lipidique de LPS g h e la libt5ration de certains sucres.

Fractionnement des prkparations PS, ou PS,t et LPS, ou LPS,t: phipitation par des concentrations

croissantes d’Lthano1 LPS et PS se comportent assez diE6remment en

ce qui concerne leur precipitation par l’alcool, une faible proportion d’alcool prbcipite une fraction plus importante de LPS que de PS (voir Tableau2), ce qui pourrait 6tre dfi B la modification de solubiliti: introduite par la partie lipidique. Nous avons observi: une repartition difF6rente des fractions obtenues selon gue les bacteries traitkes venaient de Montpellier (LPS,) ou de 1’Institut Mdrieux (LPS,). I1 s’agit de la meme souche M 15 de Brucella melitensis: lea conditions de culture et peut-btre les traitements prkliminaires subis par les bacilles sont responsables de ces divergences. La plupart des rhsultats concer- nant ces polysaccharides ont Bti: obtenus ti partir de

La composition en oses des diverses fractions est rdsumee dans le Tableau 3 ; on observe :

a) une complexite croissante des fractions quand la concentration en Bthanol augmente dans le cas de LPS: une seule tache est r8vi:li:e dans la premiere fraction, mais nous verrons ultbrieurement qu’elle correspond au glucose et aux heptoses dont les mi- grations sont identiques avec la plupart des solvants ;

LPS,.

Tableau 3. Composition des diffhentes fractions obtenuea (z parfir de LPS, et P8 par prbipitation par l’#hml

vol

1 + + 2 + + + + + + + + & 10 + + + + + +

LPS, 5

l e t 2 + + + + 5-10 + + + + + PS 3-5 et

Lipopolysaccharide de Br~cella melitemis European J. Biochem.

t b i O , 4 b b j o b Nurnko des fractions

Fig. 2. Elution d’une wlonne de DEAE-cellulose. Dosage t i

l’anthrone. (-), Elution d’une solution de PS, pic8 I-V; (- -), Bution d’une solution de LPS, pics I’-V’

I ”

400 450 500 Longueur d’onde (mp)

aliquotes it la sortie de la colonne sont faits par la methode B l’anthrone (absorbances A 585 et 620 mp). On obtient cinq fractions dans chaque cas; seules les teneurs respectives en sucres varient entre LPS et PS (le Eger decalage de la premikre fraction Bluee peut s’expliquer par la tr&s forte concentration des sucres dans PS, produisant un Btalement du pic).

Lea fractions correspondant A un pic sont groupees et analysees colorimetriquement par la mbthode de Dische. Les spectres d‘absorption respectifs des dif- ferentes fractions obtenues avec PS ou LPS sont trBs semblables, ce qui laisse supposer que leur composi- tion est voisine. L’examen de la Fig.3 retrapant les courbes d’absorption des diffbrentes fractions aprBs reaction de Dische, et des resultats a p p o d s par la chromatographie sur papier et sur couche mince des hydrolysats, permet de localiser : les d6soxysucres dans les fractions I et I1 (max. A 390 mp) (Fig.SA), les hexoses dans la fraction 111 (max. B 412-414mp), les heptoses dans les fractions I1 et surtout IV (Fig.3B)’ le sucre rapide edin dans la fraction V exclusivement (Fig. 3A). LeTableau 4 rbsume les con- clusions.

I1 faut remarquer l’absence de glucosamine dans LPS comme dans PS, ainsi que de l’arabinose et du

400 450 500 Longueur d’onde (mp)

Fig.3. 8pectre d’absorption aprka rkaction de Disch des fractions dudes BUT DEAE-cellulose. (A), Fractions I, 11, 111, V, aprb 3 min de rbaction; (B), fraction IV: IV(31, apr&s 3 min de rhaction, IV(lo), aprhs 10 min de reaction

b) peu de difF6rences qualitatives dans les diverses fractions de PS.

Nous n’avons pas effectue d’hydrolyses m6nagees libbrant les desoxysucres.

Chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose. On chromatographie directement les solutions aqueu- ses des deux prbparations : PSc etLPSc sans hydrolyse prbalable. La Fig. 2 montre l’aspect trks semblable des courbes d’blution. Les dosages sur des fractions

rhamnose. Cette observation serait en faveur de la presence de ces deux derniers sucres comme conta- minants des PS et LPS. De cet ensemble d’expkrien- ces, il ressort qu’il y a de grandes analogies au point de vue chimique entre les preparations PS et LPS: ce resultat est en accord avec leur identit6 immunolo- gique Btablie par la technique d‘immunodifFusion [33].

L’existence de PS extra-cellulaire chez les bac- tbries A gram nkgatif n’est pas exceptionnelle e t a

Vol.9. No.2, 1960 C. LACAVE, J. ASSELINEAU, A. SERRE et J. Ronx 195

Tableau 4. Composition en osea des fraetiona dluh d’une wlonne de DEAE-cellulose

Les fractions sont celles des Fig.3A et 3B - II) W e a

souvent B t k dbcrite : Homma et Suzuki [41] trouvent deux composbs dans le milieu de culture de Pseudo- monm aer uginosa ayant meme composition et memes propriktks que l’antighne de Boivin. Dans Escherichia coli, Marsh et Crutchley [42] parlent m6me d’une ((endotosine )) dans le surnageant des cultures, tandis que Corpe et Salton [43] decrivent des PS dont la coniposition en monosaccharides est identique a celle des LPS de la paroi. Dans Serratia marcescens enfin, Adams et Young [44] isolent trois polysaccha- rides du milieu de culture ayant des propriktks d‘endotoxine.

IDENTIFICATION DE QUELQUES CONSTITWANTS DE PS ET LPS

Fraction lipidique Seul le produit is016 par la methode au phenol

cont,ient une partie lipidique, liberable par hydrolyse du LPS,t par l’acide acetique 0,l N (voir ahydro- lyses))). La teneur en est trhs faible (environ l o / , par rapport B LPS,t) cornparbe & celle des LPS d’autres bacteries a gram nbgatif qui contiennent souvent de 30 a 50 de lipicles : le LPS de Salmonella minnesota par exemple en contient 500/, [45]; cependant Kasai et ul. [46] mentionnent 9 8, 170/ , de lipide A dans les LPS Qtudies et 0,020/, dans Pseudomonm fluorescem. Nous avons cependant adopt4 le terme de lipopoly- saccharide d’abord par analogie avec les autres poly- meres extraits par cette mkthode des parois des bac- tCries a gram nbgatif, ensuite par opposition au PS rigoureusement depourvu de lipide.

Cette fraction qui correspond au lipide A, se presente sous forme d’un compose insoluble dans Yether, mais soluble dans le chloroforme. Son chro- matogramme sur couche mince de silicagel G a le meme aspect que celui du lipide A de Kaaai[47] (blution par un melange chloroforme-methanol- eau (65 : 25 : 4, v/v/v). Aprks hydrolyse chlorhydrique du lipide A, on &pare une fraction soluble dans l’bther, constitube d’un melange d’acides gras qui sont methyl& par le diazomkthane. La chromato- graphie en phase gazeuse (sur colonne 8, loo/, SE 30

sur chromosorb W) du melange des esters mbthyliques deckle trois constituants essentiels : les acides palmi- tique, n-heptaditcanoique et stharique. Les acides en C,, e t C,, sont en quantites Bquivalentes et represen- tent chacun 115 environ de l’acide palmitique. Cette composition diffkre de celles decrites dans la littkra- ture par l’absence d’acide B-hydroxy-myristique, que nous n’avons pu dBceler dans nos prhparations.

Dans la fraction hydrosoluble du lipide A, nous avons m i s en evidence la glucosamine:

a) en chromatographie sur papier e t sur couche mince de cellulose avec les solvants A, B et F et en revblant par la p-anisidine, la ninhydrine et le rbactif d’Elson-Morgan, on obtient un sucre amini: de m6me comportement que la glucosamine tkmoin. En co- chromatographiant avec un Bchantillon de glucos- amine pure, on ne rBvkle qu’une seule tache;

b) aprks chromatographie preparative sur papier, on Clue la bande correspondant au Gmoin de glu- cosamine. L’Bluat est trait6 par la ninhydrine et chromatographie B nouveau sur papier avec les solvants A et D : il fournit une tache d’arabinose [30] ;

c) aprhs hydrolyse prolongbe de la fraction hydro- soluble e t examen de l’hydrolysat l’aide de l’auto- analyseur Technicon, on trouve la glucosamine, A c8t4 de trks faibles quantitks d‘acide glutamique, d’alanine et de lysine.

La glucosamine n’a pu 6tre mise en evidence dans le PS extracellulaire, ce qui montre que ce sucre n’existe que dans la part,ie lipidique de 1’ant.igitne. La prbsence du lipide A est la difkence essentielle que nous avons observee entre PS et LPS.

Les sucres Acide cCto-2 dhsoxy-3 octulosonique. Au cows des

dernibres annbes, divers dBrives acides (cbto-2 dbsoxy-3) de sucres ont 6th decouverts dans les batteries; un des plus repandus est l’acide cbto-2 dbsoxy-3 D-manno-octulosonique ou KDO [48].

Les faits experimentaux suivants permettent d’ktablir la presence de KDO dans PS et LPS de Brucella melitensis :

a) aprks hydrolyse mknagke, on chromatographie sur papier avec les solvants A, D et E et rbvitle par la methode #Anderson [23]. On peut. ainsi repher un acide &to-2 desoxy-3 aldonique ( R ~ l c = 0,32 dans le solvant D, voir Fig. 1) ;

b) aprks chromatographie prkparative sur papier e t elution des bandes appropriees, des reactions po- sitives sont obtenues avec la rkaction de Dische [26], la reaction d’Edward et Waldron [22] (sp6cifique des d6soxysucres) e t la reaction de Weissbach et Hur- witz [21] modi66e par Osborn [25] et Ashwell [28];

c) les hydrolysats ont 6th compares avec un hy- drolysat de LPS de E . coli prepare par nos soins (methode de Westphal) et avec une fraction isolee de Serratia marcescens par l’acide trichloracetique

European J. Blochem. 198 Lipopolysaccharide de Brutella melitemis

(aimablement fournie par le Docteur Nowotny). Ces deux preparations contiennent du KDO, qui montre, en chromatographie sur papier, le meme RF et les m6mes colorations que le constituant de Brucella;

d) nous avons pu comparer directement notre acide avec un temoin de KDO obtenu par saponifica- tion du penta-acbtyl &to-2 d6soxy-3 octulosonate de mbthyle [49]; la chromatographie sur papier e t sur couche mince de cellulose avec le solvant E montre I’identitk de ces deux acides.

Dans une note prdiminaire, Ellwood [60] a signale recemment l’existence de KDO dans les Pasteurelh et plus generalement dans toutes les Brucellacees.

Pentoses. Un seul pentose, l’arabinose, a B t B identifie par chromatographie sur papier avec d.86- rents systhmes de solvants (D et F) et divers modes de rbvblation, ainsi que par co-chromatographie avec un temoin.

Ce pentose (Fig. 1) existe seulement dans la frac- tion polysaccharidique de LPS : nous ne l’observons pas dans le PS extra-cellulaire. Rappelons qu’on ne le trouve plus dans les Bluats de la chromatographie de LPS sur DEAE-cellulose. Dubrovskaya [S] men- tionne le xylose comme pentose dans les souches R de Brucella melitensis exclusivement.

Hexoses. 11s constituent une fraction quantitative- ment importante des preparations, mais peuvent provenir en partie de fractions non antigdniques telles que le glucosane d6jB mentionne. Glucose et galactose ont 6th identS6s par co-chromatographie avec les temoins dans les solvants A, D et F. I1 faut noter que le glucose est d6jB libere (partiellement au moins) aprks 15min d’hydrolyse avec HC1 0,05N. Le galactose ( R ~ l c = 0,87) est en quantitk relative- ment peu importante. Nous n’avons pu mettre en 6vidence le mannose signale par Dubrovskaya [S] dans le LPS de Brucella melitensis.

Heptoses. Davies [51] a dhcrit les heptoses trouves dans les bacthries B gram negatif. Plus recemment, Bagdian et al. [31] ont identifie le L-glycbro D-manno- heptose chez Salmonella minnesota. S. ruiru, et Pro- teus mirabilis, ce dernier contenant en plus leD-glychro D-mannoheptose. Une publication rbcente [52] signale l’existence simultanee de ces deux stbrboisombres (D- et L-glycero D-mannoheptoses) dans toutes les batteries B gram nbgatif Btudihes, avec prbponderance en g6nera1, du L-glycbro D-mannoheptose. Dubrovs- kaya [8] et Parnas [lo] ont mentionnb l’existence d’heptoses dam les LPS de B. abortus et B. melitensis sans les identifier.

Au moins deux heptoses existent dans les extraits de Brucella melitensis; il est difficile d‘obtenir une bonne separation par chromatographie sur papier B cause des mobilit& semblables des aldoheptoses e t des aldohexoses et de la predominance quantitative des hexoses dans les polysaccharides bactbriens. La chromatographie sur papier (solvant D) et la reaction de Dische effectuhe sur les Bluets [26] (voir Fig.4)

mettent en evidence la presence des memes heptoses dans PSc et PSet, LPS, et LPSet de Brucella melitensis. Par oxydation periodique, nous n’avons pu identifier avec certitude le mannose forme [31], le glucose &ant en teneur trop importante dans nos extraits. Nous avons comparb nos hydrolysats avec ceux du LPS de Proteus mirabilis ; en eluant les bandes correspon- dant aux deux heptoses e t en chromatographiant 8, nouveau avec l’acbtone L 95 o/o (chromatographie ascendante), on peut &parer les constituants. I1 y a deux heptoses dans leu extraits de Brucella melitensis. dont le comportement est le meme que celui des L- et D-glyckro n-mannoheptoses qui existent dans les hydrolysats de Proteus. En outre, un temoin de D-glyc6ro L-mannoheptose ne donne qu’une seule tache, en chromatographiant sur papier avec le L-glyc6ro D-mannoheptose (qui eSt son enantiomhe).

Longueur d’onde(rnp)

Fig.4. Spectre d’absorptim des heptosea dans la rkaction de Dische. (I), avant cysthe (maximum a 390 mp); (11), aprbs cystkine (to); (111), aprhs cysthe (4,). I1 et I11 ont un

maximum A 605 mF

C m p h <( rapides b) Le rhamnose. I1 n’est pas toujours present dans

les hydrolysats de LPS, ou LPSet alors que c’est un constituant important du PS extra-cellulaire ; il devient davantage visible aprbs une hydrolyse plus energique (HC12 N pendant 6 h ou 4 N pendant 4 h, voir la Fig.l). Son identification B btb rbalisee par chromatographie SIX papier avec divers solvants et co-chromatographie avec le rhamnose. L‘Bluat d’un chromatogramme preparatif trait6 par la cystkine donne la rbaction caractbristique des mt?thyl-pentoses (Dische). Comme pour le pentose trouve dans LPS, il est possible que le rhamnose appartienne B une impuret4 polysaccharidique de notre prBparation de PS. En effet, lorsqu’on precipite par l’ethanol le PS extra-cellulaire, les solutions alcooliques surnageantes s’enrichissent en rhamnose.

Le composd de R ~ l c = 2, l (solvant 0). I1 est difficile A identifier car sa coloration est fugace avec la p-anisidine, les teneurs sont faibles et il n’est pas

Vol. 9. No. 2, I909 C. LACAVE, J. ASSELINEAU, A. SERRE et J. Roox 197

toujours decelable sur les chromatogrammes. Sa prBsence est plus constante dans LPS que dans PS, peut-%re parce qu’il y est plus abondant. Sa migra- tion trbs rapide fait penser & un did6soxysucre. La ritaction de Edward et Waldron [22] indiquant un 6-d6soxysucre est positive ainsi que la reaction de Ashwell [28], specifique des 3,6-did6soxysucres (oxy- dation periodique B 65” et acide thiobarbiturique). La comparaison avec des hydrolysats de poly- saccharides de Merentes Salmonella contenant le paratose, l’abbquose et le tyvelose montre qu’il peut s’agir de l’abbquose (3,6-did&soxy D-galactose) ou de son Bnantiomke, le colitose. En fait, nous ne pouvons lever l’indetermination entre abequose et colitose, les rotations specifiques sont respectivement de - 4 et +4”, et nous disposons de trop faibles quantites de materiel pour faire des mesures de rotation de notre compos6. Ces didesoxysucres sont des constituants immunodominants de beaucoup d’antigbnes poly- saccharidiques des EntbrobactbriacBes, dans lesquels ils occupent une position terminale, ce qui est en accord avec leur facile liberation par hydrolyse.

Le compost! le plus ra@ ( R ~ l c = 2’8). Son com- portement en chromatographie (solvant F), dam la reaction de Dische et aprbs reaction avec BCl, [53] font supposer qu’il s’agit d’un deriv6 methyle. Son RF superieur it celui du tetrambthyl 2,3,4,6-glucose et sa &action positive avec le rhactif de Edward et Waldron incitent B penser qu’il possbde m e (ou plusieurs) fonction(s) dbsoxy . Par demethylation par BCb, il fournit un d6riv6 qui se comporte en chro- matographie sur papier comme l’abbquose (ou le colitose) : il s’agirait alors d’un monombthylbther de l’abhquose (OU du colitose).

Ce sucre se colore immediatement en jaune avec la p-anisidine, mais disparait au COWS du chaaage; il est relativement fragile car avec des conditions d’hydrolyse permettant de deceler encore les hexoses, il disparait.

CONCLUSIONS

Parmi les constituants macromol6culaires de Brucella m,elitensis, nous avons pu mettre en evidence, & c6tB d’un polysaccharide de caractere acide con- tenant de l’acide galactosaminuronique et probable- ment assimilable & l’antighe Vi, une faction lipopoly- saccharidique et une fraction polysaccharidique extra-cellulaire. Nos resultats montrent que ces preparations ne sont pas homogbnes.

La partie polysaccharidique des fractions LPS et PS extra-cellulaire presentent de grandes analogies de composition qualitative, en particulier en ce qui concerne leur teneur en substances aussi specifiques que KDO, heptoses e t dhsoxysucre. De petites diver- gences apparaissent mais on ne peut affirmer qu’elles concernent les polymhes eux-m6mes : ainsi dans la fiaction LPS extraite par la technique de Westphal, on deckle de l’arabinose qui n’existe pas dans le PS 14 European J. Biochem.. Vol.0

extra-cellulaire dans lequel en revanche, se trouve le rhamnose. Ces sucres peuvent appartenir & des contaminants du type arabinoglucane (ou galactane), de m6me qu’une partie du glucose peut appartenir & des glucanes, dans la fraction LPS par exemple.

La difference essentielle entre les deux polymbres est la presence d’un lipide, trks faiblement representit dans LPS alors que PS en est totalement ditpourvu.

La partie lipidique du LPS posskde le type de constituants habituellement rencontres dans le lipide A : glucosamine, acide phosphorique et acides gas . I1 faut cependant noter l’absence d’acide p-hy- droxy-myristique (et de tout acide p-hydroxylB), ce qui repritsente une Ubrence essentielle par rapport aux lipides A de E. coli [54] ou de Salmonella [47] par exemple.

I1 a 6th envisage que des substances chimiquement difTitrentes soient responsables des multiples aspects de l’activith biologique des endotoxines des bactitries B gram negatif [II]. Suivant la mhthode utilisbe pour leur extraction et leur fractionnement, on obtient des preparations ayant des propribtes difftrentes notamment au point de vue toxicite. Les prbparations de LPS de BTUM~ZU melitensis qui font l’objet de ce travail, prbsentent effectivement une faible toxiciti: [65,33].

En conclusion, malgre des aspects specifiques particuliers de la pathologie de la brucellose [56], la nature des constituants 616mentaires des lipopoly- saccharide et polysaccharide extra-cellulaire de Brucella melitensis ne Mbre pas fondamentalement de celle des constituants correspondants trouves dans les autres bacMries L gram nbgatif, leur arrange- ment pourrait 6tre Meren t de celui trouvh dans les lipopolysaccharides des Entkrobactitries, puisque leurs propri8Ms biologiques bien Btudibes par Parnas [lo] et Redfearn [9] paraissent trbs bloignees de celles attribu6es dux endotoxines classiques.

Nous remercions vivement lee laboratoires Mbrieux (Institut MBrieux 69-Marcy I’fitoile) et plas particulikrement le Dr. L. Valette pour les envois de bacthries. Nous remer- cions Bgalement le Dr. K. Heyns (Universith de Hanibourg) pour I’Bchantillon d’acide glucomminuronique, le Dr. E. Heath (John Hopkins University, Baltimore, Etats Unis) pour un Bchantillon d’ester mbthylique du KDO penta- acktyl.6, le Dr. A. Nowotny (Temple University, Phila- delphie, Etata Unis) pour I’kchantillon de LPS de Serrutiu murcesoem, Madame Polonsky (Institut de Chimie des Sub- stances Naturelles, Gif-sur-Yvette) pour tin kchantillon d’as- carylose, Ie Dr. A. M. Staub (Institut Pasteur, Paris) pour les discussions concernant ce travail et des Bchantillons de polyosides de Salmonella, les Dw. 0. Luderitz et 0. West- pha1 (Max Planck-Institut fiir Immunbiologie-Freiburg) pour des Bchantillons d’heptoses et Ie LPS de Profeus mirabilis. Enfin, nous remercions le service de microanalyses de Gif-sur-Yvette pour les analyses de N et P.

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C. Lacave et J. Asselineau Laboratoire de Chimie Biologique de la Facult4 des Sciences 84 Grende Rue Saint Michel, F-31 Toulouse, France

A. Serre et J. Roux Laboratoire de Microbiologie de la Faculte de Medecine Institut de Biologie Boulevard Henri IV, F-34 Montpellier, France