282 Biology of the Cell 91 (1999) 281-282

Un processus d’auto-assemblage ordonne est impliqub dans la formation des granules de &&ion (trichocystes) de la paramkie VAYSSIE L, GARREAU DE LOUBRESSE N, et $PFRl ING I

Centre de GWtique Molticulaire. CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette, France

La paramecie &r&e de volumineux organites de defense, les trichocystes, qui sent caract&is& par une forme hautement contrainte en fuseau. L’analyse de mutants mend&ens de s&r&ion (Gautier, M. C., N. Garreau de Lwbresse, L. Madeddu, and L. Sperling. 1994. Evidence for defects in membrane traffic in Paramecium secretory mutants unable to produce functional storage granules. J Cell Biol124: 893-902) et de mutants c&s par extinction g6nique (Quiz, F., L. Vayssi4. C. Klotz, L. Sperling, and L. Madeddu. 1998. Homology-dependent gene silencing in Paramecium. Mel Biol Cell 9: 931-943) montre que la forme sauvage des trichocystes est n&cessaire au bon d&oukment du processus s&&ire. C’est son contenu proteique, d’organisation cristalline. qui confere sa forme au trichocyste. Ce contenu est compos6 d’une fa&lle de polypeptides immundoaiauemmt ap~arent4s, cod& oar une familie multie&iaue. L’analvse des Sequences~&t~iques d&&s de plusie& g=?nes clonCs au lab&at&e montre’que les polypeptides qui cristallisent partagent seulement -25% d’identitb de Sequence mais auraient tous u” m&ne repliement de la chaine pdypeptidique, prcbablement en u” faixeau de 4 h&es - aantiparall&les (Gautier, M. C., Sperling, L. and Madeddu, L. 1996. Cloning and sequence analysis of genes coding for paramecium secretory granule (trichocyst) proteins. A unique protein fold for a family of polypeptides with different primary structures. j Biol them 271: 10247-55). Afin de tester I’hypoth&e que ces polypeptides sent interchangeables darts la maille 6lCmentaire du cristal et que leur hWn&nW chimique permet la formation d’un gradient de cristallisation susceptible de rendre compte de la forme en fuseau d’un trichocyste, now awns p&par4 des anticorps polyclonaux dirig& contre trois polypeptides diff&ents. Pour ce faire, nous awns construit des genes SynWtiques optimis& pour I’expression dans E. cdi. Des experiences d’immundocalisation avec les anticorps obtenus martrent bien que les diff&nts polypeptides cristallisent de mani&e s4quentielle au cows de la biogen&e des trichocystes, et se trouvent darts des zones concentriqua d&tin&s dans la struch~re finale. Ces premiers r&ultats vent largement dans le sens de “ohe hypoth& de travail et sugg&mt que la famiUe multig&ique qui spedfie ces pr&ines a et.6 g&n&e et maintenue au cows de l’&olutian en r6po”se ?J des besoins fonxtionnels.

Donnbes Structurales sur la cellulose pa&tale des gambtophytes de Laminaria digit&a WI, H. Char&, N. H. Kim2, E. Ar Gall3 et B. Kloare$

I Centre de Recherches sur /es b4acromol&&s Wg&ales, CNRS, B.P. 53,38041 Grenoble Cedex 9, assocY d l’lJniversit~ Joseph Fourier de Grenoble. ’ Oeparlmant of Wood Science and Techndogy, College of Fore*, Kangwon National University, Chuncheon 2W701. Co&?. 3 Centre d’Etude d’Ockaf!&gie et da Eidogia Marine, CNRS. UMR 9042, Place Georges Tdssier, E.P. 74,2%82 Roscoff Cedex.

En we d’6tudier I’armature cellulosique pariCtale des cellules de gam&ophytes de Lmninarti digit&z, nous avons extrait les polysaccharides et les incrustants de oe5 cellulles, de face” B “e la&r que la trame cellulosique. Les celhdes ainsi extrai& smt en fait des “fanffinw” celhdaires ayant la forme des ceUules de depart, mais cmstitu&s uniquenwnt de cellulose. Une fois &d&s, ces cellules devie”“entdes objets minces et plats directement dxewables au miacecope &ctwnique 1 transmission

Dans le domaine ultrastruch~ral, la celhdcee desallules de gametophytes de 1. digit& sepr&ente SDUS forme d’un lads de micrc5ibrilles. ChaquemicrdibriUe est en fait II” ruban piat saris fin, ayant environ 30 b. 40 in de large et 5 “m d’+aiaeew. En utilisant des techniques de faisceau faible pour irradier ces objets, il est possible d’obtenir des cliches de diffraction &ctrmique du type ‘poudre” qui r&lent I’aspect aistallin de la cellulose. De faggr remarquable, dew des raies les plus inlenses (raies & 0.6 nm et 0.39 nm) du cliche thtique de cellulose mt totalement absentes des cliches exp&imentaux. Ced indique que les rubans de cellulose ant une orientation planaire axiale tr& marqu4e. Cette particularit estconfort4e par une etude aux rayons X effect&e avec desfaisceaux scit parall&les, suit perpendiculaires au plan des”fant6mes de cellule. Par contra&e de difiraction et diffr&~& des &ctronssur des coupes ; on peut de plus r&&ler que les domaines cristallins de la cellulose correspondent en fait a la taille lat&ale de microfibrilles de cellulose.

Cryo-microscopic 6lectronique de sections hydratbes- vitriibes : nouveaux dbveloppements et applications

l SARTORI” Nathalie, LEFORESTlER Blie DUBOCHET” Jacques

‘Laboratoire de Physique des Sofides. Bdt 510. universit6 Paris Sud, 91405 Orsay cedar, France. Zaboratofre di!nafyse UHraslructurale. Bdt de Biologie, IJnivarsW & Lausann@orlgny, 1015, Lausanne, Suisse.

La technique des cryocoupes d&rite depuis de nombreuses an&es (Dubnchet et al (1988) Q. R. Biophys. 21, 129~228)est rest& une technique tr&s marginale malgr6 son inter& evident pour I’analyse des cellules et tissus. Rappelons que cette technique consiste 1 vitrifier le spkimen & baese temperahue et & r&liser des causes fines en dessous de la temp&a&e de d&itrification.(< -13YC). Pratiquement, ces loupes sDnt obtenues sous atrnasph&e d’azote, B -160°C. d&x+es s”r une erille recowerte d’lrn film de carbone et &k&s dans l’azote avant d&e observ&s &ybasse temp&ature. Si de t&s belles images, avecune &solution inf6rieure & 2 nm, ont& obtenues par cette technique SW des syst&nes lipidiques (Ruiz T., Erk 1, Lepault J. (1994) Biology of the cell, 80, 203-210) o” des phases denses d’ADN (Richter K., Dubochet J. (1990) Pror. XJJth Intern. Congr.Elkectr. Micrmc.), il &ait juaqu’id difficile de les obtenir de maniere tr& reproductible, et en particulier sur des est&nes allulaires, plus complexes et moins hom&nes.Un certain nombre de difficult& oeuvent &re mentionn&s : lip la vitrifi&on des specimens massifs (ii) l’obtention de coupes fines, (iii) leur stabilitb xlus le faixesu d’&ctrons, (iv) la p&ence d’artefacts de “pe, en par&d& les crevasses qui perturbent I’observation des structures. Le premier point a &4 r&s& en grande partie depuis quelques an”& par l’utilisation de l’appareil de congClation haute pression (Moor H (lm In Cryotcchniqus in biol+aJ eJectron micmopy, pp 175-191) et du cryoblock refroidi a I’ helium (Escaig J. (1982, J.Microsc. 126, 221-229) et “OUS n’y reviendrcms pas plus en d&ail. Nous pr&senterons differentes am4liorations en aval de la cryofixatian des spkimens la r6alisation des uyocoupes en abncsph&e contrBl& (temp&ature de 20 a 23’C, 27 h 3096 d’humidit6). l’utilisation d’un ionisateur a flux variable (Static lin,Huag) une meilleure adh&iar des coupes sur le support de carbone. L’ensemble de ces am6liorations permet d’obtenir de man&e treS reproductible des coupes fines de 50 “I” d’+aissew, en nombre suffwnt pour que ce “e soit plus u” facteur limitant. De plus, I’am&oration de la stabilit6 des cryocoupes sons lefaisceau dWectron rend possible I’enregistrement d’images aux grandissements utilisCs dassiquement en cryomicroscopie (X 45 C0J) et de Series focaks on de paires st&o. NOUS pr&enhms dew exempies qui illustrent I’&zentail des possibilit4s actuelles de cette appmche! les spermatczoides hurnains et les phases d- de nucl6ownes. Dans le premier CBS, cette methode a permis la compr4hension de l’organisation tridimensionnelle de la chromatine (N. Sartori et al, en pr$xxation). Dans le dewd&ne cas, les images obtenues ontete d&em&antes pour comprendre a la fois la structure des phases et la nature des interactions entre particules. Now souhaitons attirer l’attention des biologistes et physidens des polym&res et systernes complexes sur le renoweau d&&t que devrait susdter les cryocwpes.

Characterization of the secondary walls of flax flbers: an immunogold labeling study Christine AndBmeOnzighi, lsabelle His, Mati Vicrk, Claudine Morvan and

l Azeddine Drw&

ESACNRS 6037. UniversU de Rouen, 76 821 Mont Sabrt Aignan, Cede% France.

The major event in the differentiation of flax (Linum usitatissimum) fibers is the elaboration of a verv thick secondarv cell wall. Thii wall is oellulcse-rich: but it also contains significant ‘amounk of othei matrix, non-aUulosic polymers SC& as pectins. We have used immunocytochemical techniques with antibodies specific for various epitopes associated either with pectins or arabiiogalactan-proteins (AGPs) to invest&&e the diitribution of these polvnwrs within the walls cd differentiating young fibers & 1 and 2week-old plants.‘O& results show that different epito~&hib~ distinct distribution oatterns withii fiber walls. Unesterified oectins recoenized bv PGA/RGI anlibod~e; and rham”ogalachxcnan-II (RGII) rec&nizad by anti-RGII: borate CMnplex antibodies arelocalized all over the secondary wall of fibers. PGA/RGI epitopes, bit not RGIIepitopes, are also present abundantly in the middle lamellae and cell iunctions. I” marked contrast, b-(1’@) aafactans recoanized bv the LM5 mcncclanal antibody and AGP epitopes d by anti-Gal4 ;nd W*anlibodies are primarily located in the half part of the secondary wall nearest the plasma membrane. LMZ epitopes, present in l-week-old fibers, seem to disappear later in development, suggesting a regulation of the expression of certain AGP epitopes. I” addition, localizaticm of cellulose with the cellobiohydrolase I-gold probe reveals different subdomains within the secondary walls of young fibers. These findings indicate that, in addition to cellulose, early-developing flax fibers synthesize and secrete different pectin and AGP molecules that contribute to their functional properties

3e Colloque SFp, Paris-Sud’99 kole Polytechnique, Palaiseau, 28 juin-2 juillet 1999