EXTRACTION DE L'ADNMatriel biologique : le thymus de veau Afin de conserver l'intgrit de la structure de l'ADN, on utilise des solutions tampons et toutes les oprations se droulent au froid, en disposant les rcipients dans de la glace pile et en sortant les ractifs au dernier moment du rfrigrateur ou du conglateur. Comment librer la chromatine des structures cellulaires qui la contiennent ?

Destruction des structures tissulaires Emietter finement, l'aide d'un scalpel, sur une lame de verre, 0.5 g de thymus de veau. Placer les fragments obtenus dans un tube contenant 2 ml de tampon TE. Agiter pendant 5 min. 2Destruction des membranes cellulaires On utilise un dtergent, le SDS. Ajouter dans le tube 0.5 ml de SDS. Achever le broyage avec l'extrmit d'un agitateur jusqu' ce que le contenu du tube devienne visqueux. Agiter pendant 5 min.

Droulement du chromosome bactrien aprs clatement de la cellule (M.E.B.)

Comment purifier slectivement l'ADN contenu dans la chromatine ?Isolement des protines auxquelles l'ADN est associ Ajouter 2 ml d'un mlange chloroforme + alcool isoamylique. Agiter 5 min. puis centifuger 15 ' 3000 tr/min. Rcuprer le surnageant la pipette dans un tube propre. Prcipitation slective de l'ADN Verser doucement 2.5 ml d'un mlange 5V thanol froid + 2V actate de sodium dans le tube contenant l'ADN. L'ADN prcipite alors sous forme de filaments blanchtres formant la mduse . On peut recueillir ensuite cet ADN en l'enroulant autour de l'extrmit d'une pipette fine et le mettre en solution dans 0.5 1 ml de tampon TE.

Digestion de restriction de lADNActivits lves : Comprendre l'action des enzymes de restriction Mettre au point un protocole de digestion enzymatique

Protocole exprimental :Pour digrer de lADN viral Pour digrer de lADN gnomique

Dans un tube eppendorf, pour 20 l de volume total final, dposer successivement la micropipette 15 l deau distille strile 2 l de solution dADN (environ 1 g) 2 l de tampon de digestion concentr 10 fois (10 % du volume final) 1 l denzyme basse concentration 5-10 uindex.html (5 10 units pour 1g dADN).

Dans un tube eppendorf, pour 50 l de volume total final, dposer successivement la micropipette 34 l deau distille strile 5 l de solution dADN (environ 10 g) 5 l de tampon de digestion concentr 10 fois (10 % du volume final) 5 l de spermidine 10 % 1 l denzyme haute concentration 40-75 u./l (5 10 units pour 1g dADN).

Aprs chaque dpt, mlanger doucement le contenu de leppendorf. Aprs dpt de lenzyme, mlanger puis centrifuger 30 pour liminer les bulles dair formes au cours du mlange.

Placer rapidement tous les eppendorfs sur un support flottant dans un bain marie : LADN viral est incub 60 min. 37C en prsence de l enzyme de restriction. LADN gnomique est incub 5 heures 37C en prsence de l enzyme de restriction.ADN : conservation au conglateur. Dconglation lente dans de la glace pile. Enzyme : conservation au conglateur. Pas de dconglation. Sortir les enzymes du conglateur au dernier moment. Elles auront t places dans de la glace et seront replaces au conglateur sitt les prlvements effectus.

Le rsultat de la digestion est conserv au conglateur pour un dpt ultrieur. Pour un dpt immdiat, placer les tubes de digestion au rfrigrateur.

Comprendre laction des enzymes de restrictionEn 1962 taient dcouvertes les premires enzymes de restriction. Il sagit dendonuclases, dorigine bactrienne, qui coupent la molcule dADN au niveau de sites spcifiques, les sites de restriction, dfinis par une squence nuclotidique particulire. Les fragments dADN double brin produits, ou fragments de restriction, ont ainsi une taille bien dfinie. On a depuis isol une centaine de ces enzymes.

Squences nuclotidiques reconnues par quelques nuclases de restriction courrantes.

Endonuclase assoc ttra-nuclotide dADN

1- A partir de ces quelques informations, discutez la notion de spcificit daction des enzymes. 2- Combien de fragments de restriction vont tre produits par une enzyme de restriction que lon fait agir sur un plasmide (molcule dADN circulaire) possdant 2 sites pour cette enzyme ? Sur lADN linaire dun phage possdant 4 sites pour cette enzyme ? 3- Quelle est la probabilit dapparition du site de restriction EcoR I, compos dune squence

de 6 bases GAATTC, sur une squence quelconque dADN ? 4- Le virus bactriophage lambda possde un ADN de 45 kb (pb : paire de base, 1 kb = 1000 pb). Combien peut-on statistiquement prvoir de sites de restriction sur cet ADN pour EcoR I ?

Rponses attendues 2- 2 et 5 3- 1 / (4)6 = 1 / 4096 4- environ 45000/4096 =10

Mettre au point un protocole de digestion enzymatique... afin de raliser une digestion de restriction de lADN de 45 kb du virus bactriophage lambda par lenzyme EcoRI. 1- Dterminer la quantit denzyme ncessaire la digestion totale dun ADN viral 1-1- En reprenant les calculs de la fiche prcdente, ou la rpartition des nuclotides sur la squence dADN est considre comme alatoire, combien de sites de restriction EcoR I doit on sattendre trouver sur lADN du phage lambda ? 1-1- Une unit (1 u.) denzyme est dfinie comme la quantit capable de dcouper 1 g dADN sur un site de restriction en 1 heure. Quelle quantit denzyme utiliser pour une digestion complte d1 g dADN de phage lambda par EcoR I en 1h? 2- Dterminer les conditions de la digestion enzymatique de restriction 2-1- Quels paramtres de lactivit enzymatique doivent tre pris en considration afin doptimiser la digestion enzymatique de lADN ? 2-2- On souhaite digrer 1 g dADN. La solution dADN est fournie une concentration de 0.5 g/l. 10 units denzymes sont ncessaires la digestion d1 g dADN. Lenzyme utilis a une concentration initiale de 10 units/l (basse concentration). Cette digestion se fait pH constant grace l addition dun tampon concentr 10 fois : le volume de tampon initial utilis doit donc correspondre 10% du volume total final du tube de digestion. Quels volumes doit-on dposer dans le tube de digestion pour obtenir un volume final de 20 l contenant 1g dADN digr ? Dans quel ordre doit se faire le dpt compte tenu du fait que lenzyme doit tre maintenu le plus longtemps possible -20C avant utilisation ?

Dpots ADN Enzyme Tampon Eau distille

Volume (l) Ordre de dpot

Volume total final

20

Rponses attendues 1-1- 10 u. 1-2- en 1 h. : 1 site / 1 g / 1 u. -> 10 sites / 1g / 10 u. 2-1- temprature (bain marie), pH (tampon), concentrations en enzyme et substrat. 2-2- dans lordre : complment 15 l deau distille, 2 l ADN, 2 l tampon, 1 l enzyme

Electrophorse de fragments de restrictionLlectrophorse de lADN est ralise dans un gel dagarose creus de puits o seront dposes les solutions dADN analyser. Le tampon est lgrement basique (pH 8.6), lADN sionise sur ses groupements phosphates et migre vers lanode. La rsistance du gel poreux au dplacement de lADN dans le champ lectrique est proportionnelle la taille des fragments dADN. Ils seront donc spars en fonction de leur taille, exprime en pdb (paires de base), les plus petits fragments migrant les plus rapidement. Afin de disposer dune rfrence de taille, on dpose dans un des puits du gel dlectrophorse, un marqueur, mlange de fragments de tailles connues, en gnral obtenu par digestion dun ADN parfaitement identifi par une enzyme de restriction.

Activits lves : Mettre au point un protocole d'lectrophorse Utiliser un marqueur de taille

Protocole exprimental : Prparation du tampon et du gel dlectrophorsePlacer le gel dans la cuve lectrophorse, les puits disposs ct cathode. Remplir la cuve avec le tampon TAE jusqu ce que le gel soit recouvert de quelques mm de tampon. Utiliser des gants pour toute manipulation du BET.

Prparation et dpt de lADNDensification de lADN en vue des dpts Lajout dune solution de charge permet de densifier un ADN qui va tre dpos dans des puits immergs dans le tampon. Charger 4 V dADN avec 1 V de solution de charge. Solution de charge : Bleu de bromophnol 0,003M + saccharose 1,5M dans tampon Tris EDTA.

Dpt de lADN Chaque dpt doit contenir environ 0.5 1 g dADN. Dposer lentement et bien verticalement 5 20 l dADN densifi la micropipette, dans chaque puits immerg sous le tampon.Quelques conseils : reprer lemplacement du puits, descendre doucement lextrmit de la micropipette dans le puits sous le tampon, remonter lentement tout en vidangeant son contenu. La solution de charge assure le maintien du dpt en immersion dans le tampon. Placer un fond noir sous la cuve pour faciliter le reprage des puits. Les petits puits (peigne dents troites) conviennent des dpts de 5 15 l, les gros puits (peigne dents larges) conviennent des dpts de 10 20 l

Electrophorse Mise sous tension Fermer la cuve. Brancher les cordons de la cuve lalimentation de manire ce que les dpts soient ct cathode. Appliquer une tension de 100 V correspondant environ 1 h. de migration. Les basses tensions (30 V) sont prfrables mais entrainent des migrations plus longues (12 24h). Migration Les colorants bleus de la solution de charge permettent la visualisation de la migration : le bleu de bromophnol migre la vitesse dun fragment dADN de 300 pb. le xylne cyanol migre la vitesse dun fragment dADN de 2 kpb. En fonction de la taille des fragments de restriction tudis, on reprera la migration par lavance dune des 2 taches bleues dans le gel. Couper lalimentation quand le colorant a parcouru la distance requise (environ 5 cm). Dbrancher le gnrateur de la cuve.Rvlation du profil lectrophortique Le BET fluorescent aux UV sest fix sur lADN (cette molcule sintercale entre les bases de la molcule dADN) et va permettre de visualiser les fragments de restriction dans le gel plac sur la table UV. Le gel peut tre conserv dans son tampon, lobscurit et au rfrigrateur, quelques jours. Sil reste des puits non employs, vous pouvez rutiliser un gel pour une nouvelle lectrophorse. Si les bandes ne sont plus trs visibles, on peut ajouter au tampon 20 l de BET puis agiter quelques minutes avant de les observer nouveau.

Interprtation des rsultats de l'lectrophorse

Dterminer la taille des fragments Activits lves Interprter le "smear" d'ADN gnomique Etablir une carte de restriction Etablir un diagnostic gntique

Dterminer la taille des fragments de restriction de lADN viralLe marqueur II, ADN de phage lambda digr par lenzyme Hind III, est utilis comme rfrence de taille : la taille de ses fragments de restriction est connue et son profil d'lectrophorse permet d'tablir une courbe Taille du fragment de restriction = f(distance parcourue au cours de la migration). Dterminer graphiquement, en rfrence cette courbe, les tailles des fragments de restriction de EcoR I (attention lchelle logarithmique de laxe de ordonnes).

HindIIITaille des fragments de restriction (pb) Distance du fragment au dpt (mm) 23100 10 9416 12.2 6557 13.3 4361 14.6 2322 16.8 2027 17.5

EcoRIDistance du fragment au dpt (mm) Taille des fragments de restriction (pb) 10,2 12,6 ? 13,7 ? 13,8 ? 14,1 ? 14,8 ?

?

Interprter le "smear" dADN gnomique1- Schmatiser les rsultats de llectrophorse des 3 tmoins Tmoin 1 : ADN viral non digr Tmoin 2 : Marqueur (ADN viral prdigr Hind III) Tmoin 3 : ADN gnomique prdigr EcoR I

2- Le gnme humain a une taille denviron 3 . 109 pb. Celle du virus utilis, un phage lambda, est de 45 kb. Quelle est la masse dADN contenue dan une cellule humaine et combien de cellules sont utilises pour lextraction d1 g dADN gnomique ? (masse molaire moyenne dun nuclotide : 330 g) 3- Quelle est la frquence statistique thorique du site de restriction EcoR I (GGATTC : 6 pb) sur lADN gnomique humain ? 4- En supposant que la digestion effectue sur lADN gnomique soit totale, pouvez vous expliquer la diffrence daspect entre les bandes nettes obtenues pour les fragments de restriction du marqueur et la tache diffuse (= Smear ) obtenue pour lADN gnomique digr ? 5- Comment obtenir un rsultat dlctrophorse qui permettrait une tude de restriction prcise dun gne humain ?

Rponses attendues

2- 3.10 pb -> 6. 10 nuclotides -> 330 g x (6.10 /6,02.10 ) moles de nuclotides = 3,3.10 12 g dADN -6 -12 7 1 g dADN gnomique -> 10 g / 3,3. 10 g/cellule = 3.10 cellules 3- probabilit de rencontre dun site de 6 nuclotides particuliers : 1/(4) = 1/ 4096 9 9 5 frquence dun tel site sur un ADN de 3. 10 pb : 3 . 10 / 4096 = 7,3. 106

9

9

9

23

-

4- Le smear est d au mombre de fragments de restriction obtenus, 730 000 sur quelques centimtres, que llectrophorse na pu sparer. 5- en nutilisant quun extrait du gnome humain, chromosome, fragment de chromosome, gne isol et clon ...

Etablir une carte de restrictionOn opre une digestion de restriction dun ADN plasmidique circulaire de 1.6 kb par 2 enzymes EcoR I et Pst I. Le profil lectrophortique obtenu est le suivant : 1- Dterminer la taille des fragments de restriction observs.

2- On appelle carte de restriction la position des sites de restriction dune enzyme sur la squence dADN digr. La carte de restriction EcoR I de lADN plasmidique est figure ci dessous. Construire une carte possible pour lenzyme Pst I.

3- A partir de la double digestion EcoR I + Pst I on a tabli la carte de restriction suivante. Pouvez vous la justifier laide des donnes du profil lectrophortique ? Quelle stratgie utiliser pour vrifier les hypothses mises lors de la construction dune telle carte ?

Rponses attendues1- EcoR I : 1000+600, Pst I : 800+600+200, EcoR I+Pst I : 500+300+200+100

3- * La bande 500 pb est plus paisse : on suppose quelle correspond plusieurs fragments dADN. * 1000 EcoRI = 500+500 PstI et 600 EcoRI = 300+200+100 PstI hypothse : Pst I coupe les fragments EcoR I 1000 en 2 x 500 et EcoR I 600 en 300+200+100. Dautres hypothses sont envisageables. Pour les valider il faudrait utiliser une 3 enzyme afin de confirmer la localisation des coupures (ou des sondes dhybridation afin de localiser exactement les sites de restriction).

Etablir un diagnostic gntique1- La famille dont larbre gnalogique est reproduit ci dessus prsente des cas de drpanocytose, une maladie affectant les globules rouges et lie la prsence dune hmoglobine anormale Hb S la place dune hmoglobine normale Hb A. II 2 et II 3 sont malades. Pouvez vous raliser une analyse des phnotypes prsents et en dduire les gnotypes des membres de cette famille. Quel est le gnotype de II 1 ?

2- La mutation S responsable de cette maladie est bien connue, elle affecte un acide amin de la chaine de bta globine, protine qui entre dans la constitution de lhmoglobine. Le tableau ci aprs prsente les squences de la portion mute :Hb A ... Pro Glu Glu ... Hb S ... Pro Val Glu ...

Allle A ... CCT GAG GAG ... Allle S ... CCT GTG GAG ...

On veut raliser une digestion de restriction du gne concern permettant dobtenir des fragments de restriction diffrents pour chacun des allles A et S. Choisir dans la liste denzymes de restriction propose, lenzyme qui convient lidentification des 2 allles.Enzyme EcoR I Hind III Mst II Hae III Bam I

Site de restriction G/AATTC A/AGCTT CT/GAGG GG/CC G/GATCC

3- Le profil dlectrophorse obtenu est schmatis ci-contre. Pouvez vous reprer les diffrences observables entre les profils de restriction des deux allles ?

4- On ralise la mme opration sur des extraits dADN, correspondant au gne de la bta globine, des 5 membres de la famille tudie. Une partie du profil dlectrophorse est visualis ci contre. Pouvez vous maintenant diagnostiquer le gnotype de II 1 ?

Quels ADN utiliser ?Les ADN gnomiques, tels que ceux que lon pourra extraire soi mme donnent, aprs digestion et lectrophorse, une tache ou smear , en rapport avec leur taille et leur complexit. Pour obtenir des rsultats plus lisibles et plus faciles exploiter, il est prfrable dutiliser de petits ADN tels que des ADN plasmidiques ou viraux. On utilise souvent un ADN viral de 45 kb, celui du phage lambda. Les marqueurs sont des ADN prdigrs par une enzyme de restriction dont les rsultats dlectrophorse sont connus et servent de rfrence. Dans le commerce on peut se procurer toutes sortes d'ADN et de ractifs: Liste de fournisseurs Le SAMS vous propose un kit ADN complet prt l'utilisation :

Composition dun

kitde lADN gnomique humain prdigr avec lenzyme EcoR I haute concentration prt au dpt, du marqueur II : ADN de phage Lambda digr par Hind III qui servira de rfrence,( taille des fragments de restriction obtenus : 23.13-9.41-6.56-4.36-2.32-2.02 kb )

de lADN de phage lambda (45 kb) digrer par lenzyme EcoR I basse concentration( taille des fragments de restriction obtenir : 21.22-7.42-5.8-5.6-4.88-3.53 kb )

Matriel ncessaire une lectrophorse sur gel de fragments d'ADN

Matriel spcifique (prt par le Sams)

Opration ADN

Cuve horizontale pour lectrophorse sur gel avec peignes Gnrateur Table UV Micropipettes volume variable 10-100 l et 0.5-10 l avec rack de cnes micropipette 10 et 100 l Microtubes Eppendorfs avec portoir flottant et portoir de table pour microtubes Autre matriel Bain marie 37 Centrifugeuse de table (5000 tr/min) Eprouvette gradue 100 ml, fiole jauge 1000 ml , bchers 250 ml et 100

Micro-onde ou dispositif de chauffage de l'agarose Prvoir aussi ... un thermomtre 10-100 C de la glace pile des poubelles de table pour cnes et eppendorfs usagers

La scuritGANTS OBLIGATOIRES POUR TOUTE MANIPULATION DU BET. En cas de contact du BET avec la peau, rincer la peau 10 min. sous un robinet d'eau froide. Les instruments et rcipients au contact du BET doivent tre rincs de la mme manire avant leur nettoyage. LA CUVE A ELECTROPHORESE DOIT ETRE DEBRANCHEE DE SON GENERATEUR EN DEHORS DE LOPERATION DE MIGRATION. LUTILISATION DE LA TABLE UV SE FAIT AVEC UN FILTRE UV.

L'environnement de laboratoireConservation des ractifsLA CONSERVATION DE LADN ET DES ENZYMES SE FAIT IMPERATIVEMENT A -20 C. Mettre lADN dcongeler lentement dans de la glace pile, en dbut de sance. Replacer les tubes conserver au conglateur -20C. Les enzymes ne doivent pas tre dcongeles ! Elles sont en solution dans du glycrol, ce qui permet de les pipetter basse temprature. Sortir les enzymes du conglateur au dernier moment. Elles auront t places dans de la glace pile et nen sortiront pas (un porte tube ou EpRack en polystyrne vous est fourni). Les remettre au conglateur sitt le prlvement effectu.

Manipulation de microquantitsLutilisation de la micropipette est indispensable. Les micropipettes sont des outils fragiles et onreux. Afin dassurer la plus grande longvit ce matriel, insister auprs des lves sur les consignes de leur bonne utilisation, effectuer une dmonstration dtaille et laisser les lves sentrainer blanc sur un petit volume deau avant de manipuler les ractifs. Afin dutiliser la totalit du contenu d'un microtube, le passer la centrifugeuse (30 secondes vitesse maxi) afin de rassembler son contenu dans le fond du tube.

Prparation du gel dlectrophorse

Prparation du Tampon TAE Diluer 50 fois les 20 ml de solution mre pour obtenir 1 l de tampon TAE. 100 ml seront utiliss la prparation du gel, le reste sera utilis au remplissage de la cuve lectrophorse. Ajouter, au dernier moment, 50 l de BET 1%, au litre de tampon obtenu. Le BET, fluorescent aux U.V., se fixe sur lADN. Il permettra la lecture du gel sur la table UV. Utiliser des gants pour toute manipulation du BET Moulage du gel Fondre 0,8g dagarose dans 100 ml de tampon TAE additionn de BET, au four micro-onde (2 3 min.) ou au bain marie bullition. Attendre la dissolution de lagarose : le gel devient translucide. Laisser refroidir jusqu 50-55 C. Couler les 100 ml de gel dans le plateau de moulage, dispos bien plat et quip de peignes. Ne jamais dposer de lagarose plus de 55 C dans le plateau de moulage (utiliser un thermomtre de contrle). Le peigne permet de marquer lempreinte des puits de dpt de lADN. Le gel ne doit pas atteindre le sommet des dents du peigne. Laisser le gel se solidifier 15 min. temprature ambiante puis 15 min. au rfrigrateur. Laisser reposer 1 h. Retirer alors dlicatement et bien verticalement les peignes. Placer le gel dans la cuve lectrophores, les puits disposs ct cathode. Remplir la cuve avec le tampon TAE jusqu ce que le gel soit recouvert de quelques mm de tampon.

Les solutions tamponsTampon TE Tris EDTA pour mise en solution et conservation de lADN

Pour 10 ml de solution mre diluer 50 fois :TRIS 606 mg EDTA 190 mg Ajuster le pH 7.5 avec HCl N/100 Complter 10 ml avec eau distille strile.

Tampon TAE Tris-Actate-EDTA pour lectrophorse dADN

Pour 100 ml de solution mre diluer 50 foisTRIS 24.2 g EDTA 370 mg Actate de sodium anhydre 8.2 g Ajuster le pH 8.2 avec de lacide actique pur Complter 100 ml avec de leau distille.

Ajouter au dernier momant 50 l de BET 1% 1 l de tampon TAE dilu.