ttistochemie 21, 123--128 (1970)

Histochemie des lipides complexes I I . L a r~ac t iv i t~ des p e r o x y d e s

GUIDO PALLADINI et GIULIANA LAURO

avec la collaboration de

GIORGIO VENTURINI

Institut d'Anatomie Compar6e (~G. B. Grassb), Universit6 de Rome (Direeteur: Prof. A. Stefanelli)

Requ le 3. Novembre 1969

Lipids Histochemistry II. Reactivity o/Peroxydes

Summary. The Authors demonstrate that the presence of insaturated fatty acids peroxydes is a cause of mistake in the determination of vic-glycols groups in the complexe lipids, because these Schiff-reactive compounds are no completely blocked by the treatments used for the discrimination of PAS-reactivity of vic-glycols groups.

The Authors suggest a specific technique for the discrimination of PAS and Schiff reac- tivity of peroxydes in the presence of vic-glycols and free aldehydes.

Rdsumd. Les Auteurs d6montrent que la pr6sence des peroxydes d6riv@s des acides gras insatur6s peut @tre une cause d'erreur dans la d6termination des groupes vic-glycols des lipides complexes, puisque ces compos6s Schiff-r6actifs sont peu alt6r6s par le traitement de blocage usit6 dans la discrimination de la PAS-r6activit6 des groupes vic-glycols.

Les Auteurs proposent une technique sp6cifique pour la discrimination de la r6activit6 PAS et Schiff des peroxydes vis-s des vic-glyeols et des ald6hydes libres.

Introduction

Les gras qui cont iennent des acides & chaine insatur@e pr6sentent , s ' ils sont trait@s d i rec tement avec le r6actif de Sehiff, une r6act ion pos i t ive : il s ' ag i t de la r6act ion (~pseudo-plasmale~, don t la s ignif icat ion a 6t6 ob jec t d ' u n 6tude tr6s 6 tendu apr6s les premi6res observat ions de Verne (1928) (voir Pearse, 1968; Lison, 1960, pour une revue 6tendue), e t qui au jou rd ' hu i a @t@ expliqu6e pa r la f o rma t ion de p rodui t s d ' a u t o x y d a t i o n des acides gras insatur6s (Naudet , 1959; Pearse , 1968). L ' a u t o x y d a t i o n p rodu i t a u p a r a v a n t des compos6s peroxydiques , en pa r t i e des h y d r o p e r o x y d e s

- - C H - - C H = C H - - I

OOII

(pr6dominants si l ' o x y d a t i o n se poursui te & basse temp6ra ture) , en par t ie des

p e r o x y d e s cycliques _ C H 2 _ C H _ C H _ C H 2 -

I O - - O

d o n t la fo rma t ion est favoris@e pa r les hau tes temp6ra tures . C 'est s r ioter que la vi tesse d ' a u t o x y d a t i o n n ' e s t pas propor t ionel le au degr6

d ' i n sa tu r a t i on , mais ~ la facili t6 de fo rma t ion des radicales l ibres; c 'es t ainsi que

124 G. Palladini et G. Lauro:

la vitesse d 'oxyda t ion des acides ol6ique et linol~ique n 'es t pas 1:2, mais l : ] 0 (Naudet, 1959).

Apr~s, il y a des r4actions secondaires ~ la charge des peroxydes, avec l 'appari- t ion aussi de fonctions nouvelles: alcools, c~tones, aldehydes. On a soulign6 la format ion des groupements PAS-r6actifs: hydroxyc~tones O H - - C H - - C O et vic- glycols (Naudet, 1959; Lison, 1960; Pearse, 1960, 1968).

E t a n t donn6 que les p6roxydes ne sont pas seulement des produits secondaircs dus s l ' oxydat ion des substances grasses s Fair ou dans le formol (Gomori, 1942; Smith et Dunkley, 1962) mais aussi des composants des l ipopigments (Pcarse, 1960) comme une 6tape du m6chanisme oxydatif qui abou t i t au p igment m~me, nous avons entrepris ce t ravai l dans le double bou t :

a) de d6terminer si la pr6sence des peroxydes peut fausser la signification des r6actions qui ut i l isent le rdactif de Schiff ;

b) de pouvoir discriminer la r6action pseudo-plasmale due aux ald6hydes et celle due aux peroxydes.

Mat6riel et M6thodes

On a pr6par6 des produits d'oxydation de l'acide ol6ique (AOO) par traitement s 70 ~ pour 26 heures en courante d'oxyggne et analoguement de l'acide linol6ique (ALO) (Fluka), mais celui-ci pour 1 heure seulement.

La formation d'ald6hydes et des peroxydes a 6t6 suivie dans le temps avec la r6action de Scarselli (pour les ald6hydes; cette r6ation est fond6e sur l'effet catalytique des ald6hydes vis-s de l'oxydation spontan6e de la p-ph6nyl6nediamine avec l'eau oxyg6n6e. Scarselli, 1956) et de Lea (pour les peroxydes; il s'agit de la liberation de iode s partir des iodures. Naudet, 1959) sur des spots (ml 0,01 sur papier Whatmann No 1) et l'on a arret6 l'oxydation

la plus grande concentration des peroxydes. Le num6ro de iode (N.I.) de l'acide ol6ique varie de 95 (temps 0) jusqu's 82 (26 heures), ce qui correspond ~ la saturation du 13% de l'acide ol6ique. La chromatographie sur couche mince (Eastman K301R, r6v61ateur esane: 6thanol : ac. ac6tique 70: 30:1) et sur papier (Whatmann No 1, esane: 6ther de p6trole 1 : 1) d6montre deux fractions peroxydasiques, dont la plus grande, s haut Rf, concentre aussi toute activit6 ald6hydique; une autre, plus petite, s Rf tr~s petit, est d6pourvue de r6activit6 ald6hydique. Le m61ange peroxydique ainsi obtenu a 6t6 utilis6 dans les spots-tests (ml 0,01, Whatmann No 1) ~ titre de module.

Pour les tests histochimiques on a utilis6 des coupes de 10~ au cryostat de gras brun de la glande dorsale du rat, fix6e au formol-calcium de Baker, abandonn6es s l'air pour 40 jours et oxyd6es au peridrol (Verne, 1928) pour 15 rain.

Les peroxydes ont 6t6 r6vel~s avec la NADI-r6action (Lison, I960) et aussi, pour les spots, avec le test de Lea au KI; les ald6hydes avec l~ r6action de Scarselli; les lipides au Sudan III en solution satur6e dans le m61ange de Herxheimer (6thanol : ae6tone :eau 70:100: 30) (Beccari Mazzi, 1966).

Pour l'halog6nation, la PAS-r6action et les techniques histophotom~triques, voir le travail pr6c6dent (Palladini et Lauro, 1970).

On a utilis6 des techniques de blocage h la 2,4 dinitroph6nylhydrazyne (DFI), s la m6thyl- ph6nylhydrazyne (MFI), s la Chloramine T (ChT) et ~ l'acide p6riodique (voir Tableau).

Les recherches photom6triques ont 6t6 faites s l'aide d'un spectrophotom~tre Beckmann DB-G avec recorder 10".

Tous les produits, dont on n'a pas indiqu6 la source, sont Merck Analytical Grade.

R~sultats

A. Apr6s avoir observ6 par des essais pr~liminairs que la r~action N A D I n ' e s t pas influenc~e par les ald6hydes ni la Scarselli par les peroxydes, on a a u p a r a v a n t essay~ la sensibilit6 in vitro des r6,actifs utilis~s dans cette recherche, exprim6e

La r6activit~ des peroxydes 125

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Fig. 1. Courbes d'extinction du produit de la r~action Schiff-eau oxyg6n~e et Schiff-p~roxydes de l'acide ol~ique (SP); du produit de la r6action Schiff-ald~hyde formique (SF); et du

m~lange Schiff-tampon phosphate pH 7, ce que r~g4n~re la fuchsine (F)

comme la plus petite concentration de la substance dissue dans le r~actif qui donne une couleur visible s l'oeil pour une couche de 0,8 cm sur un fond blanc:

R~actif Schiff: aldehyde formique 30,00 ppm eau oxyg6n~e 1000,00

Scarselli ald6hyde formique 0,10 NADI eau oxyg~n~e 100,00

C'est s dire que le r6actif de Schiff est sensible aux peroxydes et aux aldehydes mais 300 fois moins sensible que la Scarselli aux aldehydes et 10 fois moins sensible que la NADI aux peroxydes.

Les r~actifs des peroxydes sont moins sensibles que les r~actifs des aldehydes. B. L'effet des fixateurs sur la r~aetivit~ des peroxydes a ~t~ d~termin6 sur

spots d'acide ol~ique (AO) et du mSme acide oxyd~ (AOO), trait6s pour 4 jours ~ t.a. avec le formol 10%, le formol-ealcium de Baker et le fixateur de Elftman (Lison, 1960). Apr~s ringage, on a observ~ dans les spots fix6s au formol-calcium la formation d'ald6hydes et des peroxydes dans I'AO et une leur augmentation pas n~gligeable dans l'AOO; une d~composition compl6te des peroxydes avee preci- pitation de Cr, dans la fixation s l 'Elftman ; au contraire, le formol simple n'alt~re pas la teneur en aldehydes et peroxydes de l'AOO ni provoque leur formation dans l'AO.

C. En pr6sence des peroxydes d6rivSs des acides gras, le r6actif de Schiff tourne au rouge.

L'gtude des courbes d'extinction montre (Fig. l) qu'il s'agit de la syntgse d 'un produit color4, dont ia courbe diff~re de celle du produit de r6action avee les ald6hydes ; il n 'y a pas r~g~n~ration de fuchsine basique libre.

126 G. Pal ladin i et G. Lauro:

Tableau 1. Spots d'acide otgique et linoldique oxydd

Schiff Scar- NADI Sudan III selli

DFI satur~e HC1 N, 2 h, 4 ~ 0 - - 0 =4= MFI 5% HC1 N, 2 h, 4 ~ 0 ~= - - ... J2-Br 2 0 =4= - - H I 0 4 0,5 %, 5' :~ ~: :~ ... ChT 10%, 1 h, 37 ~ 0 - - - - ... FeSO 4 - - ~: 0 ~:

- - = moins color~ que le t~moin; 0 = extr~mement moins color~ que le t~moin; 4 = color6 comme le t~moin; . . . = r6action pas ex~cut~e.

Tableau 2. Coupes de gras brun du rat, oxyddes

Schiff Scar- NADI Sudan III selli

DFI satur~e HC1 N, 2 h, 4 ~ - - - - - - =~ J~_Br 2 - - :~ - - HIO 4 0,5%, 5' �9 . . . . . :~ FeSO 4 0 ~ 0 ...

D. Le t r a i t emen t des spots de A O 0 ou de ALO mont re (Tableau 1) que la

r6aetivi t6 des peroxydes v ien t s ~tre diminu6e, mais pas an6antie par la Chlora-

mine T, l 'halog6nat ion et les hydrazynes substi tu6es; tout-k-fa i t nulle Fact ion de

l 'acide p6riodique. Dans les coupes des gras, l 'effet des divers r6actifs sur la r6activit6 des peroxydes

est moindre ancore et unc plus grande quant i t6 des peroxydes 6chappe aux trai te-

ments (Tableau 1 et 2). E. Pour r6soudre le deuxibme point de notre recherche nous avons essay6

beaucoup de substances dont la r6activi t6 vis-s des peroxydes 6tait connue

(ac. oxalique, ipochlori te de Na, peroxydase h6moglobinique); le sulphat ferrose

seul c 'est montr6 capable de an6antir les peroxydes et cela sans interf6rence avec

les autres groupements , et sur spots et sur coupes (Tableau 1 et 2).

E n effet, la ddterminat ion de la r6activit6 PAS apr6s sulphat par histophoto-

m6trie (Palladini et Lauro, 1970) mont re l 'absence d 'ac t ion du sel snr les groupes

vic-glycols et aussi la rdaction avec le Schiff apr6s acide p6riodique suivi par le

sulphat, mont re la pr6servat ion des groupes ald6hydiques r6v616s par l ' oxydan t ,

les rappor ts entre D.O. du trai t6 et du t6moin 6tant dans les l imites de la r6pro-

ductibil i t6 PAS dans ce matdriel (Palladini et Lauro, 1970). La r6activit6 PAS et Scarselli, apr6s sulphat, sur coupes et sur spots ne var ie

pas. La pr6sence du Fe +++, form6 par oxyda t ion du Fe ++ du sulphat pourra i t g6ner

la r6activit6 des mucopolysaccharides acides; c 'est pour t an t s noter que les p6roxydes sont (sur spots et sur coupes) Alcian-n6gatifs.

F. Des recherches faites expr6s d6mont ren t que la meilleure t6chnique pour

l 'usage du FeSO 4 c 'est un t r a i t ement de 30 rain ~ t.a., par une solution fraiche 1%

La r6activit6 des peroxydes 127

en eau distill~e boufllie. Une plus grande conc6ntration et une plus grande dur~e d ' incubat ion peuvent ~tre utilis~es en des cas tr~s particuliers de grande concSn- trat ions cn peroxydes.

D i s c u s s i o n

L'~tude des effects des fixateurs, dSmontre que le formol-calcium probable- ment ~ cause de sa net tc alcalinit~, favorise (B) la formation des peroxydes (Lison, 1960) bien plus que le simple formol; c 'est unc r4marque qui peut ~tre impor tante dans les 6tudes sur ces composds. Les fixateurs bichromat6s sont 5videmment inutilisables s cause de leur action sur les doubles liaisons (Lison, 1960).

Un point vient d 'e tre bien ~tabli dans nos recherches, c 'est ~ dire la d$mon- s trat ion quc les pcroxydcs ~chappent en condition d 'emploi histochimique, l 'act ion de l 'acide p~riodique et, en patt ie au moins, des autres substances employees dans les m~thodes de blocage pour l '~tude des lipides complexes (D, w 1), bien qu ' cn condition biochimiquc, in vitro, les peroxydes aycn t une r~activit~ tr~s marquee vis-a-vis des halog~nes et de la Chloramine T (Piccini, 1901) et aussi des hydrazynes (Spica, 1925). L 'cffet encore moindre (D, w 2) sur les coupes de ces m~mes substances, en comparaison de l 'effet sur spots, est s reporter aux differentes conditions physico-ch~miques des gras dans les tissus (Adams, 1965). Cette faute de sensibilit~ peut conduire s des graves fautcs d ' intcrprdtat ion, car on cst amen~

interpreter les peroxydcs surve~us commc groupements vie-glycols; on pcut bien supposer que beaucoup de contradictions sur la PAS-rSactivit~ des liaisons dthyl6niques peuvent t rouver ainsi une explication (Lison, 1960; Adams, 1965).

Les peroxydes, comme d~jh observ5 par Lison (1960), colorent le rSactif de Schiff, mais non pour reformation de fuchsine basique (C, w 2); toute faute de localisation et d ' in terpr6tat ion n 'est pour tan t pas ~ craindre.

Nos recherches permet tent d '6vi tcr les erreurs de discrimination et aussi d'6tudier, grace au sulphat qui non seulement n'alt6re la r6activit6 des vie-glycols et des aldehydes pre6xistantes (E, w 2), mais qui ne t ransformc pas les peroxydcs ni en ald6hydes ni en groupes PAS-r6actifs (c6tones, vie-glycols) (E, w 3), avec le m~me r6actif de Schiff (ce qui est essentiel pour une d6termination quanti tat ive) et les peroxydes et les ald6hydes.

Nous croyons quc cela pcut 6tre d'utilit6, sur tout dans l '6tude de la formation des lipopigments.

B i b l i o g r a p h i e

Adams, C. W. M.: Neurohistochemistry. Amsterdam-London-New York: Elsevier 1965. Beccari, N., Mazzi, V.: Manuale di tecnica microscopica. Milano: Soc. ed. Libraria 1966. Gomori, G. : Histochemical reactions for lipids aldehydes and ketones. Proc. Soc. exp. Biol.

(N.Y.) 51, 133--134 (1942). Lison, L. : Histochemie et cytochemie animales. Paris: Gauthier-Villars 1960. Naudet, M. : Les aeides gras. In: Trait6 de Biochimie g6n6rale (Boulanger, P., et J. Polonovski,

eds.), T. 1/1, p. 235--268. Paris: Masson 1959. Palladini, G., Lauro, G. : Histochemie des lipides complexes. I ~ R6v61ation des groups vic-

glycols. Histochemie 21, 117--122 (1970). Pearse, A. G. E.: Histochemistry, theoretical and applied. London: J .A. Churchill 1960. - - Histochemistry, theoretical and applied. London: J. A. Churchill 1968. Piccini, A. : Acqua ossigenata. In: Nuova Enc. Chimica (I. Guareschi, ed.), T. 3, p. 261--271.

Torino: Utet 1901.

128 G. Palladini et G. Lauro: La r~activit~ des peroxydes

Scarselli, V. : Un metodo perossidasico nell'istochimica delle aldeidi. Riv. Istochem. 2, 95--99 (1956).

Smith, G. J., Dunkley, W. L. : Initiation of lipid peroxidation by a reduced metal ions. Arch. Biochem. 98, 46--48 (1962).

Spica, S.: Idrazine. In: Nuova Enc. Chimica (I. Guareschi, ed.), T. 7, p. 743--795. Torino: Utet 1925.

Verne, J. : D6monstration histochimique de la formation de corps ~ fonction ald6hydiques aux d6pens des enclaves graisseuses et lipidiques. C. R. Soc. Biol. (Paris) 99, 266--269 (1928).

Prof. G. Palladini Istituto Anatomia Comparata V. Borelli 50 1-00161 Roma, Italia