Identification phénotypique et moléculaire des bactéries appartenant au genre Nocardia

" " t i f i q Dossier sclen ue Les bact~ries ~ croissance lente ou difficile

Ar t ic le

IDENTIFICATION PHI NOTYPIQU E DES BACTI:RIES APPARTENANT AU GENRE NOCARDIA

ET MOLECULAIRE

Veronica Rodriguez-Nava a, Frederic Laurent b, Andr~e Couble a, Patrick Boiron a,*

R 6 s u m 6

Le nombre de patients atteints de nocardiose dans le monde est

en constante augmentation. En raison de la nature et de la gravit~

de cette infection, I'identification rapide et precise des Nocardia est capitale. Les techniques conventionnelles de diagnostic

(chimiotaxonomiques, biochimiques, physiologiques et morpho-

Iogiques) ne permettent plus qu'une approche diagnostique

pr~somptive. Des techniques mol6culaires d'identification des

Nocardia sont actuellement propos~es aux laboratoires de micro-

biologie pour d~tecter plus rapidement et identifier les diff~rentes

esp~ces de Nocardia. Apr~s le d~veloppement de techniques d'hybridation mol~culaire,

de ribotypage et de PCR-RFLP, les techniques de s~quen?age de

I'ARNr 16S sont maintenant les plus utilis~es pour I'identification

des Nocardia mais d~pendent de la soumission des s~quences

dans les bases de donn~es accessibles au public. Les bases de

donn6es RIDOM, MicroSeq et BIBI ont ~t6 d~velopp6es pour les

genres Mycobacterium et Nocardia. Cette derni(~re base de don-

n~es se pr~sente sous la forme d'un outil ergonomique puissant

d'aide ~ I'analyee des r~sultats et ~ la prise de d~cision pour I'iden-

tification bact~rienne. Cette base de donn~es est & la disposition

de la communaut~ scientifique internationale sur le Web

(http://pbil.univ-lyon 1 .fr/bibi).

N o c a r d i a - n o c a r d i o s e - d i a g n o s t i c m o l 6 c u l a i r e - ident i f ica-

t i o n - sli<luenr,.age.

a Groupe de recherche ~ Bact~ries pathog~nes opportunistes et environnement • Universit6 Lyon 1 et UMR CNRS 5557 Ecologie microbienne - Villeurbanne Institut des sciences pharrnaceutiques et biologiques - Lyon Observatoire franqais des nocardioses Laboratoire de mycologie Facult~ de pharmacie - Universit~ Claude-Bernard Lyon 1 8, av. Rockefeller 69373 Lyon cedex 08

b INSERM 0230 = Pathog~nie des staphylocoques - Facult~ de m~decine Laennec Rue Guillaume-Paradin 69372 Lyon cedex 08

• Correspondance boiron@univ-lyon I .fr

article r e ~ le 13 f6vrler, accept6 le 16 mars 2007.

© 2007 - Elsevier Masson SAS - Tous droits r~serv~s.

S u m m a r y : C o n v e n t i o n a l a n d m o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n o f

N o c a r d i a s p e c i e s

The number of patients suffering from nocardiosis is in constant increase in the world. Because of the nature and severity of this infection, the rapid and precise identification of Nocardia species is essential. Conventional techniques of diagnosis (chimiotaxono- mic, biochemical, physiological, and morphological) allow only a presumptive diagnostic approach. Molecular techniques of identification of Nocardia are currently proposed to microbiological labo- ratories to detect more quickly and to identify the various species of Nocardia.

After the development of techniques of molecular hybridization,

ribotypage and PCR - RFLP, 16S rRNA sequencing techniques are now used for the identification of Nocardia but depend on the tender of the sequences in the databases accessible to the public. Data bases RIDOM, MicroSeq and BIBI were developed for Mycobacterium and Nocardia genera. The BIBI database is a powerful and ergonomic tool that helps to analyse the results and the decision-making for bacterial identification. This database is freely accessible to the international scientific community on the

Web (http://pbil.univ-lyon 1.fr/bibi).

N o c a r d i a - n o c a r d i o s i s - m o l e c u l a r d i a g n o s i s - iden t i f i ca -

t i o n - s e q u e n c i n g .

1. Introduction

L es bact~ries du genre Nocardia sont ubiquistes dans I'environnement. Elles ont ~t~ isol~es du sol, de plantes ou de composts

mais aussi chez I'homme. Les infections qu'elles provoquent r~sultent g~n6ralement de I'inhalation des bact~ries ou de la contamination d'une plaie. Leur proliferation dans I'organisme est & I'origine d'une infection granulomateuse et suppurative, Iocalis~e ou diss6min6e : la nocardiose. Les infections & Nocardia ont Iongtemps ~t6 consid~r6es comme rares (150 & 250 nouveaux cas annuels dans les ann~es 1990) et ceci d'au- tant plus que le diagnostic des nocardioses, qu'il soit direct ou indi- rect immunologique, est Iongtemps rest6 hors de pott le d'un grand nombre de laboratoires. Depuis quelques ann6es, la situation subit de profonds changements. Le nombre de patients atteints de nocardiose dans le monde est en constante augmentation. Si une majorit6 des patients concern~s pr~sentent des facteurs de risque, g~n~ralement un terrain d'immunod~pression, il faut noter que 30 % des cas sont observ6s chez des sujets apparemment immunocomp~tents. En raison de la nature et de la gravit~ des infections dont elles sont

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Dossier scientifique Les bactdries ~ croissance lente ou difficile

responsables, ridentification rapide et precise de ces bacteries ainsi que revaluation de leur niveau de sensibilite aux antibiotiques est capitale [3, 18]. Des methodes substitutives aux techniques conventionnelles de diagnostic ont ete proposees aux laboratoires de microbiologie pour detecter plus rapidement et identifier les differentes especes de Nocardia rapportees, dont le nombre a triple ces dernieres annees et qui presentent des particularites epidemiologiques et patho- geniques differentes. Notre laboratoire, dans le cadre de I'Observatoire fran9ais des nocardioses, assure cette mission de recensement, d'analyse et de surveillance des cas de nocardiose sur le territoire national depuis de nombreuses annees.

2. Identification phenotypique

Uidentification des Nocardia et le diagnostic de la nocardiose constituent une difficulte dans les laboratoires de microbiologie non sp~- cialises. Les techniques classiques d'identification (chimiotaxonomiques, biochimiques, physiologiques et morphologiques) ont et6 developpdes il y a environ trente ans. Aujourd'hui, elles completent seulement les techniques moleculaires d'identification des Nocardia, ou se limitent & une approche diagnostique presomptive.

2.1. Examen mic roscop ique

L'examen microscopique constitue un critere toujours important pour orienter ridentification. En effet, la presence de filaments ramifies & coloration de Gram positive qui se fragmentent en elements bacillaires ou coccoi"des et produisent (rarement) de courtes chafnes de spores permet de faire un diagnostic presomptif des nocardioses.

2.2. Cul ture

Generalement, les microorganismes appartenant au genre Nocardia peuvent etre cultives sur de nombreux milieux : geloses au sang, milieux de Bennett ou de Sabouraud, Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE), Lowenstein-/ensen, etc. Le temps de croissance des Nocardia peut etre long et impose un delai d'incubation important. Celui-ci, variable en fonction de I'espece et du milieu de culture utilise, est generalement superieur & 48 heures.

Le milieu de culture lactose au bromocresol pourpre (BOP), recemment teste au sein de notre laboratoire, permet d'obtenir une croissance en 24 heures de la plupart des especes appartenant au genre Nocardia et pourrait donc etre avantageusement ajoute aux autres milieux de culture afin de diagnostiquer plus rapidement une eventuelle nocardiose.

La morphologie macroscopique des colonies de Nocardia n'est pas caracteristique du genre et dependra notamment de I'espece, voire de la souche en cause. Neanmoins, un grand nombre d'especes se caracterise par une incrustation des colonies dans la gelose et par une odeur de terreau.

2.3. Caracteres phenotyp iques

Les mdthodes traditionnelles d'identification reposent sur la vitesse de croissance, la morphologie, la pigmentation des colonies et les pro- ills biochimiques. Ces derniers peuvent etre determines & raide de galeries miniaturisees pretes & I'emploi telles que les galeries API ZYM, qui ont ete employees avec succes pour I'identification des huit principales especes pathogenes de Nocardia [4].

Les methodes conventionnelles font appel aux caracteres d'identification classique, telles que les proprietes de decomposition des substrats (tyrosine, xanthine, acide urique, adenine, hypoxanthine, caseine, uree et testosterone), les capacites de croissance sur des

substrats carbones (citrate, acetamide, rhamnose, mannitol, sorbitol, etc.), les activites enzymatiques (arylsulfatase, catalase, acetamidase, galactosidase, urease, etc.) et les caracteres de sensibilite ou de resis- tance aux antibiotiques (ampicilline, carbenicilline, amoxicilline + acide clavulanique, cefamandole, kanamycine, etc.).

Les modifications constantes dans la taxonomie bacterienne sont un probl~me grandissant qui, souvent, rendent desuets les tests phenotypiques traditionnels utilises pour I'identification bacterienne. C'est le cas pour les Nocardia, dont les caracteres phenotypiques d'interet diagnostique ne permettent d'identifier que les especes les plus communement responsables d'infection mais echouent dans la mise en evidence de nouvelles especes.

Meme si ces methodes demeurent Iongues et peu discriminantes pour I'identification de la plupart des especes de Nocardia, elles peuvent constituer un apport complementaire pouvant se reveler utile au diagnostic. Toutefois, etant donne la grande variete des tests phenotypiques appliques aux Nocardia decrits dans la litterature, aucun choix precis n'a, & ce jour, fait I'objet d'un consensus.

2.4. Caracteres ch imio taxonomiques

Uanalyse des marqueurs chimiotaxonomiques tels que les acides gras, les acides mycoliques ou les menaquinones, qui repose sur le systeme de Lechevalier eta/. [19, 20] et Goodfellow et aL [12], permet essen- tiellement une identification au niveau du genre Nocarclia. De realisation laborieuse et d'un coot eleve, elle est limitee & des laboratoires spe- cialises.

3. Identification moleculaire

Uavenement des methodes d'identification moleculaire a permis le developpement de plusieurs techniques adaptees au genre Nocardia.

3.1. Hybridat ion molecula i re

L'hybridation moleculaire correspond & I'association spontanee, specifique et reversible, de deux molecules d'ADN monobrin selon le prin- cipe de complementarite des bases nucleiques. Cette technique permet de detecter une sequence d'ADN cible & I'aide d'un brin d'ADN de sequence complementaire appele sonde. Brownell et al. [5] ont developpe un systeme de sondes pour I'identification de N. asteroides

partir d'une banque genomique obtenue avec la souche GUH-2 clo- nee dans un vecteur Lambda EMBL3. Ces travaux n'ont jamais connu de veritable developpement et aucune autre technique de ce type n'a ete proposee depuis.

3.2. Ribotypage

Le ribotypage est une technique d'analyse du polymorphisme de I'ADN bacterien. Les fragments obtenus awes digestion par une enzyme de restriction sont separes par electrophorese, transferes sur une membrane de nylon puis hybrides avec une sonde nucleique mar- quee correspondant aux ARN ribosomiques (ARNr) 16S et 23S, pre- sents chez toutes les bacteries. Les fragments hybrides & la sonde sont visualises, generant une empreinte genetique sous forme de code-barres appelee ribotype. Un appareil automatisant ces etapes (Riboprinter ®) permet robtention de ribotypes en 8 heures au lieu de 5 jours. Cette technique a ete evaluee par Laurent et aL [16] au sein du genre Nocardia. L'etude comparative des profils de restriction de 21 souches appartenant au complexe IV. asteroides a confirme d'une part I'heterogeneite de cette espece et d'autre part le haut niveau de discrimination et de reproductibilite de la technique pour ridentification

5 0 Revue Francophone des Laboratoires, avri12007, N ° 391

Article Les bact6ries ~ croissance lente ou difficile

des isolats appartenant & ce complexe. Cependant, et malgr6 son caractere prometteur, le ribotypage n'a jamais vraiment eu d'application diagnostique en raison de sa mise en oeuvre Iongue et fasti- dieuse.

3.3. PCR-restr ic t ion f ragment length polymorphism ( P C R - R F L P )

Depuis la premiere application diagnostique de la PCR decrite il y a une quinzaine d'annees par Saiki eta/. [26], la PCR est devenue la technique d'amplification genique in vitro la plus utilisee dans ce but. Les techniques de polym6risation en chafne ont benefici6 du deve- Ioppement de nouvelles variet6s d'ADN polym6rase plus fiables, plus efficaces et plus resistantes & haute temperature. Ainsi, il est maintenant beaucoup plus facile d'amplifier un grand fragment pour en determiner la sequence.

Telenti et al. [31 ] ont d6veloppe une technique pour I'identification des mycobact6ries & partir de I'amplification et de la digestion (PCR-RFLP) d'un fragment de 1 330 pb du gene codant la prot6ine de choc ther- mique hsp65. Cette demarche a 6t6 utilis6e par Steingrube et a/. [28, 29] en utilisant un fragment plus court (440 pb) pour I'identification de plusieurs especes d'Actinomycetes d'interCt medical (figure 1). La methode 6tait basee sur le nombre de sites de restriction, leurs positions et la taille des fragments gen6res & partir du produit amplifie et diger6 par les enzymes BstEII, Mspl, Hinfl et BsaHI. Gr&ce aux pro- ills de restriction obtenus, un arbre decisionnel pour I'identification des Actinomycetes a 6te etabli.

Cette m6me technique a et6 reevaluee par notre laboratoire et appli- qu6e au nouveau contexte taxonomique de Nocardia (43 especes testees). Les resultats obtenus ont montre clairement son incapacite & differencier I'ensemble des especes de Nocardia connues & ce jour. En depit de son pouvoir discriminant devenu insuffisant, cette technique peut neanmoins etre utilis6e dans les laboratoires n'ayant pas acces & des sequenceurs ou & des techniques plus performantes. Malgre I'existence d'especes pr6sentant des profils de restriction identiques (figure 1), nous avons en effet montre que la PCR-RFLP pou- vait diff6rencier sans ambigu'ft6 des especes d'int6ret clinique, telle que N. farcinica, ou bien orienter I'identification si elle 6tait comple- tee par des tests phenotypiques appropries. Cette m6thode reste donc utilisable, faute de mieux , [25].

Avec le meme objectif que Steingrube eta/. [28, 29], Conville et al. [9] ont propose une technique de PCR-RFLP d'identification des Nocardia bas6e sur une partie du gene codant I'ARNr 16S. II s'agis- sait d'optimiser la vitesse et I'exactitude de I'identification, ainsi que de resoudre d'eventuelles ambigdl'tes obtenues par PCR-RFLP du gene hsp65. Cette technique doit probablement son manque d'essor & I'inflation taxonomique observ6e ces dernieres annees et au faible polymorphisme du gene codant I'ARNr 16S au sein du genre Nocardia. Laurent et aL [17] I'a utilisee afin de proposer une identification du genre Nocardia. La m6thode 6tait basee sur I'amplification d'un fragment de 600 pb correspondant & la region 3' du gene codant I'ARNr 16S, suivi d'une digestion enzymatique avec les enzymes MnA et Sact. Toutes les souches de Nocardia testees ont montr6 un site de restriction sp6cifique pour I'enzyme MnA, et aucun site de restriction pour I'enzyme Sact. Actuellement, cette technique est utilisee syst6mati- quement au sein de I'Observatoire fran?ais des nocardioses pour I'identification de genre des souches cliniques.

Si I'ensemble de ces travaux a represent6 une avancee importante dans le cadre de I'identification d'especes au sein du genre Nocardia, les techniques decrites sont aujourd'hui insuffisantes et de nouvelles approches diagnostiques doivent etre proposees [23, 25].

3.4. Sequenoage d 'ADN

Au cours des dernieres annees, le sequen?age & grande echelle s'est d6velopp& Les sequences d'ADN obtenues sont utilis6es comme des

signatures taxonomiques et permettent d'assigner un microorganisme & une espece particuliere ou & un groupe taxonomique.

3.4.1. M6thodes de s6quen(:age

Depuis sa description par Sanger, les m6thodes de sequen?age ont gagne en rapidite et en efficacit& Le developpement de marqueurs fluorescents a permis la lecture automatisee des gels de sequences. Des ADN polym6rases plus efficaces et diminuant le taux d'erreur ont 6t6 developp6es. Les s6quenceurs sont maintenant automatiques et robotis6s. IIs peuvent effectuer 96 sequences simultan6ment, et plus avec les appareils de derniere generation. Enfin, avec I'apparition de I'electrophorese par capillaire, le temps n6cessaire & la preparation d'une reaction de sequence a consi- derablement diminu& Ainsi, alors que les premiers s6quenceurs automatiques permettaient d'effectuer au plus deux series d'elec- trophoreses par jour, les derniers modeles peuvent effectuer jus- qu'& 24 series en 24 heures.

3.4.2. S~quen(:age de I'ARNr 16S

Le gene codant I'ARNr 16S est une molecule tres souvent utilisee dans le cadre de I'identification moleculaire des microorganismes. Ce gene comporte 50 regions diff6rentes ; dans le genre Mycobacterium, la partie la plus h6terogene se trouve en 5' entre les positions 130 et 500 pb du genome d'Escherichia coli.

Actuellement, I'analyse par s6quen?age partiel (500 pb) ou total (1 500 pb) de I'ARNr 16S reste la m6thode mol6culaire de reference pour I'identification de nombreux microorganismes. Uidentification par sequen?age devient un outil diagnostique de plus en plus important. Bien que le coot limite son utilisation dans certains laboratoires de biologie clinique, c'est une alternative utile pour I'identification des bacteries & croissance lente et pour lesquelles des techniques d'identification specialisees sont n6cessaires. Cependant, I'identification pr6- cise d'un microorganisme par sequen?age d6pendra de la soumission des sequences dans les bases de donn6es qui sont accessibles au public. En effet, une base de donnees de qualite contr616e est essen- tielle dans le cadre de I'identification de microorganismes.

L'utilisation du sequen?age comme technique d'identification des especes de Nocardia a ete etudi6e par plusieurs auteurs [7, 8, 9, 21, 22, 24]. L'analyse du gene entier a montre que I'etude des 500 pre- mieres paires de bases du gene en 5' 6tait suffisante pour I'identification au niveau de I'espece de la plupart des Actinomycetes d'inte- r6t medical. D'apres Stackebrandt et aL [27], il a ete bien etabli que Iorsqu'il existe moins de 97 % d'homologie entre les sequences de I'ARNr 16S de deux souches, celles-ci appartiennent & des especes diff6rentes. II est egalement possible d'utiliser cette technique pour 6valuer la diversit6 g6n6tique de souches bacteriennes au sein d'une meme espece.

Les travaux de Mellman et aL [21] portant sur un fragment de 500 pb en 5' du gene de I'ARNr 16S de 30 souches type d'especes de Nocardia, ont montre un polymorphisme inter-especes suffisant pour I'identification de I'ensemble des especes testees & I'exception de N. soft et de N. cummidelens. Des tests ph6notypiques ont ete pro- poses pour differencier clairement ces especes. Les sequences obtenues pour I'ensemble de ces souches type ont et6 utilisees pour construire une banque g6nomique propre aux Nocardia. Les identifications par s6quen?age de 91 souches cliniques identifiees & I'origine par des tests conventionnels ont ete comparees aux sequences de reference des souches type de la base de donnees. Les resultats ont suggere un indice de similarite de sequence > 99,12 % comme critere d'appartenance & une espece donn6e, avec une probabilite d'erreur statistique de 1 O/o de dissimilarit6 au niveau des sequences. En effet, les identifications par sequen?age d'un fragment de 500 pb du gene codant I'ARNr 16S de souches cliniques ont donne d'excellents resultats pour la plupart des isolats testes. Ces r6sultats ont et6 compares & d'autres bases genomiques afin de montrer le degr6

Revue Francophone des Laboratoires, avri1200'7, N ° 391 51

Dossier scientifique Les bac te r ies a c ro issance lente ou di f f ic i le

1~111TB12

Bs ~E{i

448

2 1 m

3 W

1~5,ui

2SS/11m

2$St11W70 211i1110 I

135/1110 211i1110

11~1'145-1311ZI-115

Hinfl Espece 315/125 t N. a s B t y p e I

2 m / 1 N 1 IV. ~ t y p e N

I N. vaccinii

440 l N. fluminea

I N. salmonlcida

N. p ~ m ~ ' a s m W

145r290.3N I N. sen/odme

255/1tl0

440

315/125

ll8-11Wl15 I 440

211Wlll'/O I 310/138

t3~11W75 J 448

N. flavorosea N. uniforrnis

N. a i l m ) i d u tyl)e l

N. brevicatena N. cyriaciqeorqici

N. abscessus N. paucivorans

N. vinacea M a B m ~ M ~ t y p = ~

4lSIml ' iOl~ Beam

270-11511mR8

N. pseudovaccinii

315kl35 I 448

I 7112W!4"=' I 448

I 13~12Wl15/711 I 2511W

Ider=tJficatioll avec Haelll, Acil, and Hhal

N. bel#nqensis

t¢ f~ch#¢=

N, BO~B N. sol~

N. veterana N. africana

N. cummidelens

I N, crassostreae

N. cerradoensis

N. ignoraCa

I Mycobac~erium sp.

N. bras#/wmb

N. o#lld/scavhtum

En noir, les ~ testees par Steingrube (1997) et en bleu souligne, les nouvelles ~ d~._~ites depuis cette date [Rodriguez- Nava et al. (2003)]. Les donnees chiffrC=es correspondent & la taJlle en padres de bases des fragments de restriction. La branche Mycobactenum est KJentcluee en violet.

5 2 Revue Francophone des Laboratoires, avri12007, N = 391

Dossier scientifique Les bacteries a croissance lente ou difficile

Art ic le

d'exactitude et de qualite de I'identification. Suivant le mCme objectif, Cloud et aL [8] se sont interesses aussi ~. I'identification d'especes de Nocardia d'interet medical par sequengage de ce meme fragment de 500 pb du gCne 16S mais le crit~re de similarit6 de sequences choisi 6tait de 99 0/o avec une probabilit6 d'erreur statistique de 3 % pour separer deux especes.

Neanmoins, selon nos travaux portant sur le sequen?age en 5' du gCne 16S de I'ensemble des souches type du genre Nocardia (soit les 43 especes decrites b. 1'6poque de nos travaux, et non plus 30 comme dans les travaux de Mellman), nous avons constate les limites du gene codant I'ARNr 16S en tant que marqueur genotypique pour I'identification de I'ensemble des esp¢ces. Par exemple, N. cummidelens et N. sofid'une part, et N. shimofusensis et N. higoensis, d'autre part, presentent des sequences identiques ; egalement, les sequences des especes IV. abscessus et N. asiatica ne presentent qu'un seul nucleo- tide de difference.

Clarridge et aL [6] indiquent clairement qu'il n'est pas possible de don- ner une similitude definie ou une valeur de dissimilitude pour definir I'esp¢ce par sequen?age de I'ARNr 16S, en partie parce que des valeurs differentes sont produites en analysant des bases de donnees separees et en utilisant des methodes differentes. Ces elements soulignent le besoin de bases de donnees de reference propres, corrigees et contr61ees.

Selon les travaux realises par ces auteurs, les tests phenotypiques sous-estiment la complexite du genre Nocardia : des souches differentes correspondant & des especes phenotypiquement identiques presentent des sequences de I'ARNr 16S differentes.

3.4.3. Sdquen~age du g~ne hsp65 Le g~ne hsp65 constituerait une cible interessante selon des etudes publiees concernant Mycobacterium [11 ]. Rodriguez Nava et aL [24] ont decrit une nouvelle technique moleculaire pour la differenciation et I'identification de 43 esp(~ces de reference du genre Nocarclia par amplification et sequen?age d'un fragment de 440 pb du g(~ne hsp65. L'inter~t du sequen?age de ce gene chez le genre Nocardia a ete eva- lu6 en le comparant & celui codant I'ARNr 16S. IIs ont calcule une matrice des distances evolutives afin d'evaluer le polymorphisme inter- especes de chaque cible genetique, et observe une variabilite inter- esp¢ces de I'ordre de 88 % & 100 0/0 de similarite de sequence avec 93,7 % en moyenne pour le gCne hsp65 et de 90,5 % & 100 o/o de similarite de sequence avec 94,8 % en moyenne pour le gene codant I'ARNr 16S. Ces resultats montrent I'interCt du SC~luengage de hsp65 ; sa capacite discriminante plus elevee permet de differencier des especes possedant une molecule d'ARNr 16S identique.

L'etude d'autres marqueurs genotypiques, comme les genes hsp65, rpoB, recA, sodet gyrB (utilises pour I'identification des mycobacte- ries), pourrait 6tre envisagee pour resoudre certains problemes de differenciation d'especes au sein du genre Nocardia.

4. Bases de donnees et outils bio-informatiques

4.1. Nature des banques d 'analyse genomique

Au cours des dix dernieres annees, les progres dans le domaine de la bio-informatique ont connu un essor extraordinaire. Uautomatisation des methodes de sequen?age a genere d'enorrnes quantites de donnees dent il faut tirer le maximum d'informations mais aussi contr61er leur qualite. Ce d¢veloppement a conduit a la construction de plusieurs banques internationales de sequences nucleotidiques ou proteiques. II existe actuellement trois banques generalistes principales, publiquement accessibles via I'internet : - EMBL (European Molecular Biology Laboratory) [1] : c r~e en 1980 & Heidelberg, elle est geree par I'"European Bioinformatic Institute" (EBI) ;

- GenBank [2] aux Etats-Unis : mise en place en 1979 au =Los Alamos National Laboratory" (LANL), elle est geree depuis 1992 par le "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) & Bethesda ;

- DDBJ (DNA Data Bank of Japan) [30] : cette banque a debute son activite en 1984. Elle est geree par le "National Institute of Genetics" (NIG), & Mishima.

4.2. Banques gen6ra l i s tes

Une banque generaliste integre les donnees de sequences nucleotidiques et proteiques de plusieurs domaines scientifiques. Les donn6es proviennent en quasi-totalite de soumissions directes effectuees par les auteurs via le reseau internet. Habituellement, les s~uences sont collectees dans les banques generalistes sous un format particulier, avant d'etre stockees et rendues publiques. Les trois principales banques genomiques (EMBL, GenBank et DDBJ) echangent quoti- diennement les sequences recueillies afin d'obtenir un ensemble de donnees complet et coherent pour constituer trois points d'entree une seule et meme banque mondiale. Leur contenu est donc identique & 99,9 %.

L'importance des banques generalistes ne cesse de croitre. La plupart des revues scientifiques de biologie moleculaire deman- dent systematiquement le numero d'accession fourni par ces banques genomiques de donnees Iorsqu'un auteur publie une sequence.

Si, de nos jours, les techniques de sequen?age sont bien maitrisees, les methodes utilisees dans les annees 1990 n'avaient pas toujours la capacit6 de fournir des sequences de bonne qualite. De plus, I'ab- sence de contrele de qualite Iors de la libre soumission des sc-~luences aux banques de donnees a inevitablement conduit & I'introduction de sequences comportant des erreurs : nucleotides manquants (gaps) ou non determinables ('N').

4.3. Banques spec ia l i s6es

Les banques specialis6es vont integrer des sequences et des donnees qui sont specifiques d'un domaine particulier. Plusieurs banques genomiques specialisees ont ere developpees ces demi~res annees, avec des syst~mes bioinformatiques performants pour I'identification des microorganismes. Dans le domaine des Actinomyc~tes, les bases de donnees RIDOM, MicroSeq et recemment BIBI, ont ete developpees pour les genres Mycobacterium et Nocardia.

4.3.1. MicroSeq (microbial identification system)

Le systeme MicroSeq est une base de donnees g~nomiques dove- Ioppee par la societe Perkin Elmer Applied Biosystems. II a 6t6 crY6 pour I'identification des champignons filamenteux, des levures et des eubact~ries. Deux kits sont commercialises pour I'identification des bacteries : le kit MicroSeq500 R (qui g~nere un fragment de 500 pb

I'extremit6 5'), le plus utilise, et le kit 16S ARNr (qui gen~re un fragment de 1 500 pb). MicroSeq contient tousles protocoles et reac- tifs necessaires ~ la realisation du sequen?age et & I'analyse des resultats.

La banque attachee ace syst~me dispose d'environ I 400 sequences provenant de differentes collections de souches bacteriennes, notamment de souches type, parmi lesquelles se trouvent 82 sequences nucleotidiques du gene codant I'ARNr 16S de 82 especes appartenant au genre Mycobacterium [13] et 28 sequences correspondant 28 especes de Nocardia [8].

Le systeme d'identification MicroSeq fonctionne de la fagon suivante : un isolat inconnu est identifie par sequen?age partiel du g~ne ARNr 16S en utilisant le kit MicroSeq et I'appartenance & une espece donnee est confirmee si une similarite de sequences _> 99 0/0

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Dossier scienfifique Les bact~ries ~ croissance lente ou difficile

est obtenue avec la sGquence d'une souche type de la banque MicroSeq. Cloud eta/. [8] ont test6 94 souches d'origine clinique appartenant au genre Nocardia. Les r~sultats d'identification obtenus par S~luenq, age ont ~t~ compar6s & d'autres ~tudes mol6culaires telles que I'analyse par restriction enzymatique du g~ne codant I'ARNr 16S ou du g6ne hsp65 et des m6thodes biochimiques ou de sensibilit6 aux antibiotiques. Le syst6me MicroSeq s'est r6v616 capable d'identifier correctement seulement six esp6ces pathog6nes pour I'homme (IV. brasiliensis, N. cyriacigeorgica, N. farcinica, N. nova, N. otitidiscaviarum et N. veterana). En revanche, N. abscessus et IV. asteroides type IV ne sont pas distinctement identifi6es. MicroSeq pr~sente I'inconv~nient d'etre un syst~me payant et ferm6, qui int6gre seulement les souches d'int~r~t m~dical. II est donc impossible d'identifier les esp~ces environnementales pour lesquelles une implication nouvelle en pathologie humaine est suspect6e.

4.3.2. RIDOM (ribosomal differentiation of medical microorganisms)

Le syst~me RIDOM a 6t~ d6velopp6 en 1999 par Harmsen et aL [15] pour fournir des services bioinformatiques d'identification par s~quen- ~age de microorganismes d'intGr~t m~dical. Le site du RIDOM est directement accessible sur le web (http://www.ridom.de). Le fonc- tionnement de I'interface intuitive HTML de RIDOM repose sur le programme FASTA, qui permet de comparer des s~quences volumineuses par une m6thode heuristique et sur le programme CLUSTAL W, utilis6 pour I'alignement des s~quences homologues. II s'agit d'une banque de s6quences de I'ARNr 16S provenant de plusieurs souches de collection d'int6r6t m6dical, appartenant b plusieurs genres, parmi lesquels les genres Mycobacterium (au total 199 s6quences de I'ARNr 16S et 84 s6quences d'espaceurs internes transcrits [ITS] [14]) et Nocardia (au total 30 s6quences

de souches type de I'ARNr 16S [21]). La procedure diagnostique de RIDOM consiste b. amplifier et s6quencer une partie du g~ne codant la petite sous-unit6 de I'ARNr 16S correspondant b la r~gion 5' d'un sp6cimen inconnu. Le diagnostic est li6 & ranalyse des recherches de similitude des s6quences de rutilisateur dans la banque. Le pourcentage de similitude des s6quences est calcul~ et dolt 6tre 99,12 % par rapport b. celui de la souche type pour qu'un nom d'esp6ce soit obtenu. Dans le cas ou une identification au niveau de I'esp~bce ne pourrait 6tre obtenue, le syst~me RIDOM propose rinformation n6cessaire pour la r~alisation d'une approche polyphasique (combinant des tests ph6notypiques, chimiotaxonomiques ou mol~culaires). Cette information est disponible b. partir de liens hypertextes directs sur I'internet.

Une 6tude a ~t~ r6alis~e pour ~valuer la qualit6 des r6sultats foumis par les deux bases de donn6es sp~cialis~es (RIDOM et MicroSeq 500) et par la base de donnL=es g6n6raliste GenBank. Les r6sultats de ces trois banques ont @t~ compan~ avec les identifications ph6notypique~ Cette ~tude ~tait r~.aJis~e par s6quenc,,age de 91 souches cliniques en utilisant les deux syst@mes RIDOM et MicroSeq s~par~ment. Une valeur de similarit6 de 99,12 % a ~t@ f'm6e comme critbre d'identification par ces auteurs. Les r~sultats obtenus par RIDOM ont montr6 que parmi les 91 isolats test~s, soixante cinq S~luences (71,4 %) donnent des concordances parfaites. Parall~lement, 11 isolats correspondant & 12,1% ont pr~sent~ des similarit~s de S~luence inf~rieure & 99,12 o/o. Par ailleurs le syst~me MicroSeq a montr~ des concordances parfaites sur uniquement 24 isolats (26,4 %). Enfin, les r6sultats du s~=~luenq.age de I'ensemble des isolats ont 6t~ compar6s b ceux de Genbank. Ces r6sultats donnent 100 % de similarit~ de s~.-~quence sur 54 isolats mais parmi ces isolats 38 d'entre eux ne sont pas exclusifs d'une seule esp~ce.

Uensemble des r6sultats sur la comparaison de ces trois syst,bmes donne ravantage au syst~me RIDOM. II faut cependant noter que le principal inconvenient du syst~me RIDOM concernant le genre Nocardia est le manque d'exhaustivit6 (seulement 30 esp~ces

BIBI: elo I.FO~AT~S BACTEmAL IDem~CAT~N

db-

1. R e ( h e , h e de s#quences similaires

2. Exlbraction des S~luences 3. Alignement des mbquer,~,~ 4. Calcul de hi phylog#nle

9

. . . . . . .

I Client (HTML) I

; i

Simplification de I'analyse des S~luence~ Automatlsa§on des dlffbrentes empes Impl,'~rnentation de programmes : BIBI

An~liorer la pridsion D~eloppement de banques de s/~quences adaptbes Oulil d'aide ;t la db(:ision

Remerciements au Pr J.-P. Flandrois.

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indexees) par rapport aux besoins du diagnostic m6dical et I'impossibilit6 d'acc~der actuellement sur le site Web aux donn~es concernant Nocardia. Afin de faciliter I'identification bact6rienne dans le domaine clinique, nous avons con?u le systbme bioinformatique d'identification bact~rienne BIBI.

4.3.3. BIBI (bioinformatic bacterial identification)

La banque g6nomique BIBI a ~t~ ddvelopp(~e au sein du Laboratoire du Pr Flandrois dans I'UMR de biom~trie et de biologie (~volutive, dans le cadre du travail de thbse de Gr6gory Devulder [10].

Elle utilise plusieurs outils bioinformatiques pour automatiser I'analyse des s6quences d'ADN. Deux types de banques sont d6riv~s de BIBI:

- les banques g6ndralistes : la banque principale est, Bacteria -, qui rassemble I'ensemble des s~quences bact6riennes provenant de GenBank ;

- les banques spdcialis(~es ou banques dites, propres ~. Elles contiennent cinq banques sp~cialis~es, correspondant aux gbnes codant I'ARNr 16S, hsp65, rpoB, sod et gyrB. BIBI est un outil ergonomique puissant, simple et gratuit d'aide & I'analyse des r6sultats et & la prise de d6cision pour I'identification bac- t~rienne, disponible sur le web (http://pbil.univ-lyonl .fr/bibi). C, ette base de donn~es comporte des s~quences v6rifi6es, de taille normalis6e et annot6es selon un systbme unique. Elle utilise plusieurs programmes de recherche de similitude tels que Blast et Clustal W, qui s'appliquent aux diff6rents sous-ensembles de s~quences extraits de Genbank. [.'analyse d'une s~quence inconnue s'effectue en quatre (~tapes, au

cours desquelles I'utilisateur garde la possibilit6 de v6rifier le bon d~rou- lement du processus [10] (figure 2). La premiere 6tape est la soumission de la s6quence inconnue qui est stock~e sur le serveur sui- vie de la recherche de s~quences semblables par le Iogiciel BLAST sur la base de donn6es choisie par I'utilisateur. Dans une deuxi~me ~tape, les r~sultats de BLAST sont filtrds par le programme BIBI puis ins6r6s dans un fichier FASTA. La s~quence test6e et les s6quences proches sont align~es avec Clustal W (troisi~me dtape), cr~ant alors trois fichiers diff6rents (quatri6me dtape) correspondant & :

1. I'alignement des s6quences,

2. I'arbre phylog6n6tique au format NEWlCK,

3. la matrice de distances.

Le r~sultat final est prdsentd sous la forme d'un tableau des distances phylog~n6tiques entre les s~quences soumises et les s6quences homologues pr6sentes dans la base de donn6es. BIBI comporte I'ensemble des sdquences partielles des g6nes codant I'ARNr 16S, hsp65, rpoB et sod des souches type des genres Nocardia et Mycobacterium. Le genre Mycobacterium int6gre 388 s6quences de 97 esp~ces et sous-esp~ces qui correspondent aux 4 gbnes ~tudi6s (16S, hsp65, rpoB et sod) [11]. Le genre Nocardia intbgre plus de 200 s~quences nucl6otidiques de 60 espbces correspondant aux m~mes g~nes 6tudi~s (donn~es per- sonnelles). Cette approche mol6culaire permet d'identifier avec pr6- cision les souches et de rdduire de mani~re significative les d61ais de r6alisation d'une identification de Nocardia. Les donndes de BIBI sont actualis6es au fur et & mesure de la description de nouvelles esp6ces.

Nous proposons un diagramme simplifid des mdthodes moldculaires et phdnotypiques pour le diagnostic d'une nocardiose (figure 3) qui peut s'int~grer aux schemas diagnostiques utilis~s dans les laboratoires de microbiologie.

I CULTURE BACTERIENNE

I Identification du genre

I PCR specifique ADNr 16S

)

Sequen?age

L~ OC1 : 5 ' -GCT TAA CAC ATG CAA GTC G-3" "B1

NOC2 : 5 ' -GAA TTC CAG TCT CCC CTG-3' TB 1: o d r i g u e z - N a v a et al. 2 0 0 5 e l l

-....,

M6thodes physiologiques

"°" I

¢- Decomposition de substrats 1 I= | - Auxanogramme

L Bolron etml. 1993

Identification de I'esp(~ce 1 I

$

hsp65 1 Sequengage "B l l : 5 ' - ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT- 3"

TB12 : 5 ' - CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT -3' ~,~elent et al, 2003

l Analyse phylogenetique

Typage ) moleculaire

i ¢ RAPAo

sod | Randomly amplified I Sequen?age / Polymorphic D N A /

:205 : 5 ' - ACG "I~C ACC ACA GCA AGC ACC A - 3"

l

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Les bact6ries a croissance lente ou diff ici le

Conclusion

L e nombre de souches de Nocardia isolees connaTt une augmentation constante depuis la derni~re decennie. Le d~velop-

pement des therapeutiques immunosuppressives, I'augmentation du nombre des patients transplantes ou pr~sentant une immunodepression peuvent expliquer ce ph6nom~ne. Le contexte clinique de survenue de ces infections impose une identification rapide au niveau du genre et de I'esp~ce afin de realiser les adaptations therapeutiques indispensables qui constituent un facteur crucial d'evolution pour les patients.

L' identif ication defini t ive de ces microorganismes au niveau du genre a Iongtemps fait appel & des methodes de chimiotaxonomie de haute technici te et reservees aux laboratoires de ref6rence. Uidentification d'espece, basee sur la recherche de caracteristiques phenotypiques, est rendue diff icile par la mult ipl ici te des tests r6alis~s et la Iongueur des temps de lecture. Les techniques moleculaires, notamment cel les uti l isant le s6quen~age d 'ADN et les outils bioinformatiques, permet tent de faci l i ter et de raccourcir consid~rablement les d61ais d' identi f icat ion au sein des laboratoires special ises.

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56 Revue Francophone des Laboratoires, avri12007, N ° 391

Documents

Identification phénotypique et moléculaire des bactéries appartenant au genre Nocardia