BIOCHIMIE, 1975, 57, 105-112.

]solement et composition d'une glycoprotdine de muqueuse gastrique d'agneau.

Robert HUGUET C2, Maryse SOL~a~ et Nicole REMY-HEINTZ. Laboratoire de Biochimie, Faculld de Pharmacie,

15, av. Ch. Flahault, 34060 Montpellier Cedex.

(8-4-1974).

Summary. - - A glycoprotein is isolated from lamb gastric mucosa. It is purified first by reduction with dithiothreitol and then by chromatography on CM-Sephadex followed by gelfiltration on S ephadex G-75.

Its homogeneity is investigated by disc electrophoresis, immunoelectrophoresis, analy- tical ultracentrifugation and identification of the carboxy- and amino-terminal amino acids.

This glycoprotein contains 56 p. cent carbohydrates, consisting of N-glycolylneuraminie acid, fucose, galactose, and hexosamines. Hexosamines and galactose are in equimolar ratio ; gal.actosamine and glucosamine in the ratio 1 :2 .

The amino acid composition shows that threonine, serine and proline account for half of the amino acid residues. The eysteine origin and function are discussed.

INTRODUCTION.

De par leur nature, les mucines gastro-intesti- nales posent des probl6mes par t icul iers pour leur f rac t ionnement , probl~mes dus h une viseosit6 61e- v6e, une adsorpt ion incons tante sur les r6sines et une apparenee de maeromol6cule p,lus ou moths polydispeTs6e. I1 en r6sulte que les r6su]tats dif- f6rent non seulement suivant la p rovenance de la mucine, mats aussi suivant le mode de puri f icat ion adopt6 par les auteurs.

Dans l '6tude des nmcines du tractus gastro- intest inal , trois types de pr6-trai tement sont en g6n6ral employ6s, seuls ou combin6s : la pr6cipi- tat ion par le chlorure de c6 ty lpyr id in ium, la pro- t6alyse et les agents d6naturants . La pr6cipi ta t ion par le chlorure de c6 ty lpyr id in ium (1-4) pr6sente l ' i nconv6n ien t d 'en t ra iner , avec les glycoprot6ines, des mucopolysacchar ides dont la s6paration ult6- r ieure n 'est ni aisle, ni faci lement contrMable. La prot6olyse, qne ce soit par la papa ine (1,5), la pep- sine (2), la pronase (6) ou la t ryps ine (4), devrait permet t re d'61iminer les glycoprot6ines d 'or igine plasmatique, plus sensibles A l 'ac t ion des pro- t6ases que celles du mucus, mats il est difficile d '6valuer l '6tendue de la d6gradation prot6ique subie par les glycoprot6ines du mucus. Les agents d6naturants , comme l 'ur6e 8M (7), ou d6polym6ri- sants, comme le mercapto6thanol (8) ou les su]- rites (9) ont l 'avantage de r6duire la viseosit6 du

© A qui toute correspondance doit ~tre adress~e.

mucus sans le di luer et de f ragmenter l 'agr6gat en unit6s plus petites dont la pur i f icat ion et l '6tude sont plus ais6es.

Nous avons employ6 cette derni~re technique de pur i f icat ion et nous avons d6termin6 la composi- t ion chimique de la glycoprot6ine isol6e h par t i r de muqueuse d61ipid6e de caillette d 'agneau.

MATERIEL ET M:ETHODES.

1. ISOLEMENT.

Les cail.lettes (*) sont pr61ev~es sur des agneaux ~g6s de trois ~ six semaines et imm6dia tement congel6es dans la neige carbonique. Elles sont s6ch~es sous vide et d6graiss6es par plusieurs ba ins d'6ther de p6trole. Elles sont alors fragmen- t6es et subissent une macera t ion en tampon citrate de pH 6,2 pendan t 24 h. La bouil l ie g6,1atineuse est centrifug6e et les surnageants lyophilis6s.

L 'extract ion s 'op6re par trois mac6rat ions suc- cessives dans l 'eau distill6e, avec une concentra- t ion de 5 g de lyophi l isat pour 100 m'l d 'eau dis- till6e. Apr~s centr i fugat ion, les surnageants sont dialys~s et d6barrass6s d 'une par t ie des contami- nants nucl6otidiques et prot~iques par deux chro- matographies sur Sephadex G-25 (4,4 × 100 cm). La premi6re 61ution est r6alis6e avec une solution de Na~G1 0,02 M e t d 'azide de sodium h 0,02 p. cent,

(*) Les caillettes d'agneau ont ~t~ fournies par le tauoratolrc Lyocentre que nous tenons a remercmr.

106 R. Huguet, M. Sol,re et N. Remy-Heintz.

la seconde avec de l ' eau distil6e. Les f rac t ions sont rep6r6es p a r mesure de l ' ab so rbanee 280 nm pour les pro t6 ines et p a r dosage au ph6- nol-sul fur ique [10] pou r les glucides. La f rac t ion eon tenan t des glucides et des pro t6 ines (Frac- t ion I) est lyophi l is6e.

250 nag de la F r a c t i o n I sont dissous dans 10 ml de d i th io thr6 i to l (DTT) 0,67 M e n t ampon Tr is 0,5 M-ur6e 8 M de pH 8.8. Le m61ange est laiss6 sous azote p e n d a n t 8 h h l 'obscur i t6 et ~ la temp6- ra ture de la pi6ce. La r6ac t ion est arr6t6e et les g ronpements th iol lib6r6s sont alkyl6s p a r l ' iodo- ae6 tamide ajont6e e inq fois en exc6s ; le p H e s t ajust6 ~ 8,3 avec de la soude 2 N e t l ' a lky la t ion se pour su i t p e n d a n t 1 h h l 'obscuri t6 . Le mi l ieu est acidifi6 avee de l ' ae ide ac6tique pu r jusqu'h pH 2,5. Les eompos6s pro t6 iques sont s6par6s des r6act i fs p a r eh roma tog raph i e sur Sephadex G-25 (3,8 X 50 cln) s tabi l i s6e avec de l ' ac ide acbt ique N, l'61uat pro t6 ique en mi l ieu ac6tique est concentr6 sous v ide et lyophi l is6 .

2. FRACTIONNEMENT.

Le f r ac t ionnemen t est effectu6 p a r chromato- g raph ie su r une colonne de CM-Sephadex C-25 (2,4 × 40 cm) avec un g rad ien t l in6ai re c ro issant d'ac6~ate de sodium, obtenu h p a r t i r de 500 ml de t ampon ac6tate de sod ium 0,4 M-ur6e 8 M de pH 7,5 dans le r6se rvo i r et 500 ml de t ampon ac6- tare de sodium 0,05 M-ur6e 8 M de pH 5 dans le r6c ip ien t m61angeur. La t r ac t i on g lycopro t6 ique s6par6e est d6min6ral is6e sur une colonne de Sephadex G-25 et concentr6e. Elle est d6barrass6e d 'un con taminan t pro t6 ique de faible po ids mol6- cu la i re p a r ch roma tog raph i c sur Sephadex G-75 (2,5 × 60 cm) 6quil ibr6e avec une solut ion de NaC1 0,15 M. Apr6s d6min6ra l i sa t ion sur Sepha- dex G-25 et concen t ra t ion , la f rac t ion g lycoprot6i - que isol6e est lyophi l is6e.

3. METHODES ANALYTIQUE,S.

Les pro t6 ines sont 6valu6es p a r la m6thode de L o w r y [11], l ' a lbumine bovine cr is tal l is6e (Sigma) se rvant d '6talon.

Les oses neutres to taux sont dos6s p a r la m6- thode h l ' o rc ino l - su l fu r ique [10] et le fucose p a r la m6thode de Dische et Shett les h la cyst6ine su l fur ique [10]. Le dosage des osamines est effec- tu6, apr6s h y d r o l y s c (HC1 4 N, 7 h h 100°C en ampoules scell6es), p a r la m6thode d 'Elson-Mor- gan [10]. Le taux de chaque osamine est d6ter- rain6 soit apr6s f r ac t i onnemen t sur co lonne de Dowex 50 × 8 selon la m6thode de Gardel l [12], soit p a r dosage dif f6rent ie l p a r la m6thode de

Ludowieg-Benmaman [13]. Les ac ides s ia l iques sont dos6s p a r la m6thode h la d iph6ny l a mine [10] ou p a r la in6thode de Jou rd i an [14] h la r6sorcine . L ' a c ide glycol ique est dos6 p a r la t echn ique de Klenk et Uh lenb ruck [15] avec le r6act i f d 'Eeg r iwe [16]. Les ac ides n ron iques sont r eche r - ch6s p a r la m6thode au carbazol -su l fur ique [10].

La compos i t ion en ac ides amin6s est d6termin6e l 'Au toana lyseur Technicon , apr6s h y d r o l y s e

(HC1 6 N, 105-110°C, 18, 21, 24 et 30 h) et Ies va leurs sont corr ig6es p a r ex t rapo la t ion au temps z6ro. Le t r y p t o p h a n e est dos6 p a r spec t rophoto- m6tr ie suivant Goodwin et Morton [17] et Edel- hoch [1.8] en t ampon c h lo rhyd ra t e de guan id ine 6 M-phosphate 0,03 M de p H 6,5.

Les g roupements thiol l ib res sont mesur6s p a r la t echn ique au p - h y d r o x y m e r c u r i b e n z o a t e [19] soit h pH 7, soit h pH 4,5. Les sulfates sont r echer - ch6s p a r la m6thode an rhod izona te , su ivant le p ro toeo le de Terho et Har t i a l a [201.

4. CHROMATOGBAPHIE DES GLUCIDES.

Les oses, les hexosamines et les ac ides s ia l iques sont ident i f i6s p a r c h roma tog ra ph i c sur p a p i e r W h a t m a n n ° 3. Les syst6mes-solvant uti l is6s sont : I : n -bu tanol -ac ide ac6t ique-eau (4:1:5) (v/v) et I I : n -bu tano l -py r id ine -eau (9:5:2) (v/v) pou r les oses ; l l I : n -bu tano l -pyr id ine -eau (6:4:3) (v/v) et I V : pyr id ine -ac6 ta te d '6 thy le -ac ide ac6tique-eau (5:5:3:1) (v/v) pou r les hexosamines ; V : ac6tate d '6 thyle-ac ide ac6l ique-eau (3:1:3) (v/v) pou r les ac ides sial iques. La r6v6lat ion des oses est effec- tu6e ~ l ' a ide des r6act ifs au n i t ra te d ' a rgen t ammo- n iaca l ou h l 'oxa]ate d 'an i l ine , celle des hexosa- mines avec le r6act i f h , l ' ac6ty lac6tone-p-dim6thyl - amino-benza ld6hyde et celle des ac ides s ia l iques avec le r6act i f de Svennerho lm et Svennerhohn [21].

Les hexosamines sont en outre caract6ris6es, d 'une par t , p a r t r ans fo rma t ion en pentoses au moyen d 'une d6samina t ion oxyda t ive h la n inhy- d r ine suivant le proc6d6 de Gardel l et coll. [21], d ' au t re pa r t apr6s N-r6ac6tylat ion suivant le p ro- c6d6 de Levvy et McAl'lan p a r 61ectrophor~se sur p a p i e r en t ampon borat6 de pH 10 [21] et r6v61a- t ion h l ' a ide d 'un r6ac t i f ~ l ' ac6ty]ac6tone-p-dim6- t hy l aminobenz ald6hyde.

5. ACIDES AMINES N- ET C-TERMINAUX.

La d6 te rmina t ion de l ' ac ide amin6 N- te rmina l est effectu6e p a r dansy la t ion suivant le p ro toco le de Gray [22]. Apr6s dansy la t ion et hyd ro Iyse (HC1 6 N, 105°C, 10 h), les ac ides amin6s dansyl6s sont ext ra i t s p a r de l 'ac6tate d '6 thyle satur6 d 'eau,

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.

Glycopro td ine de m u q u e u s e g a s t r i q u e d ' agneau . 10'7

puis p a r de la p y r i d i n e dilu6e au demi. Ils sont ident i f i6s dans chaque ex t ra i t p a r 61eetrophorbse h haut voltage & pH 1,9 (ac ide fo rndque-ac ide ac6- t ique-eau 5:15:80 (v/v) , 30,00 V, 1 h) et fi pH 4,4 (py r id ine -ac ide acOique-eau 1:2:25 (v/v) , 3200 V, 80 ran).

La d6 te rmina t ion de l ' ac ide amin6 C-terminal est r6alis6e pa r hyd ro ly se p a r la ca rboxypep t i - dase A [23] p e n d a n t 6 h. Les ac ides amin6s l ib6r6s sont caract6r is6s p a r c h r o m a t o g r a p h i e b id imen- s ionnel le sur couche mince de si l ice. Les solvants employ6s sont, dans la p r e m i e r e d imens ion : chlo- ro fo rme-m6thano l -ammoniaque h 17 p. cent (1:2:1)

d 'an t ig6ne m6lang6 h 0,5 ml d ' ad juvan t de F reund . Ces in jec t ions sont fai tes p e n d a n t t ro is semaines , suivies p a r une semaine de repos. Ce ry thme est pour su iv i 17 semaines , puis le s6rum est recue i l l i la d ix-hui t i~me semaine p a r ponc t ion card iaque .

8. ULTRACENTRIFUGATION.

Les mesures en u l t racen t r i fugeuse ana ly t ique sont effectu6es avec une solut ion de g lycopro t6 ine h 0,5 p. cent dans du t ampon phospha te 0,07 M de pH 7 0,15 M e n NaC1.

Le coefficient de diffusion est d6termin6 en cellule ¢ under f i l l ing >>, h la vitesse de 11.450 t /mn .

- - Prold/2~e - - - Hexose

0,9 ]] ] ~

0,75 _ 0,6 _ I o,4~ ~ ~'~, / ' ~ I

0,15

40O

_ 0,5

_ 0,4

_0,3

_0,:;'

_ 0 , 1

700 1000 t300 t600 1900 ml.

J~

F]6. 1. - - Chromatographie sur colonne de Sephadex G-25 (4,4 × 100 cm) de 40 ml d'extrait de muqueuse gastrique d'agneau.

.~ Elution par l 'eau distill~e. D~bit : 40 rot/ '~ heure. Fractions de 5 ml.

(v/v) ; darts la deuxi~me d imens ion : ph6nol-eau (75:25) (p /p) . La r6v61ation est faite pa r pulv6r i - sa t ion du r6act i f h l 'ac6tate de cadmium-n inhy - drine.

6. ELECTROlaHOR~SE.

Des 61eclrophor~ses en gel de p o l y a c r y l a m i d e sont effectu~es avec une teneur en a c r y l a m i d e de 6 p. cent. La mig ra t ion a l ieu soit en t ampon gly- cine 0,04 M-tris 0,005 M de pH 8,2 ; soit en t ampon glycine 0,037 M-acide ac~tique de pH 4, en appl i - quant 4 mA pa r tube p e n d a n t 25 ran. Les pro- t~ines sont r6v616es p a r le bleu de Coomassie. L a t echn ique h l ' a c ide pe r iod ique- r6ac t i f de Schiff, su ivant Zachar ius et coll. E243, est employ6e pour la r6v61ation des glycoprot~ines .

7. IMMUN OELECTROPHORI~SE.

Des immuno61ectrophor~ses en double d imen- s ion sont r6alis~es en agarose [251. La migra t ion est effectu6e en t ampon v6ronal de pH 8,5 p e n d a n t 3 h h 100 V dans la p r e m i e r e d imens ion et 25 h & 30 V dans la seconde. La co lora t ion est fai te au bleu de Coomassie.

Pour ob ten i r l ' an t i s4rum, des lap ins sont immu- nis6s p a r une in jec t ion h e b d o m a d a i r e de 2 mg

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A p a r t i r des cl ich6s obtenus, le coefficient de dif- fusion est calcul6 et le test de purer6, mis au po in t p a r Dieu el Oth [26~, est appliqu6.

Le coefficient de s6dimenta t ion est mesur6 en cel lule h un secteur h la vitesse de 54.400 t /mn .

RESULTATS.

1. FRACTIONNEMENT.

La c h r o m a t o g r a p h i e de l ' ex t ra i t sur Sepha- dex G-25 avec 61ution au NaC1 pe rme t de s6pare r les substances de po ids mol6cula i re ~lev6. La seconde, avec ~lution h l 'eau dist i l l6e (fig. 1) r6- pa r t i t les diff6rents compos6s su ivant ]eur conduc- t ivi t6 et leur solubi l i t6 [27, 28]. La f rac t ion glyco- pro t6 ique (I) soluble dans l ' eau pr6cdde une frac- t ion prot6ique adsorb6e sur le gel. Cette adsorp- t ion est r~vers ib le et les prot~ines (II) sor tent de la colonne en m~me temps que le f ront de NaC1. Un de rn i e r p i c cont ient des d~riv~s nucl6ot id iques ( l i d dont l 'affinit6 pour le Sephadex est 6levee [29].

On obt ient envi ron 100 mg de F r a c t i o n I pour 4 g de p o u d r e de muqueuse gast r ique d61ipidee, soit un r endemen t de 2,5 p. cent. Cette F r a c t i o n I

1'08 R . H u g u e t , M . S o l d r e e l N . R e m g - H e i n t z .

cont ient 27 p. cent de glucides. Elle n 'est pas ,fix6e sur 6changeur d ' ions CM-Sephadex, h pH 5-6 et 8. Sur DEAE-Sephadex, h pH 6,6 et 8, envi ron 30 p. cent des prot6ines sont fix6es, mais la corn-

soit 17,4, 6valu6 apr6s hydrolyse acide de la fract ion I h l ' au toanalyseur d 'acides amin6s.

Le f rac t ionnement sur CM-Sephadex (fig. 2) et sur Sephadex G-75 permet ten t d ' isoler une glyco-

q3

0,7_ ~ P r o / e m e

i 0,6 i

0,5 -~l . i i

0

I I I I I I I I I 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0,25 ,~ "4

0,20

o,t5 -~

O,tO

_ 0,05

i_0

100

Fro. 2. - - Chromatographie sur colonne de CM-Sephadex C-25 (2,4 X 40 em) de 100 mfl de Fraction I rdduite, dissoute dans 5 ml de tampon de ddpart (acdtate de sodium 0,05M et urde 8M) de pH 5. Etution par un gradient linSaire d'ac6tate de sodium. D~bit : 20 ml/ heure. Fractions de 3 ml.

posi t ion de la f ract ion re tenue reste voisine de celle de la fract ion n o n retenue ; aucune s6para- t ion en diff6rents const i tuants n'est done observ6e.

C'est pourquoi nous avons tent6 de f ragmenter la Frac t ion I par l 'ac t ion d 'un r6ducteur. Avant l 'ae t ion du DTT, aucun groupement thiol l ibre n ' a pu ~tre mis en 6viden,ce par le p -hydroxymercur i -

TABLEAU I.

R e n d e m e n t en f r a c t i o n g l g c o p r o t ~ i q u e , au c o u r s de la p u r i f i c a t i o n .

Poids l~tapes en mg

Fraction I 250 Apr~s r~duction 167

Eluat du CM-Sephadex I 92 Eluat du Sephadex G-75 52

P. c e n t _

10o 67 37 21

OsamineSen mg P'__cent

27,3_ 100

13--~3 / 4 9

Les re ndexrrents sont calculus par rapport au poids de Fraction I soumis h la purificatio.n.

benzoate, que ce soit h pH 7 ou h pH 4,6. Apr6s r6duct ion en pr6sence d 'urde 8 M, 17,8 mmoles de groupements thiol pour 1.0.0 g de Frac t ion I sont t i trables au p-chloromercur ibenzoate . Cette valeur est tr6s voisine du nombre de mmoles de cyst6ine,

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° l.

prot6ine dont nous avons v6rifi6 la puret6 et d6- termin6 la composit ion. Cette glycoprot6ine isol6e repr6sente le c inqui6me de la Frac t ion I en poids, soit 0;5 p. cent de poudre de muqueuse gastrique d61ipid6e. Elle cont ient la moiti6 des hexosamines pr6sentes clans la Frac t ion I (tableau I).

2. PURET~ DE LA PP~PARATION.

En gel de polyacrylamide, une seule bande est d6tect6e par le bleu de Coomassie ou par l 'aeide periodique-r6actff de Schiff. Par immuno61ectro- phor6se sur agarose (fig. 3), la m6me purer6 est observ6e : un seul arc de prec ip i ta t ion est visible.

L'6tude par u l t racent r i fugat ion (,fig. 4) r~v~le aussi un bon degr6 de pur i f icat ion. La valeur de la pente de log A/H = f (log t) est 6gale h 0,47 ; la valeur th6orique pour une substance pure est de 0,5 et elle s'616ve jusqu'A 1 en cas de polydis- persit6. Le coefficient de diffusion extrapol6 est 6gal /t 2,4.1.0 -7 et le coefficient de s6dimentat ion h 5,03 S. Le poids mol6culaire a 6t6 d6termin6 h par- tir de ces donn6es exp6rimentales et d 'un volume sp6cifique part iel caleul6 de 0,670,6 mug . I1 s'616ve h 160.000 ± 8.0,00.

Par dansylat ion, un seul aeide amin6 te rminal est caract6ris6 : l 'a lanine. La lysine est le seul aeide amin6 lib6r6 par la carboxypept idase A, apr6s 6 h d'hydro,lyse.

Glycoprotdine de muqueuse gastrique d'agneau. 109

3. COMPOSITION EItIMIQUE.

La composi t ion en acides amin6s (tableau II) de la glycoprot6ine pr6sente un enr ich issement im- por tant en thr6onine, en s6rine et en prol ine vis- fi-vis de la Frac t ion I. ces trois acides amin6s re- pr~sentent pros de la moiti6 de la quantit~ totale

des r6sidus d 'acides amin6s. La cyst6ine, caract6- ris6e dans la Frac t ion I, n 'est pas re t rouv6e dans la glycoprot6ine sous forme de S-carboxym6thyl- cyst6ine. Le taux de prot6ine 6valu6 par la m6- thode de Lowry (2,2 p. cent) est trbs inf6r ieur h celui obtenu par la somme des pourcentages des

Fro. 3. - - lmmunodlec trophor~se (2" dimen- sion) de la glycoprotdine isolde, en agarose pH 8,6. Coloration par le bleu de Coomassie.

TABLEAU I[.

C o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n e s de la F r a c t i o n I e t de la g l y c o p r o t ~ i n e isol~e.

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Cys Met Leu Ilc

Tyr Phe Lys His Arg Trp

Fractiou !

L g p. 100 g I mMp. 100 g

10,1 75,9 5,1 42,9 5,5 52,4 8,8 59,9 4,6 40 4,9 65,3 3,7 41,6 3,3 28,2 2,1 17,4

traces traces

R6sidus p. t00 r6sidus d'acides

amin6s

13 7,4 9

10,3 6,9

11,2 7,2 4,8 3

traces

gp . ~00g

2,7 7,1 4,4 3,7 4,9 2,6 2,1 2 0 0,5

1,7 1 5,6 5,7 5,3 2,4 0,6 3,5

13 7,6

30,9 34,5 36,3 15,5

3,4 17,2

2,2 1,3 5,3 5,9 6,2 2.7 0,6 3

1,4 1,1 0,6 0,6 0,7 0,9 0,8 0,4

Glycoproteine

mM p. 100 g

20,3 59,7 41,9 25,2 42,6 34,7 23,6 17,1 0 3,3

10,7 8,4 3,3 3,6 4,8 5,8 4,6 2

R6sidus p. t00 r6sidus d'aeides

amin6s

6,5 19,2 13,4 8,1

13,7 11,1

7,6 5,5 0 1 3,4 2,7 1,1 1,2 1,5 1,9 1,5 0,6

Moles d'acides amines p. mole de glycoprot~ine

32 96 67 40 68 56 38 27

0 5

17 13

5 6 8 9 7 3

Les valeurs ont 6tfi extrapoldes au temps z~ro, d'aprSs celles trouv6es apr6s 18, 2'1, 24 et 30 h d'hydro- lyse. Le tryptophane a 6t6 dosd par spectrophotom~trie (17, 18).

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 1.

110 R. Hugue t , M. So l , r e et N. R e m y - H e i n t z .

diff6rents acides amin6s (36,5 p. cent). Cette ano- malie a d6jh 6t6 signal6e dans d 'autres 6tudes de mucines [1, 3~ et peut Ore attribu6e aux trbs fai- bles teneurs en tyros ine et t ryptophane .

aussi 6t6 identif i6 par Kent [5] dans la muc ine du colon de mouton. La r eche rche des acides uroni- ques par la m6thode au carbazol-sulfur ique et celle des groupements sulfate par la m6thode au

Fin. 4. - - Profil de sddimentation en ultracentrifugation analytique. Vitesse : 54 40'0 t/mn. Photo prise apr~s 67 mn.

La glycoprot6ine isol6e cont ient 56,1 p. cent de glucides (tableau III). Le galactose est le seul hexose neutre pr6sent. Les hexosanfines sont re-

TABLEAU III.

Composition de la [raction I et de la glycoprotdine isoIde.

Constituants

Prot6ines

M6thode de Lowry Somme des acides

amines Hexoses Fucose

Osamines Ac. sialique (*)

Fraction l

~p.l~0g mM p. tOOg

L

72,5 - -

10,1 56 3,3 20

10,95 61 2,85 9

Glycoprot6ine

g mM Moles p. t00 pl00~ p. mole

22

36,5 311,6 497

23,4 130 208 6,4 39 62

25,5 t42,5 228 0,8 2,5 4

(*) Exprim~ en acide N-glycolyl-neuraminique.

pr6sent6es par la glucosamine et la galactosamine. Quant aux a, cides sialiques, seu] l 'acide N-glycolyl- neuramin ique a pu 6tre mis en 6 v i d e n c e ; il a

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rhodizona te sont rest6s n6gatifs, que ce soit dans la Frac t ion I ou dans la g lycoprot6ine isol6e.

Par compara i son avec la Frac t ion I, la glyco- prot6ine s'est enr ich ie en hexoses et en hexosa- mines clans les m6mes propor t ions . An contra i re , nous avons not6 une per te assez impor tan te d 'ac ide sial ique qui peut 6tre attribu6e, au moins en part ie , au f r ac t ionnement en mil ieu acide ac6- t ique N. Le fucose est aussi en p ropor t ion moindre darts la g lycoprot6ine i so l6e : le r appor t F u c / Hexoses est 6gal h 1 : 3,3 dans la glycoprot6ine et

1 : 2,8 clans la Frac t ion I. Le r appor t mola i re des hexoses vis-h-vis des hexosamines reste voi- sin de 1 ; e t celui des hexosamines , GalN/GlcN, s'~Ibve h 1 : 2,1.

DISCUSSION.

Une glycoprot~ine, homogbne en u l t racent r i fu- gation et en immuno-6.1ectrophor6se, a 6t6 isol6e aprbs act ion d 'un agent r6ducteur. Elle pr6sente les caract6r is t iques g6n6rales des mucines : une teneur 61ev6e en glucides ; une p r6dominance de thr6onine, de s6rine et de pro l ine ; l ' absence de cyst6ine et de mannose . Son originali t6 t ient dans le mode de f rac t ionncment utilis6, dans le contr61e pouss6 de sa puret6, dans son poids m(~16culaire re la t ivement bas et dans le r appor t mola i re de ses

Glycopro td ine de m u q u e u s e g a s t r i q u e d 'agneau . 111

consti tuants glueidiques G a l / F u c / G a l N / G l e N = 3:1:1:2.

La presence de quantit~s ~quimol~culaires de galactose et d 'hexosamines totales est une part i - cularit~ que l 'on re t rouve dans la presque totalit~ des nmcines gastriques ~tudi6es jusqu'it pr6sent, malgr~ des techniques de pur i f ica t ion diff~rentes et des origines v a r i 6 e s : muc ine gastr ique du Chien [1], du Pore [4, 30] ou de l 'Homme [2, 6, 31]. Au contrai re , dans le mi l ieu intest inal , les mucines paraissent conten i r moins de galactose que d 'hexosamines [3, 5, 8]. En outre, les valeurs du rappor t GlcN/GalN sont beaucoup plus var ia- bles : nous obtenons une p ropor t i on de 2:1 pour une muc ine p rovenan t d ' an imaux tr6s jeunes (trois semaines) . S,chrager et Pates [31] re t rou- vent la m~me valeur pour cer ta ines muqueuses gastr iques n6oplasiques, alors que pour les esto- macs normaux ils obt iennent une p ropor t ion de 3:1. La var ia t ion du rappor t des hexosamines ref lOerai t plut6t l 'activit~ m~tabolique que l 'ori- gine des 6chanti l lons examin6s.

Dans la composi t ion mola i re en acides amin6s, l ' ensemble thr6onine, s~rine et p ro l ine repr6sente 46,3 p. cent des acides amines totaux, et les acides amines d icarboxyl iques 14,6 p. cent. Snary et Allen [30.] ont eompar~ des f ract ions de muqueuse gastr ique de pore obtenues avec ou sans act ion de la pepsine. Dans le compos6 isol8 apr6s prot~o- lyse, la somme Thr, Ser et Pro s'61dve it 54 p. cent du total des acides amin6s et le contenu en acide aspar t ique plus acide glutamique, it 10 p. c e n t ; dans celui isol~ sans prot~olyse, les valeurs eor- respondantes at teignent 41 et 18 p. cent des acides aminds totaux. Nous re t rouvons done dans la gly- eoprot~ine isol6e les p ropor t ions en aeides amin6s d 'un compos6 muqueux obtenu sans prot6olyse.

I1 faut aussi r e m a r q u e r que la cyst6ine raise en 6vidence dans la F rac t ion I est absente dans la glycoprot~ine. Dans la p lupar t des ~tudes de Fact ion d 'agents r~ducteurs sur des produi t s de muqueuse, il est seulement observ6 que tes r6actifs de cl ivage des ponts disulfure d iminuent la visco- sit6 des mueines [6] ou les t ransforment en esp~ees mol~culaires plus petites, que ce soient avec les mucines gastriques [9, 32], ou avec celles des glandes sous-maxil la ires de po re ou de ch ien [33] ; m a n s dans ces 6tudes, les groupements thiol ne sont recherch6s ni avant, ni apr6s r6duct ion ; leur or igine mol6cula i rc n 'est pas pr6cis6e, de m6me que l '6tape it laquelle les l iaisons disulfure apparaissent . D'ai l leurs, une appar i t ion spontan6e, au contact de la s6cr6tion muqueuse, ne peut 6tre 61imin6e : ce ph6nom~ne a 6t6 observ6 in vitro

avee l 'h6moglobine [34]. Ces groupements thiol de la cyst6ine, mis en 6videnee ind i rec tement , pour ra i en t p roven i r de glycoprot6ines d 'or ig ine p lasmat ique ; ils pa r t i c ipe ra ien t it la fo rmat ion de l 'agr6gat macromol6eula i re , caract6r is t ique des mucines , m~eanisme d~iit sugg~r~ par d 'autres auteurs [2, 35]. Cependant , dans la format ion de ces agr~gats de mucus, d 'autres facteurs peuvent aussi in te rveni r , coinme des in terac t ions hydro- phobes dues h une p ropor t ion re la t ivement 6levee d 'acides amines apolaires [361 essent ie l lement Pro, Ala et Val. I1 reste it d~terminer l ' impor t ance re la t ive de ces diff6rents ~l~ments dans la forma- t ion et le main t ien de la cohesion des gels de mucine.

Nous remercions les l aboratoires de Physique indus- trielle pharmaceutique et d'Immunologie-Virologie de la Faculf6 de Pharmacie de Montpellier pour les mesures d'ultracentrifugation et pour la preparation de Fimmuns6rum.

R~suM~.

Une glycoprot6ine est isol~e apr~s action d'un agent r~ducteur sur un extrait de muqueuse gastrique d'agncau. S.a puret~ a ~t6 v~rifi~e par ~lectrophor~se en gel de polyacrylamide, immuno~lectrophor~se bidi- mensionnelle, ultracentrifugation analytique et recher- che des acides amines N- et C-terminaux.

Ses constituants glucidiques sont l'acide N-glycolyl- neuraminique, le fucose, le galactose, la galactosamine et la glucosamine. Le rapport molaire de la galac- tosamine et de la glucosamine est ~gal h 1 : 2 et celui des hexoses vis-h-vis des hexosamines h 1 : 1.

La composition en acides aminfis montre une forte proportion de thrdonine, s6rine et proline dont la somme repr4sente la moiti6 des r~sid, us totaux d'acides amines. La provenance et le r61e de la cyst~ine, iden- tifide apr6s r~duction de la routine mais absente dans la glycoprotdine isol~e, sont discutds.

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