L'agglutination des globules rouges

Revue Frangaise de Transfusion et Immuno-h6matologie Tome XXII. - - N 3. - - 1979 277

ENSEIGNEMENT POS T- UNI VER SI TA IR E

L'agglutination des globules rouges

par J.P. CARTRON et P. ROUGER

Groupe U 76 de I'LN.S.E.R.M. et Centre National de Transfusion Sanguine, PARIS_

ASPECTS IMMUNOLOGIQUES ET PHYS ICOCHIMIQUES

DE L 'AGGLUTINATION ERYTHROCYTAIRE

L 'AGGLUTINATION est un phdnom~ne complexe conduisant g la rdunion en amas de cellules telles que des globules rouges, des

bactdries et des virus.

a) L'AGGLUTINATION IMMUNOLOGIQUE.

Le phdnomhne peut 4tre schdmatiquement ddcompos6 en deux dtapes pr incipales dont l 'une correspond g la f ixation spdcifique des anticorps sur les ddterminants antigdniques, et l 'autre ~ la format ion d'agglutinats si les condit ions expdrimentales le permettent.

Comme une suspension d'hdmaties en solution NaC1 0.15M cons-

t itue un systhme stable, on peut se demander par l ' intermddiaire de quels facteurs, l ' introduct ion dans le systhme d'un anticorps sp6ci- f ique provoque la dispar i t ion de cette stabil it6 et conduit ~ la forma-

tion d'agrdgats de globules rouges. Selon la ,~ thdorie du rdseau ,,, 61aborde pour expl iquer le phdnomhne de prdcipitation, la rdaction d'agglut inat ion appara i t comme un phdnomhne trhs spdcifique expli-

cable par la format ion d'un r6seau tr id imensionnel entre des moldcules d'ant icorps mult i fonctionnel les et des structures antigdniques

Manuscrit regu Ie 2-5-1978.

278 CARTRON J.P. et ROUGER P.

multivalentes. Les mol6cules d 'ant icorps seraient donc capables de se fixer sur des sites antig6niques port6s par des cellules adjacentes,

et lorsque le ~, r6seau ,, ainsi constitu6 devient suf f isamment important, on observe la r6action d'agglut inat ion (FIG. 1).

AGGLUTINAT

Mol~cule d'IgG

Molecule d'IgM

FIG. 1_ - - Illustration schdmatique de la thdorie du rdseau.

b) L'AGGLUTINATION NON IMMUNOLOGIQUE.

On sait depuis tr~s longtemps que certaines substances sont

capables de provoquer l 'agglut ination non sp6cifique des 6rythrocytes.

On d6finit alors le ph6nom~ne de panagg lut inat ion , qui correspond ~ l 'agglut ination de routes les hdmat ies normales par diverses substances pr6sentes dans le mil ieu d' incubation.

AGGLUTINATION DES GLOBULES ROUGES 279

On peut citer les exemples suivants :

- - l 'agglutination par des contaminants chimiques tels que des d4tergents, la silice colloidale ou des cations m4talliques ;

- - l a panagglutination par des composds charg6s ou neutres: polybrhne, sulfate de protamine, dextran;

- - la panagglutination par des phytohdmagglutinines, c'est-~-dire des substances d'origine v4g4tale (concanavaline A,...) qui pos- s6delit des r4cepteurs sur toutes les hdmaties humaines.

I1 convient de remarquer que la prdsence dans un sdrum, d'un anticorps dirig6 contre un antig6ne public (ex: H, I, Vel, etc.) peut simuler un ph6nom~ne de panagglutination, mais dans ce cas les h4maties de quelques rares sujets ne sont pas agglutin4es (sujets hh, I - - , Vel --,...).

I1 lie faut pas confondre ce ph6nom6ne avec celui de la polyag- glulinabilitd qui correspond ~ l'agglutination d'hdmaties rnodifides par des anticorps pr6sents dans tous les s6rums humains.

C) MI~CANISMES IMPLIQUI~S DANS LES RI~ACTIONS D'AGGLUTINATION.

La th~orie du r4seau est commundment admise, mais les exemples pr6cddents permettelit d'imaginer que certaines rdactions d'agglutination peuvent aussi s'expliquer sur des bases purement physicochimiques. Par ailleurs, la plasticit6 de la membrane cellulaire joue 6gale- ment uli r61e primordial puisque 1'Oll salt que des h6maties trait4es par des ald4hydes (formol, glutarald~hyde) deviennent totalement inagglutinables.

I1 apparait vain aujourd'hui de trouver des explications en faveur de tel ou tel m6canisme de l'agglutination m6me si l'on pense que pour des raisons d'ordre g6omdtrique, la formation d'un , r~seau,7 n'est peut ~tre que la simplification d'un ph41iombne plus complexe.

Dalis l'6tude gdndrale du ph61iom6ne d'agglutination, le facteur essentiel qui doit 6tre pris eli considdration est sans doute la distance moyenne qui sdpare les hdmaties en suspension. Cette distance peut 4tre modifide dans diverses circonstances, parfois par des processus purement immunologiques, parfois par des altdrations de nature physicochimique. C'est la somme de ces 6v6nements qui est ?a l'ori- gilie de la formation des agglutiliats, dont la stabilit6 est assurde et m4me renforc6e dalis certains cas, par la formation de liaisons


multiples d'une m~me mol6cule d'anticorps avec des sites antig4- niques prdsents sur des h6maties voisines.

d) L'AGGLUTINATION PASSIVE.

Les h6maties peuvent 6tre utilis4es comme support pour coupler de nombreux types d'antig6nes qui ne sont pas synth6tis6s par la cellule. On peut en effet fixer par voie chimique des hapt6nes (DNP, acide sulfanilique), des prot6ines (SAB, immunoglobulines), ou m~me des virus.

La pr6sence dans les s4rums d'anticorps dirig4s contre de tels antig~nes est alors possible grfice h une r4action dite d'agglutination passive. On peut 6galement utiliser comme support des particules inertes: latex, sdpharose, Biogel...

A. - - Ant ieorps agg lu t inants et non agg lu t inants .

1. DI~FINITION EMPIRIQUE.

Un anticorps est dit agg lut inant quand il est capable de produire une agglutination des h6maties suspendues en NaC1 0.15M (solution physiologique isotonique).

Au contraire, un anticorps est dit non agglut inant , quand sa fixation fl la surface de l'h6matie ne suffit pas ~ provoquer 1'agglutination en suspension NaCI 0.15M. On peut cependant d6montrer que la fixation s'est produite en proc4dant ~ l'61ution de l'anticorps.

2. RELATION AVEC LA STRUCTURE MOLt~CULAIRE DES ANTICORPS.

Tr6s schdmatiquement il est possible de dire que les anticorps de type IgM sont g6ndralement agglutinants alors que les anticorps de type IgG ne le sont pas.

Exemple d'anticorps agglutinant : IgM anti-A

Exemple d'anticorps non agglutinant : IgG anti-D.

L'association stricte entre un type moldculaire donnd et une activit6 agglutinante n'est pas toujours la r6gle. Comme il apparait darts le tableau I, on peut faire les observations suivantes :

a) Certains anticorps de type IgG (par exemple: anti-A) sont agglutinants, alors que d'autres de nature IgM ne le sont pas (par exemple : anti-Jka).

TABLEAU I

Activitd agglutinante et capacitd de fixation du compldment des principaux types d'alloanticorps (se]on N.C. HUGHES-JONES)

ANTICORPS

Anti-A et anti-B

CLASSE MOL~CULAIRE

IgM

IgG

IgA

ACTIVlT~ AGGLUTINANTE

Anti -H IgM +

Anti-Le* IgM + (4 - - 22 C

Anti- I IgM + (40C)

Anti-P,

Anti~Rh6sus

Anti-Kel l

Anti-Fy

Anti- Jk

Anti-M

Anti-N

IgM

IgG (rare)

IgG

IgM

IgA

IgG

IgM (rare)

IgG

IgM (rare)

+ (4 - - 22oC)

m

+

(+)

CAPACITI~ DE FIXATION

DU COMFLF~MENT

Anti-S

Anti-s

Anti-Lu a

Anti -Lu b

+

+ (90 %)

h

m

IgG -- +

IgM (rare) (+) +

IgM +(4 - -22C) - -

+(4 et 37C)

+ (4 - -22oC)

m

+

IgG

IgM

IgM (rare)

IgM

IgA

m

SITES DE DESTRUCTION DES GLOBULES

SENSIBILIS~S IN VlVO

hdpat ique et intra vas- culaire

sur tout hdpat ique parfois int ra vascula i re

hdpat ique

Spldnique

hdpat ique en caN de f ixat ion du compldment et sp ldnique en caN de non f ixatior du compldment

hdpat ique en can de f ixat ion du compldment et sp ldnique en caN de non f ixat ion du cornpldment

hdpat ique (en can de forte sensib i l isat ion) ou parfo is spldnique

r hdpat ique (en can de

forte sensib i l isat ion) ou parfo is spldnique

hdpat ique

282 CARTRON ].P. et ROUGER P.

b) Un m~me anticorps anti-A de nature IgM qui agglutine des h4maties A 1 ou A 2 suspendues en NaC1 0.15 M n'agglutine pas les h~maties Am.

c) De la m~me mani~re, une IgG anti-D qui n'agglutine pas les h4maties Rh positives (D), agglutine cependant les hfimaties D- - - - /D - - - (variante rare du syst~me Rh6sus).

I1 apparait doric que l'activitd agglutinante d'un syst~me n'est pas uniquement li~e au type mol~culaire des anticorps utilisds. Une attention particuli~re doit 6galement ~tre portde sur les structures rdactives propres ~t l'antig~ne lui-m~me.

3. ROLE DES STRUCTURES ANTIGI~NIQUES.

In/luence du hombre de r~cepteurs antigdniques : Les diffdrences de comportement sdrologique des anticorps anti-A et anti-D mis en prdsence d'h~maties Am ou D- - - - /D - - - - respectivement, sont /t l'4vidence reli4es g des variations de la densit6 en sites antigdniques des h~maties consid4rdes.

2048

512

128

32

16

i0

8

A IgG

IgG + antiglobuliue

,. , , , , , , i , i 5 I0 20 50 I00 200

NOMBRE DE SITES ANTI~ENES PAR CELLULE

( x 1o =3. )

F1G. 2 . - Relat ion ent re la densit6 ant igdnique et l 'agglut inabi l i t6. Abc isse : densit~ en moldcules d 'ac ide sul fani l ique coupl~ par globule rouge. Ordonnfie : t i tre agg lu t inant obtenu avec les p reparat ions IgG anti-acide sul fani l ique.


On sait en effet qu'il existe une relation tout ~ fait claire entre l'agglutinabilitd des hdmaties et leur densit6 en sites antig6niques. Ce ph6nom~ne a ~t~ bien ~tudi~ avec des variants rares des g6nes A et B. Par exemple, on sait que les h~maties Am sont caract~risdes

par des densit~s en sites antigdniques de l'ordre de 10 ~ rdcepteurs A/cellule alors que les h~maties A 1 en poss6dent 106 environ par cellule. Pour le syst~me Rhdsus, on estime entre 104 et 3.104 la

densit~ en r6cepteurs D sur les h~maties Rh positives normales et 105 environ celle des hdmaties D- - - - /D - - - -

La relation entre l'agglutinabilitd et la densitd antigdnique a 6td-- 6galement 6tudide par HOYER dans un syst6me different (FIG. 2). Cet auteur a coupl6 des quantit6s variables d'acide sulfanilique--3~S sur des globules rouges, par l' intermddiaire d'un ddrivd diazoique. Le titre agglutinant des diverses prdparations suspendues en NaCI 0.15M a dtd ddtermind ~ l'aide de sdrums anti-acide sulfanilique de nature 7S et 19S, par une technique de centrifugation suivie d'une lecture macroscopique de l'agglutination. I1 apparait ici ~galement que les h~maties sont d'autant plus agglutinables que leur densit6 antigdnique est 61evde. On constate en outre que les anticorps de type IgM sont plus efficaces que les anticorps de type IgG, ce qui sera discut6 plus loin.

Not ion de seuil antigdnique crit ique : On ddfinit comme tel la densitd minimum permettant d'observer une agglutination. La valeur prdcise du seuil critique ddpend en fair du syst6me antig~nique testd et des conditions expdrimentales, mais il est possible que la nature de l'anticorps joue un r61e fondamental. Ainsi dans le travail de HOYER (FIG. 2) le seuil critique est de l 'ordre de 30.000 sites antig~niques pour ies IgG anti-acide sulfanique, mais de 15.000 seulement avec les IgM de m~me sp~cificitd. La diffdrence est abolie en prdsence d'anti-immunoglobuline anti-IgG. Darts le syst~me ABO et selon les mdthodes utilisdes dans notre laboratoire, le seuil critique est de l 'ordre de 2 g 3.000 rdcepteurs A/cellule, ce qni correspond effectivement aux mesures pratiqudes avec des h6maties Am, dont on sait que la spdcificit~ de groupe A ne peut-6tre affirmde que par des expd- riences de fixation- 61ution d'anti-A. LUDERITZ utilisant un syst6me de globules rouges coupl6s h des lipopolysaccharides asp d'E. Coli a montrd qu'il fallait au moins 5 000 moldcules marqu6es au 32p fix6es par globule rouge pour obtenir une rdaction d'agglutination avec les anticorps spdcifiques.


Inf luence de la localisation des r~cepteurs antigdniques : Les d6ter- minants antig6niques peuvent 6tre soit 1ocalis~s h la surface m6me du globule rouge, soit masquds en partie ou totalement dans la membrane. Dans ce cas, on parle de cryptoantigbnes dont l'accessi- bilit6 aux mo16cules d'anticorps est 6videmment plus faible sinon

nulle.

L'exemple le plus connu est probablement l'antig6ne T d6crit par HUBENER, THOMPSON et FRIEDENREICH. Chez l'individu normal l'anti- g6ne Ten position interne dans la membrane n'est pas rdactif. I1 n'apparalt qu'apr~s traitement des globules rouges normaux g la neuraminidase. De telles h6maties sont polyagglutinables car tous les s6rums normaux contiennent un anti-T.

Ce ph6nom~ne de polyagglutinabilit6 in vitro #observe en parti- culler avec des 6chantillons de sang infect6s.

4. EFFICACITI~ AGGLUTINANTE DES ANTICORPS DE TYPE IgG ET IgM: R6LE DES STRUCTURES MULTIVALENTES.

La quasi-totalit6 des dtudes comparatives montrent que l'activit6 agglutinante des anticorps de type IgM est 10 ~ 100 fois supdrieure

celle des anticorps de type IgM, quelles que soient les sp6cificit6s immunologiques concern6es. Une illustration de cette difffrence appara~t dans la figure 2 pour les anticorps anti-acide sulfanilique. I1 convient cependant de remarquer que la diffdrence est abolie si les anticorps de type IgG sont r6v61ds par une rdaction ~ l'antiglobuline.

Dans le syst6me ABO, GREENSURY a pu calculer qu'il suffit de 25 moldcules d'IgM anti-A fixdes par h6matie pour induire 50 % d'agglutination d'une suspension d'hdmaties A 1 /t 5 % en NaCl 0.15M. Pour obtenir le m6me r6sultat, il faut au contraire 19.500 mol6cules d'IgG anti-A fix6es par h6matie.

L'avantage des mol6cules d'IgM par rapport aux mol6cules d'IgG n'est pas limit6 aux r6actions d'agglutination, mais concerne 6gale- ment le pouvoir de neutralisation. La structure pentam6rique des IgM semble doric parfaitement adapt6e/t ces fonctions, probablement h cause des possibilit6s de liaisons multiples qui peuvent s'6tablir avec les r6cepteurs antig6niques port6s par les h4maties ou les micro- organismes.

Dans la conception du rdseau, l'efficacit6 agglutinante des moldcules d'IgM (~ = 300-400 nm) par rapport h celle des moldcules


d' IgG (1 = 140 nm) est directement lide h leur taille moMculaire respective.

L'efficacit6 de l ' IgM r6sulte dgalement, dans les processus d'h~mo- lyse, de sa structure pentam6rique qui lui permet d'activer le premier composant du complexe C:. Comme nous le verrons, il faut au contraire 2 mol6cules d' IgG pour produire cette activation.

En d6finitive la grande efficacit6 des mol6cules d' IgM dans les divers processus reprdsente un moyen dconomique de d6fense de l 'organisme contre les agressions. De tels anticorps sont en effet les produits de la r6ponse immunitaire primaire. Ils permettent d'obtenir un effet protecteur max imum /~ une concentration la moins 61evde possible.

B. - - R61e de la charge ~lectr ique du g lobule rouge.

L'61ucidation des m~canismes de 1'agglutination et du r61e jou6 par divers facteurs exp~rimentaux met en jeu d'une mani6re constante la charge 61ectrique de l'hdmatie.

Les 6tudes de migration ~lectrophor6tique ddmontrent que Ies globules rouges se comportent comme des particules ~ caract6ristique anionique. L'origine de cette charge est li6e pr incipalement h la prdsence /t la surface de l 'h6matie des groupements carboxyliques des acides sialiques attach6 ~t des glycoprotdines de la membrane. Toutes les h6maties 6tant porteuses de la mSme charge n6gative, il se cr6e en suspension saline une forte r~pulsion interglobulaire. La d6termination pr6cise de cette charge est un probl~me th6orique complexe et des valeurs tr6s diffdrentes peuvent ~tre obtenues si l 'on tient compte de la perm6abil it6 de la membrane cellulaire aux ions contenus dans le milieu et de la r6partit ion de ces ions h l ' intdrieur m6me de la cellule.

1. DI~FINITION DU POTENTIEL ZETA.

En pr6sence d'dlectrolyte, chaque globule rouge est entour6 d'un nuage d'ions positifs (FIG. 3) dont la densit6 diminue lorsque la distance ~ l '6rythrocyte augmente. I1 se forme donc une double couche compos6e par les charges superficielles de l '6rythrocyte et le nuage de cations. Lorsque le globule rouge se d6place, il entraine une part ie du nuage darts son mouvement et la force de rdpulsion interglobulaire ddpend alors du potentiel qui existe au plan du cisail lement ainsi ddfini. C'est le potent iel zdta du syst~me.


Le potentiel zdta d'un syst~me peut 6tre ddtermin6 expdrimentale- ment /~ part i r de la mobil itd 61ectrophordtique des globules rouges darts un champ dlectrique, g condition de connaitre la viscosit6 et la eonstante di61ectrique du milieu. I1 peut 4galement 6tre calculg, d'une autre mani6re, si l 'on connait la charge dlectrique de l'hdmatie.

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. . . . . . . . " "" mouvement du globule

: ":" "" - " : ; "-" "'" "" --' ~ouge

Epa isseur de la

doub le couche( ! )

k

Nuage de cat ions autour du g lobu le rouge

(doub le couehe)

FIG. 3. -- Reprdsentation sch6matique du potentiel zdta.

POLLACK a d6velopp6 une expression du potentiel z6ta (Z) faisant intervenir la densitd surfacique de charge du globule rouge (~), l'activitd ionique (Ix) et la constante di61ectrique (D) du milieu, selon une dquation symbolisge par :

I 1 D , ~1 Z=f o-, ~/

Comme nous l 'avons signal6 plus hau t, la difficult6 d'une d6ter- minat ion exp~rimentale pr6cise de implique que les variations de potentiel z6ta sent plus significatives que les valeurs absolues calculdes.

AGGLUTINAT ION DES GLOBULES ROUGES 287

2. RELATION ENTRE LE POTENTIEL ZETA ET L'AGGLUTINATION.

D'un point de rue purement physicochimique l 'agglutination est caract6risde par la rdunion en areas de cellules, c'est-h-dire une situa- tion dans laquelle la distance moyenne entre les globules rouges se r6duit h une valeur minimum. L'expression de cette distance d6pend de la valeur de deux forces antagonistes :

- - la tension interfaciale, tend ~ agrdger les hdmaties. Sa d6ter- ruination expdrimentale est difficile, mais une estimation peut 4tre obtenue en 6tudiant le comportement des hdmaties pour des valeurs faibles (en valeur absolue) du potentiel z6ta;

- - la force de repuls ion due h la charge n6gative des hdmaties. Cette force est mesurable exp4rimentalement par l ' interm6diaire de la mobil it4 61ectrophor4tique des globules rouges. En l 'absence d'agents agglutinants, c'est la force de r6pulsion qui pr6domine, puisque la suspension de globules rouges en NaC1 0.15M est stable.

C'est NORTHROP qu ivers 1920 a montr6 que l 'agglutination bact6- rienne 6tait fonction de la valeur du potentiel z6ta du syst6me. ABRAMSON de son c6td a d6fini la notion du potentieI zEta-critique. Cette notion exprime que pour des valeurs dlevdes de potentiel zdta (en valeur absolue), les cellules ne s'agglutinent pas, m4me en prdsence d'anticorps sp6cifique. Ce qui s'explique par une force de rdpulsion tr6s 4levde entre les hdmaties. Si 1'on diminue lentemenl le potentiel zdta du systhme (en valeur absolue) on constate que l 'agglutination apparait, pour une valeur caract6ristique du potentieJ z6ta critique.

On distingue en fait deux potentiels z6ta-critiques: celui o/1 l 'agglutination du syst6me commence et celui h part i r duquel l'agglutination est maximum.

3. DI~TERMINATION DU POTENTIEL ZETA CRITIQUE DES ANTICORPS AGGLU-

TINANTS ET NON AGGLUTINANTS.

POLLACK a tent6 (grfice /t l '6quation d4veloppde du potentiel z4ta) d'expliquer sur des bases physicochimiques les diff6rences de comportement sdrologique des anticorps de type IgG et de type IgM.

L 'a justement de la force ionique et de la constante didlectrique du milieu de suspension des h6maties permet en effet de faire varier fl volont6 le potentiel zdta d'un syst6me (Fro. 4).


Si par ce moyen on abaisse le potentiel z6ta jusqu'h une valeur de l 'ordre de - -7 mV, les globules rouges tendent g s'agglutiner spontan6ment en l'absence d'anticorps sp6cifique. Ce potentiel carac- t6ristique est ind6pendant des h6maties test6es et permet ainsi d'obtenir une 6valuation de la tension interfaciale des globules rouges.

I 00 .

.o

3

IS ~ IS ~ d'anti~rps

I

I ZeNE I D' ABBLLITINATION

| NON SPECIFI QUE ! | *** I ! I

i

r

-2o -151 - Io -7 P=/'en~';el Ze./:et

Fic. 4 . - Reprdsentation sch6matique de la notion de potentiel zeta critique. Zcl = Zeta critique des anticorps IgM. Zc2 = Zeta critique des anticorps IgG. Z = Potentiel zeta des hdmaties suspendues en NaC1 0.15 M.

I1 est 6galement possible de reprendre l'exp6rience pr6cddente en pr6sence d'anticorps sp6cifique de type IgG puis IgM. Pour fixer les iddes, pr6cisons que les courbes indiqu6es sur la FI6URE 4 sont obtenues avec des h6maties Rh positives et des anticorps anti-Rh de type IgG (non agglutinant) et de type IgM (agglutinant) respectivement.

On peut alors d6terminer les potentiels zdta-critiques de chacun des syst6mes, c'est-g-dire les potentiels /~ partir desquels les h6maties Rh+ s'agglutinent :

Pour les IgM anti-D, cette valeur est de l 'ordre de - - 18 h - - 23 mV, alors que pour les IgG anti-D elle est de - -8 ~ - -10 mV (Fro. 4).

Un calcul simple permet par ailleurs d'estimer ~ - -15 mV le potentiel zdta des h6maties Rh positives suspendues en NaC1 0.15M. Par cons6quent il apparait clairement que dans un tel syst~me les anticorps de type IgM sont agglutinants car leur potentiel z6ta critique est sup6rieur (en valeur absolue) h celui de la suspension. Au contraire, le potentiel z6ta critique en pr6sence d'IgG anti-D 6tant


inf6rieur (ell valeur absolue) 5 celui du milieu, il n'y a pas d'agglu- tinatioli des h&naties Rh positives. Deux m6canismes diff6rents peuvent conduire 5 l'agglutiliation : une diminution (eli valeur absolue) du potentiel z6ta du milieu ou bien une augmentation (en valeur absolue) du potentiel z6ta critique du syst~me.

Une illustration naturelle : le phdnotype En (a- - ) . Un phenotype exceptionnel En(a - - ) , d6couvert en 1969 par FURUHJELM illustre remarquablement la relation entre le potentiel z6ta et l'aggllitinabilit6. La mobilit6 de telles h6maties est consid6rablement diminu6e par rapport h eelle des h6maties normales En(a+) . Cette anomalie r~sulte de l'absence de la sialoglycoprot6ine majeure PAS-1 qui porte la quasi totalit6 de la charge 61ectrique du globule rouge. Les hdmaties En (a - - ) suspendues en NaC1 0.15M ont en effet ull potentiel z6ta de - -7 .9 mV. Sur le plan s6rologique on a constat6 effectivement que l'agglutinabilit6 des h6maties En(a - - ) 6tait trbs augment6e eli pr6sence des antieorps IgG classiquemelit non agglutiliants ell parti- cuIier les anticorps anti-Rh, Duffy et S.

4. FACTEURS CAPABLES DE MODIFIER LE POTENTIEL ZETA.

D'lili point de rue purement th6orique on peut distinguer deux fagolis de modifier le potentiel z6ta d'lln systbme :

a) Rdduction de la charge dlectrique que l'on peut mesurer grfice aux propri6t6s 61ectrocin6tiques des h6maties. On range dans cette cat6gorie les effets dus ~ la fixation des anticorps, ou le traitement des h6maties par les enzymes prot6olytiques.

b) Variation de la composition du milieu rdactionnel.

Les effets portent surtout sur la modification de la force ionique, et de la constante di61ectriqlle du syst6me.

En d6finitive, il apparait clairement que l'agglutinabilit6 d'un syst~me est d'autalit plus probable que le potentiel z6ta est faible ell valeur absolue. Ce potentiel pourra dimiliuer dans trois circons-

1 1 tances exprim6es par l'6quation de POLLACK" Z = f (~ , - - , - - )

D V tr - - Si la charge 61ectrique de l'h6matie diminue;

Si la constante di61ectrique dll syst6me augmente;

- - Si la force ionique du milieu augmente ;

290 CARTRON ZP. et ROUGER P.

De telles conditions exp6rimentales sont les principaux objectifs ~t atteindre pour mettre en oeuvre et expliquer les r6actions d'agglutination artificielle.

C. - - In f luence de d ivers fac teurs sur la r4act ion d 'agg lu t inat ion .

Les facteurs 6tudi4s dans ce paragraphe influent non seulement au niveau du ph6nom6ne d'agglutination, mais aussi au niveau de la fixation primaire des anticorps sur les d4terminants antig6niques, puisque ces denx aspects de la r6action ne sont pas dissociables. Les principaux sont la temp6rature, le pH et la force ionique (Tabl. II).

TABLEAU I I

Inf luence de divers facteurs physicochimiques sur la rdaction d'hdmagglutination *

FACTEUR

Temp6rature

Force ionique

pH

VARIATION

N

N

6~8

REACTION PRIMAIRE R~ACTION SECONDAIRE

17 vitesse de r4action Var iable: ABO, Rh, effet sur Ko

"N vitesse de rdaction , ,, effet sur Ko

"h /z (thdorie)

peu d'influence pour de si . . . . . . faibles variat ions . . . . . . >

* Le r61e de la constante di41ectrique et de la viscosit4 du milieu reste g prdciser,

a) INFLUENCE DE LA TEMPI~RATURE.

On peut sch6matiquement distinguer deux types de r6activit4s s6rologiques, dont le premier regroupe des r6actions opt imum 5 basse temp6rature, et l 'autre des r6actions opt imum /t des temp6ratures plus 61ev6es.

Les anticorps actifs vers + 4C, parfois nommds ,, anticorps froids ,, correspondent principalement aux sp4cificit4s I, H, A, B, Lewis, M, N et P. II s'agit le plus souvent d'anticorps naturels r6guliers ou irr6guliers.

Les anticorps immuns r6agissent mieux 5 37C, ils sont parfois appelds , anticorps chauds ,,, c'est le cas des anticorps des syst~mes Rh6sus, Kell, Dully et Kidd.


b) INFLUENCE DU pH.

Les modifications du pH comprises entre 6.0 et 8.0 ont peu ou pas d'effet sur la r6activitd sdrologique des hdmaties. En dehors de ces limites on peut observer soit une hdmolyse des 6rythrocytes pour

des valeurs extremes de pH, soit une inhibition de l'agglutination due /~ une rdduction importante de la constante d'association de

l'anticorps.

C) INFLUENCE DE LA FORCE IONIQUE (~).

Selon l'6quation d6velopp6e par POLLACK, une augmentation de

conduit h une diminution du potentiel z6ta des hdmaties suspendues en saline, ee qui favorise th6oriquement l 'apparition du ph6nombne

d'agglutination. On salt 6galernent qu'une concentration trop 61ev6e

de certains cations (Cr a+, A1 a+, Fe ~+) peut entrainer une panaggluti-

nation des h6maties non sensibilis6es. D'un point de rue purement physique, les cations surnum6raires introduits dans le milieu modi-

fient l 'atmosph~re ionique entourant les cellules, et il en r6sulte une diminution de la force de rdpulsion interglobulaire.

La force ionique joue 6galement un r61e important dans l'6qui- libre primaire anticorps-antigbne puisque sa diminution d'un facteur 10 peut provoquer une augmentation de la constante d'dquilibre Ko

par un faeteur compris entre 100 et 1200.

L'effet de la force ionique sur la r6activit6 s6rologique des globules rouges se manifeste donc sons deux aspects antagonistes. Si l 'augmentation de ~ conduit ~ une augmentation de l'agglutinabilit6, en pratique les concentrations salines 61ev6es inhibent la fixation initiale de l'anticorps sur les antig~nes cellulaires, conduisant h un ph6nombne inverse de celui recherch6. I1 faut donc trouver un compromis, ce qui sur le plan pratique ne permet pas d'envisager des variations importantes de ce param~tre.

Lorsque c'est techniquement rdalisable on utilisera donc des r6ac- tions en deux temps oO seule l'6tape de sensibilisation se pratique

faible force ionique dans un milieu iso-osmotique. Appliqud h la

r6action de Coombs, cet artifice permet de r6duire ~ quelques minutes seulement les temps d'incubation.

L'augmentation de r6activit6 s6rologique avec ~ n'est pas g6n6- rale dans tousles systbmes de groupes sanguins. On l'observe surtout


pour le syst6me Rh, la d6tection des D TJ de faible grade et pour les r6activit6s M, P, Kell Fy" et Jk a. Les variations de Ix n'affectent pas de faqon significative les r6activit6s s6rologiques ABH et Lewis.

AGGLUTINAT ION ART IF IC IELLE

Les anticorps non agglutinants ont la propri6t6 de se fixer sur les h6maties mais sont incapables de les agglutiner. Leur d6tection repose doric sur des artif ices techniques dont les plus r6pandus sont:

- - le t ra i tement des h6maties par les enzymes prot6olytiques : trypsine, papa~ne, brom61ine, ficine ou pronase ;

- - l 'addition au milieu r6actionnel de substances macromoldculai- res : Albumine, PVP, Dextran, ficoll;

- - le test /t l 'antiglobuline ou rdaction de Coombs.

On peut 6galement produire une r6action d'agglutination par simple centri fugation vers 11.000 g du mdlange r6actionnel, mais cette technique n'est pas tr6s souvent utilis6e.

En immunoh6matologie ces mdthodes apparaissent essentielles pour l ' identif ication des alloanticorps sdriques chez des malades transfusds, les groupages sanguins, le diagnostic des autoanticorps d'an6mie h6molytique et le diagnostic de la maladie h6molytique du nouveau-n6.

1. M6can isme d 'ac t ion des enzymes prot6o ly t iques .

La trypsine, la papaine, la brom61ine et la ficine sont les princi- pales enzymes prot~olytiques utilisdes dans les r6actions d'agglutination artificielle.

Ces enzymes d'origine animale ou v6g6tale d~capent la surface de l 'h6matie en l ib6rant des fragments polypeptidiques qui appartien- nent aux glycoprot6ines.

Les h6maties ainsi traitdes peuvent 6tre agglutin6es par les anticorps IgG rdput6s non agglutinants (ex: IgG anti-D), mais cette propri6t6 n'est pas li6e g un d6masquage de nouveaux d6terminants antigdniques.

Compte tenu des notions prdcddentes, les m6canismes suivants peuvent 6tre 6voqu6s.


a) DIMINUTION DE LA CHARGE I~LECTRIOUE SUPERFICIELLE DE L'HEMATIE

Les f ragments po lypept id iques l ibOrds cont iennent en e f fe t des

mo ldcu les d 'ac ides s ia l iques , ce qu i ent ra ine une rOduct ion du potent ie l

zOta du sys t~me et de la rOpu ls ion in terg lobu la i re (Tab l . I I I ) . Cet te

exp l i ca t ion es t ell accord avec le modOle d lec t ros ta t ique propos6 par

POLLACK. Ce modOle purement d lec t ros ta t ique es t cependant d i scutab le

pu isqu ' i l appara l t ma intenant que les h6mat ies Rh+ t ra i tOes par la

neuramin idase (enzyme qu i hydro lyse spdc i f iquement les rds idus

ac ides s ia l iques) ne sont que fa ib lement agg lu t indes par les ant i -

TABLEAU III

Modif icat ions de U, Z et ~ assocides avec le t ra i tement des GR par les enzymes.

GR

Non traitds .

Trypsine . . . .

Bromdline ..

PapaYne . . . .

Ficine . . . . . .

MOBIL IT~ ~r U

104 cmZ/sec/vo l t

- - 1 ,47

- - 1 ,17

- - 1 ,06

- - 0,76

- - 0,68

POTENTIEL Z (mY)

- - 19 ,6

- - 15 ,6

- - 14 ,1

- - 10 ,1

- - 9 ,0

DENSITI~ SURFACIQUE

0" 10 a ues /cm 2

- - 3,27

- - 2,59

- - 2,35

- - 1 ,68

- - 1 ,51

% RI~DUCTION de Z ou

0

24,4

28,1

48

53,9

TABLEAU IV

ROle du potent ie l zdta sur l 'agglutinabil itd Rh.

R1R1 EN NaCl 0.15M

Non traitds . . . . . . . . . . . . . .

Papaine . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Neuraminidase (RDE) ..

Papaine/RDE . . . . . . . . . . . .

RDE/Papaine . . . . . . . . . . . .

TITRE ANTI-D

0

5 120

10

5 120

5 120

MOBILITI~ ELECTROPHORETIOUE

Ix m. sec-I_v -1 m 10 -2.

1.14

0.54

0.27

0.37

0.36

D'apr~s Stratton et coll. (1973). ROsultats confirmds par Voak et colL (1974) et Luner et coll. (1975). Le mOme phdnomOne est observd avec les antieorps anti-k et anti-e.


corps anti-Rh, malgr6 une diminution globale de 80 % environ de leur charge 61ectrique (Tabl. IV).

b) AUGMENTATION DE LA CONSTANTE D'AFFINITI~ Ko DE L'ANTICORPS, par au moins deux m6canismes :

Une r6duction d'encombrement st6rique, donc une meilleure accessibilitd du motif antig6nique.

L'dtablissement de liaisons hydrophobes entre les structures r6ac- tires par libdration des mol6cules d'eau d'hydratation.

C) REDISTRIBUTION DES RI~CEPTEURS ANTIGI~NIOUES DE SURFACE.

I1 est maintenant d6montr6 par visualisation directe en micros- copie 61ectronique, que le traitement des h6maties par les enzymes prot6olytiques elltraine une modification de distribution des antig~nes A, D et c de la surface. Ces rdsultats s'accordent bien avec le caract6re en mosa'fque fluide des membranes et favorise selon SINGER et NICOLSON la formation de liaisons multiples avec les mol6.cules

d'anticorps.

Pour conclure il faut signaler que certains antig6nes de groupes sanguins sont d6truits ou inactiv6s apr6s traitement enzymatique: M, N, S, s, Fy ~, Spa, Tn, Xg a. Cette inactivation r6sulte de la pr6sence des d6terminants antig611iques sur les fragments polypeptidiques lib~r6s lots de la prot6olyse.

2. Mdcan ismes d 'ac t ion des substances macromol6cu la i res .

ROle de la constante didlectrique du milieu ou effet dlectrovis-

queux ?

C'est POLLACK qui le premier a offert une explication plausible dn mdcanisme d'agglutination en milieu macromoldculaire. Les substances hydrosolubles utilisdes telles que l'albumine, le PVP, le dex- trail, le ficoll se polarisent darts le champ 61ectrique des globules rouges et diminuent la force de rdpulsion interglobulaire. L'effet de ces mol4cules est donc d'6lever la constante diOlectrique du milieu, ce qui entraine une diminution de potentiel z4ta et favorise le phdnomhne d'agglutination.

Ce mdcanisme est cependant controvers6 par BROOKS, qui sur la base d'arguments th4oriques a montrd qu'une augmentation de la


constante di61ectrique conduit au contraire g une augmentation de la barri6re de potentiel entre les globules rouges. Dans ces conditions, l'agglutination observde rdsulterait plut6t d'une adsorption des macro- moldcules h la surface des h6maties. Un ddbat purement biophysique s'instaure, basd essentiellement sur la signification et la validit~ des mesures de constantes di61ectriques.

Retenons qu'en pratique on utilise des solutions d'albumine 20- 30 % et que leur efficacit6 d~pend de leur contenu en polym~res. De fausses rdactions positives dues la prdsence de stabilisateur (caprylate) ont 6galement 6t~ observ6es, ce qui n6cessite une sdlection prdalable des lots utilisables pour les tests s6rologiques.

3. Le test ~ l 'antiglobul ine.

Lorsqu'un anticorps spdcifique se fixe sur l'antig6ne correspon- dant, il induit en rbgle gdndrale une r6action secondaire du type agglutination ou 6ventuellement hdmolyse en prdsence de compl6- ment. N6anmoins dans un grand nombre de cas, aucune consdquence de la fixation de l'anticorps n'apparait ; il est alors possible de rdvdler sa prdsence si l'on ajoute au milieu, une antigobuline.

Cette agglutination artificielle apparait dgalement si des fractions du compldment (en particulier Caa in vivo) sont prdsentes ~ la surface du globule rouge, m~me si l 'anticorps lui-m6me, IgM ou IgG a 6t6 dlu~. I1 faut pour cela que le r~actif antiglobuline poss6de des anticorps spdcifiques contre certaines fractions du compl6ment.

Le test de Coornbs concerne les groupes sanguins de 2 mani6res :

- - l e test de Coo~bs direct permet de reconnaitre la fixation d'une immunoglobuline h la surface du globule rouge dans le cas de MHNN, ou d'AHA ;dans ce dernier cas on peut utiliser une antiglobuline spdcifique anti-IgG ou anticompl6ment pour prdciser le type d'AHA;

- - le test de Coombs indirect est utile dans la d6termination de certains ph6notypes drythrocytaires ou bien dans la recherche des agglutinines prdsentes dans les sdrums. On peut ainsi donner les exemples suivants de test de Coombs indirect:

Rhdsus : Les globules rouges de ph6notype Rh positif en suspension saline ne sont pas agglutin~s par un anticorps anti-Rh de type IgG bien que celui-ci se fixe sur les antig~nes D presents h la surface du globule rouge. L'adjonction d'antiglobuline anti-IgG induit l'agglu-


tination. Cette r6action est tr~s utilisde pour la mise en 6vidence des antig~nes D faible (phdnotype DU).

Lewis : Les IgM anti-Lewis se fixent sur l'antig~ne Le a des hdmaties Le(a+ b - - ) cette fixation spdcifique n'est gdndralement pas suivie d'agglutination. La fixation de l' IgM anti-Le a entraine l'activation du compldment jusqu'au stade du Cab ; le Cab inactivateur provoque la format ion du Cac et Cad. Ace stade et du fait des lavages effectuds, les moldcules d' IgM peuvent m~me s'dluer de la surface du globule rouge et seuls resteront les composants du compldment essentiel lement C~c, Cad et C4o. L'antiglobuline polyvalente induit alors l 'agglutination grfice aux immunoglobul ines dirigdes contre ces composants du compldment.

Les antigIobul ines. Les donndes prdcddentes montrent que les pr incipaux anticorps prdsents dans une ant iglobul ine po lyvalente doivent avoir une spdcificitd anti-IgG et anti-compldment. Les antiglobulines sont produites chez l 'animal ; le lapin, la ch~vre et le mouton sont les plus utilisds. Pour obtenir une ant ig lobul ine anti- compldment diverses m6thodes peuvent 6tre utilis6es, l 'essentiel 6tant d'obtenir une bonne activitd anti-C3d.

Les antiglobulines anti-IgM, anti-IgA, anti-Kappa, anti-Lambda, ne sont utilisdes que dans quelques cas particuliers.

a) L'ANTIGLOBULINE DE TYPE IgG.

L'antiglobuline de type IgG est compos6e d' immunoglobul ines dirig6es contre le f ragment Fc des IgG. Le hombre max imum d'anti- IgG capable de se combiner sur une moldcule d' IgG anti-D varie de 1 ~t 9. Si la concentrat ion d' IgG est trop 61ev6e, il y a inhibition de 1'agglutination (prozone) l 'agglutination apparait alors apr~s dilution de l'antiglobuline. Darts le syst~me globule rouge D-IgG anti-D, la quan- tit6 max imum d'anticorps fix6s pour obtenir un test de Coombs positif est de l 'ordre de 150 moldcules d' IgG par globule rouge. Les immunoglobulines adsorb6es h la surface de globule rouge, c'est-g-dire celles qui ne sont pas fix6es sur des r6cepteurs spdcifiques, ne donnent pas de r6action positive en Coombs.

b) L'ANTIGLOBULINE DE TYPE COMPLI~MENT.

Les globules rouges sensibilis6s in vivo par le compldment ne sont recouverts que par le Cad et ceux sensibilis6s in vitro le sont par le Caa, le Cac et le C 4.

AGGLUTINATION DES GLOBULES ROUGES

POLYBRENE ~,1

K II.AIt

297

16 K

L~

;~TICOP~PS ~{0N ID~IF!ES

~ -4J~TIC ORPS IDENTIFIES

:1 Le ~ Le ~ 5 J~

~_p~-

BROMELINE--I ' )

Fie, 5 . -

M F~a

Identif ication d'alloanticorps sur auto-analyseur par deux mdthodes diffdrentes (Polybrbne, Bromdline).

(1) Technique ddcrite par LnLEZARI dont la sensibilit6 est comparable celle des rdactions de Coombs ; se ddcompose en trois phases : a) La sensibil isation des h6maties par le sdrum h tester en milieu glucose acidifid de faible force ionique. b) Agglutination non sp6cifique du mdlange par adjonction de poly- brine. Cette 6tape permet aux immunoglobul ines de former 6ventuelle- ment des liaisons intercellulaires_ c) Neutral isation de Faction du polybr~ne par une solution ionique concentrde. On observe alors soit la dissociation compl6te des agr6gats de globules rouges si le sdrurn initial ne contient pas d'anticorps, soit la persistance des agglutinants dans le cas contraire.

(2) Technique ddcrite par ROSENFIELD et MARSH dans laquelle les anti- sdrums sont mis en prdsence d'hdmaties traitdes ~ la brom61ine et d'un milieu macromolfculaire (mdthylcellulose ou PVP).


I1 n'est pas utile de possdder une activit6 anti-C 4, ce d'autant que chaque molficule de C 4 entraine la fixation de plusieurs centaines de mol6cules de C~; aussi, la d6tection de l'activation du compl6- merit s'effectue plus efficacement 5 travers ce dernier composant. La pr6sence d'anti-C 3 dans le rdactif n'est certes pas inutile puisque le C3~, bien que diminuant aprbs 1 h 2 heures d'incubation /a 37C, repr6sente un composant important de la sensibilisation in v i t ro . Cependant, c'est l'anti-e3a qui constitue l'616ment indispensable de l'activit6 du r6actif puisque le C3a est prdsent en grande quantit6 et de fa~on relativement stable ~ la surface des globules rouges sensi- bilis6s in v ivo et in v i t ro . Ainsi les anti-Le ~ (IgM) anti-Jk" (IgG) et auto anti-P (IgG) sont raises en 6vidence par l'antiglobuline de type compl6ment.

4. Int6r6t prat ique des m6thodes d 'agglut inat ion art i f ic iel le.

L'dtude des principaux facteurs impliqu6s dans les rdactions anticorps-antig~nes et dans les r6actions d'hdmagglutination, app0rte des enseignements fondamentaux utilisables en immunoh6mato log ie pratique, par exemple :

- - l a pr6paration des s6rums tests de groupage;

- - la d6termination des groupes sanguins ;

- - la recherche des alloh6magglutinines pr6sentes dans les s6rums de malades transfus6s.

Des modifications judicieuses de pH, de force ionique, de temp6- rature et de 1'emploi des mdthodes d'agglutination artificielle permettent non seulement de rdduire considdrablement les temps d'incubation des r6actions d'h6magglutination, mais pr6sentent aussi l 'avantage d'6tre facilement automatisables. Dans de nombreux cas la sensibilit6 de ces m6thodes est consid6rablement augment6e.

A titre d'exemple, les r6sultats pr~sent~s dans la FIGURE 5 montrent que la plupart des anticorps rencontr6s dans les s6rums sont ais6ment mis en 6vidence sur Autoanalyser Technicon grfice ~ deux mdthodes compldmentaires de ddtection.

Dr J.P. CARTRON, Centre National de Transfusion sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75379 PARIS Cedex 15.


BIBLIOGRAPHIE

BROOKS D.E., MILLAR J.S., SEAMAN G.V.F, and VASSAR P.S. - - Some physico- chemical factors relevant to cellular interactions. J. Cell. Physiol., 69, 155, 1967.

EYLAR E.H., MADOFF M.A., BRODY O.V. and ONCLEY J.L. - - The contribution of acid sialic to the surface charge of erythrocyte. J. Biol. Chem., 237, 1992, 1962.

GERBAL A., LIBERGE G. et SALMON Ch. - - Identif ication des allo-anticorps anti-~rythrocytes contenus dans 84 s6rums. Rev. fran. Transl., 14, 349, 1971.

GORDON J.A. and MARQUARDT M.D. - - Erythrocyte morphology and clustering of fluorescent anti-A immunoglobulin. Nature, 258, 346, 1975.

HABIBI B. - - Le complGment en immuno-hGmatologie. Rev. fran~. Transl. et Imm.-Hdmat., 20, 497, 1977.

HOYER L.W. and TRABOLD N.C. - - The significance of erythrocyte antigen site density. J. Clin. Invest., 49, 87, 1970.

LUNER S.J., STURGEON P., SZKLAREK D. and Mc QUIST0y D.T. - - Effects of proteases and neuraminidase on RBC surface charge and agglutination. Vox Sang., 28, 184, 1975.

MAYER M. - - The complement system. Scientific american, 229, 54, 1973. MOLLISON P.L. - - Blood transfusion in clinical medicine, p. 409, 5 6d.

Blackwell Scientific Publication, 1974.

NORTHROP J.H. and FREUND J. - - The agglutination of red blood cells. J. Gener. Physiol., 60, 603, 1924.

NORTHROP ff.H. and DE KRUIF P.H. - - The stability of bacterial suspensions. J. Gener. Physiol., 4, 639, 1922.

POLLACK W., HAGER H.J., RECKEL R., TOREN D.A. and SINGHER H.O. - - A study of the forces involved in the second stage of hemagglutination. Transfusion, 5 (Philadelphie), 158, 1965.

ROCHNA E. and HUGUES-JONES N.C. - - The use of purified a25I labelled and y globulin in the determination of the number of D antigen sites of different phenotypes. Vox Sang., 10, 675, 1975.

STEANE E.A. and GREENWALT T.J. - - Red cell agglutination in ,, Human blood groups ,,. Mohn J.F., Plunkett R.W., Cunningham R.K. and Lambert R.M. editors. Buffalo. N.Y.S. Karger Publisher, p. 36, 1977.

STRATTON F., RAWLINSON V.I., GUNSON H.H_ and PHILLIPS P.K. - - The role of zeta potential in Rh agglutination. Vox Sang., 24, 273, 1973.

STRATToN P . - - The antiglobulin test in ,, Human blood groups ,, Mohn ff.F., Plunkett R.W., Cunningham R.K. and Lambert R.M. editors. Buffalo. N.Y.S. Karger Publisher. p. 85, 1977..

VGAK D., CAWLEY J.C., EMMINES J.P. and BARKER C.R. - - The role of enzymes and albumen in haemagglutination reaction. Vox Sang., 27, 156, 1974.

Documents

L'agglutination des globules rouges