Les phytochromes des bactéries photosynthétiques

INTRODUCTION

Les phytochromes ont été découverts chez les plantes il y a environs 50 ans (S. Hendricks et H. Borthwick). Ils constituent une famille de chromoprotéines qui répondent à la lumière rouge/infrarouge.Ils existent sous deux formes absorbant soit lumière rouge soit la lumière infrarouge. Ces deux formes sont photoconvertibles de manière reversible.

Les phytochromes ont un rôle de régulateur. En effet, le changement de forme provoque indirectement l’activation ou la répression de la transcription de gènes cibles. Ils interviennent dans la germination, la floraison, l’évitement de l’ombre, la forme et le nombre de feuilles, la synthèse de chlorophylle…

Ce n’est qu’en 1997, que les phytochromes ont été découverts chez les Cyanobactéries (chez Synechocystis sp. PCC 6803 par Lampartner et al.) puis en 1999 chez différentes bactéries (chez les bactéries nonphotosynthetiques Deinococcus radiodurans et Pseudomonas aeruginosa par Davis et al., chez la bactérie pourpre photosynthetique Rhodospirillum centenum par Jiang et al).

CyanobacteriaSynechocystis sp. PCC6803Anabaena sp. PCC7120Nostoc punctiformeProchlorococcus sp. MED4

1 2 2 0

ProteobacteriaRhodobacter sphaeroidesRhodopseudomonas palustrisBradyrhizobium ORS 278Agrobacterium tumefaciensMagnetospirillum magnetotacticum

2 6 3 2 3

ProteobacteriaPseudomonas aeruginosaPseudomonas fluorescensPseudomonas putida KT2440Pseudomonas syringae

1 1 2 2

DeinococcusDeinococcus radiodurans 1

Deux formes interconvertibles :Une forme Pr (red) absorbant à 650 nmUne forme Pfr (far red) absorbant à 730 nm

Phytochromes = apoprotéine (~ 1100 acides aminés ) + un chromophore (une biline = tetrapyrrole linéaire) responsable de la photoisomérisation. Homodimère de 120kDa.

CBDC NH2 COOH

Longueur d’onde (nm)

Absorbanc

e

Pr

660 nm

Pfr

730 nm

Domaine photorécepteurDomaine régulateur

Biliverdine (bactéries)

Phytochromobiline (plantes)

Phycocyanobiline (cyanobactéries)

NADPH/O2 Hème oxygénase

réductase

réductase

Site de fixation du chromophore : comparaison de différents phytochromes

R. palustris

Bradyrhizobium

A. tumefaciens

Rp.Bph1537/732 aa

Br.Bph/724aaPAS/S-boxes

C

C

PAS/S-boxes

At.BphP/745 aaC

CBD

Histidine kinase

CysB (en N-ter)

Histidine kinase

CSynechocystis Cph1/748aaCBD

A. thaliana

phyB /1172 aa

Histidine kinaseC

PAS PAS

CysA (centrale)

WT H253A

PM WT C19S H253A CSHA

C19S CSHA

C19GAF PHY

CBD PAS PASRpa1537

I252H253

Fluorescence du chromophore biliverdine

CBD

KinaseC

Forme Pfr

NH2COOH

Forme Pr

KinaseC

P

P

P

régulateur

NH2 COOH

Lumière rouge lointain

Lumière rouge

Activation ou répression de

la transcription

de gènes cibles

Lumière rouge

Lumière infrarouge

ON

COOH COOH

N N NO

PfrPr

Lumière rouge

COOH COOH

N N N NO O

La photoisomérisation des phytochromes

CBDC

Forme Pfr

NH2 COOH

Forme Pr

C NH2 COOH

Lumière rouge lointain

Lumière rouge

Activation ou répression de

la transcription

de gènes cibles

Lumière rouge

Domaines PAS Domaines PAS

Interaction protéine-protéine

Transduction du signal par interaction protéine-protéine

Wagner et al Nature Novembre 2005 vol 438,pp325-331

PhotosynthèseCO2

sels minéraux

H2O

1/2 O2 [CH2O]

2 H2O + énergie lumineuse 2 [H2] + O2

2 [H2] + CO2[CH2O] + H2O

2 H2O + CO2 O2 + H2O + [CH2O]h

Van Niel (1931)

Végétaux, algues, micro-algues, cyanobactéries

2 H2O + CO2 [CH2O] + H2O + O2

lumière

Bactéries photosynthétiques

2 H2S + CO2 [CH2O] + H2O + 2 S

2H2 + CO2 [CH2O] + H2O

lumière

pour la plupart actives en condition anaérobie

Rhodopseudomonas palustris

Bactérie photosynthétique capable de se développer à l’obscurité (activité respiratoire) ou à la lumière (activité photosynthétique)

LHII LHIcyt c2

DHCyt oxydase

ATPase

-

+

H+

ADP+Pi ATP

photosynthèse

respiration

commun

Q Q

C.R. cyt bc1

cyt c2

Q

H+

+

_

H+

QH2 oxydase

OxydasesO2+ 4e- + 4H+ 2H2O

LHII LHI

C.R. cyt bc1

cyt c2

-

+

P+

P+ 542 nm

c2551-542 nm

fluorescence

Qa-

Condition anaérobie lumière

B800-850 LH2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

400 500 600 700 800 900

absorbance

wavelength (nm)

forte I

faible I

LH1B800 LH2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

400 500 600 700 800 900

absorbance

wavelength (nm)

condition aérobie obscurité

obs. 8% O2

LH1

B800-850 LH2

obs. 1% O2

(Larimer et al., Nature Biotech.

2004)

rpa0122

rpa1537rpa3016

rpa3015

rpa1490

rpa0990

Environnement génomiques des six bactériophytochromes

Gènes

rpa1537 les polypeptides du centre réactionnel et l’antenne LH1

rpa0122 une succinate deshydrogénase

rpa0990

rpa1490 les polypeptides du B800-850LH2

rpa3015

rpa3016les polypeptides du B800LH2

proches de gènes codant pour

une hydrogénase

Rpa3016

Rpa0122

Rpa3015H N D/F GC

GAF PHY

CBD HK

C H N D/F GGAF PHY

CBD HK

H? N D/F GCGAF PHY

CBD HK

H N? GCGAF PHY

CBD HK (KWE) RR

CBDRpa1490

N G?GAF PHY

HK ?

?

Rpa0990

CGAF PHY

CBD PAS PACRpa1537

pBAD/phyto+HmuO6968 bp

rpaBphy

ampr

araC

hmuO

Tag.His

Pm.araBAD

pUC ori

Expression in vivo des holobactériophytochromes

not-inducedinduced

Rpa3015 Rpa3016 Rpa1053 Rpa1490 Rpa0990 Rpa1537

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

300 400 500 600 700 800

Absorbance

Wavelength (nm)

Rpa0990

Pr

Pfr

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

300 400 500 600 700 800

Absorbance

Wavelength (nm)

Rpa0122Pfr

Pr

HmuOPpsR2

cycA

bchC

bchX

bchYbchZ

bchG

bch2

bchP

ppsR1 crtKcrtC

crtD

crtE

crtF

puf operon

BA L M rpa1537

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

250 350 450 550 650 750 850

absorbance

wavelength (nm)

obscurité Pfr

excitation 760 nm Pr

Spectre d’action de la synthèse de l’appareil photosynthétique

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

250 350 450 550 650 750 850

absorbance

wavelength (nm)

Pr

Pfr

Spectre d’action de la synthèse de l’appareil photosynthétique

fusion bchC::lacZ

wavelength (nm)

0

25

50

75

100

600 650 700 750 800 850

activity fusion puf::lacZ

fluorescence

souche sauvage

obs. 660 nm 750 nm

∆rpa1537

750 nm

DNA binding of PpsR on different promotor regions

A : controlB : + PpsRC : + PpsR

bchCXYZ

A B C A B C A B C

crtIBcrtED

Effet de la lumière sur la synthèse de l’appareil photosynthétique

0

50

100

dark 740 nm

∆bphP WT

∆ppsR

cyt c2 photooxidation (nM)

Rpa1537 détecte la présence de lumière, il active la synthèse des CRs et des complexes antennaires en levant la répression exercée par le facteur de transcription PpsR2 en

condition semi-aérobie.

PfrPpsR Bchl, puf gènes

DNA

A l’obscurité en présence d’ O2

Pr

synthèse de l’appareil photosynthétique

A la lumière

PpsR

Oxydation du TMPDTransmission lumineuse

Fluorescence de la Bchl

721 803

622

590

652 733

852

870

705 772

677 746

721 803

622

590

652 733

852

870

705 772

677 746

721 803

622

590

652 733

852

870

705 772

677 746

Effet de l’éclairement à 770 nm sous 8% d’oxygène

Effet de l’éclairement à 770 nm sous 8% d’oxygène

� �

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50

Temps (h)

Do

(660

nm)

Obscurité

Eclairement � 770 nm

Inhibition de croissance de 30% en moyenne pour les bactéries des cultures éclairées

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

WT ∆1537 ∆0122 ∆0990 ∆ppsR

obscurité

illumination 770 nm

2

Activité photosynthétique

Rpa1537 détecte la présence de lumière, il active la synthèse des CRs et des complexes antennaires en levant la répression exercée par le facteur de transcription PpsR2 en condition semi-aérobie. De plus Rpa1537 suprime partiellement l’activation de la

synthèse de l’appareil respiratoire induite par PpsR2.

rpa1490rpa1491

B800-850 LH2pucA.e

pucB.e

PpsR

RR HTH

Rpa1490 ne fixe pas de chromophore

Rpa3015 Rpa3016 Rpa1053 Rpa1490 Rpa0990 Rpa1537

Rpa 1490 MHSGLDNSAELRVSDFDPITLAGGTRTEV-LPGA

Rpa 1537 MAGHASGSPAFGTADLSNCEREEIHLAGS

Rpa 3015 MTEGSVARQPDLSTCDDEPIHIPGA

Rpa 3016 MSSRSDPGQPMASATDPSGRLALDLTECDREPIHIPGA

Rpa 0122 MDEADSGGIVTARNVDLSSCDREVQYPEA

Rpa 0990 MPRKVDLTSCDREPIHIPGS

C

L’état d’oligomérisation de Rpa1490 est redox sensible

Rpa1491

Natif +DTT +DTT +Rpa1491

•Rpa1490 s’autophosphoryle sous

sa forme réduite•Phosphotransfert vers

Rpa1491

Natif +FeCy +DTT +DTT+FeCy

Rpa1490

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

400 500 600 700 800 900

absorbance

wavelength (nm)

WT dark 1% O2

∆1490 dark 1% O2

Rpa1490 n’est pas un bactériophytochrome mais un senseur d’O2 impliqué dans la régulation de la synthèse des

complexes B800-850LH2.

pucA.d

pucB.d rpa3015 rpa3016

rpa3018

rpa3017

rpa3014

RECRpa3018

HK

REC Rpa3017

Rpa3014HTHREC

taux de similarité : 67%

Rpa3015 et Rpa3016

B800LH2

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

250 350 450 550 650 750 850

absorbance

wavelength (nm)

Rpa3015Pr

Pfr

obs.

exc. 705 nm

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 350 450 550 650 750 850

absorbance

wavelength (nm)

Rpa3016

Pr

Pnr for near red

obs.

exc. 705 nm

exc. 645 nm

��

��

�

��

��

��

�

-15

-10

-5

0

5

10

15

-0,5 0 0,5 1 1,5 2

Time (s)

∆A 400 nm

Vitesses initiales

Pnr Pr

Pr Pnr

Rpa3016

Rpa3015

Pfr Pr

Pr Pfr

Rpa3015 et Rpa3016 s’autophosphorylent sous leur forme Pr

Rpa3015/3016

Rpa3018

Rpa3017

Rpa3014

Phosphotransfert vers 2 réponses régulateurs Rpa3017 ou Rpa3018

Rpa3014 + - - Rpa3018 - + - Rpa3017 - - +

Rpa3016Rpa3015705 nm obs. obs. 705 nm

P32

Prot

17% 100% 100% 55%

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

550 600 650 700 750 800 850 900

A805/A860

longueur d’onde (nm)

B

750 770 790 810 830 850 870 890 910 930 950

absorption

longueur d’onde (nm)

751 nm

712 nm

701 nm

677 nm

637 nm

651 nm

AB800LH2

Contrôle des antennes de type B800LH2 par Rpa3015 et Rpa3016

Rpa3016 and Rpa3015 détectent le rapport des intensités lumineuses entre 650 et 710 nm. Ils induisent la synthèse des complexes B800LH2 lorsque ce rapport est faible. Ils agissent peut être comme détecteurs de phytoplanctons.

Identification d’un nouveau bactériophytochromechez Bradyrhizobium ORS278

278.phyB3

hemA phycocyanobiline oxydo reductase

Heme oxygenase

gvpF gvpNgvpL

gvpG

gvpA

gvpOgvpK

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

-4 -2 0 2 4 6 8 10 12

∆A.10-2 à 670 nm

temps (s)

0

0,5

1

1,5

0 100200300400500600700800

∆A

micro mol photons/m2/s

-2500

-2000

-1500

-1000

-500

0

500

1000

1500

2000

600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800

∆A

wavelength (nm)

1ms 8ms 20ms 50ms 100ms 200ms 500ms

Rpa3015

-500

0

500

1000

1500

2000

-100 0 100 200

∆A

time (ms)

-2000

-1500

-1000

-500

0

500

1000

1500

2000

600 620 640 660 680 700 720 740 760 780

∆A

wavelength (nm)

1ms 8ms 20ms 50ms 100ms 200ms 500ms

-500

0

500

1000

1500

2000

-100 0 100 200

∆A

time (ms)

Rpa3016