LES VACCINS RIBOSOMAUX MAT ]RIEL ET MI ,THODES DE PREPARATION

L. D U S S O U R D D ' H I N T E R L A N D , G. N O R M I E R et J. D U R A N D (*)

PREPARATION DES RIBOSOMES MICROBIENS ET DE L'ARN RIBOSOMAL

Souches microbiennes

Les souches su ivan t e s on t 6t~ ut i l isees p o u r ces ~ tudes :

- - Klebs ie l la p n e u m o n i a e , t ype II. - - D ip lococcus p n e u m o n i a e , t y p e I e t II. - - H e m o p h i l u s i n f luenzae , S~ro type A. - - S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s A~2. - - A c t i n o m y c e s v i seosus , 15.987 ATCC. - - P a s t e u r e l l a hemo ly t i ca , t ype I.

Preparation des cultures

Les cu l tu res on t 6t6 r6alis6es d a n s des fe rmen- teurs de 20 1 d i s p o s a n t des contr01es e t r6gula t ions s u ivan t s : ag i ta t ion , t e m p 6 r a t u r e , pH, oxyg~ne dis- sous, a n t i - m o u s s e et densi t~ op t ique . Des pr6- cu l tu res de 300 fl 600 ml en p h a s e exponen t i e l l e on t 6t~ ut i l is6es p o u r l ' i nocu la t ion de ces f e rmen teu r s .

P o u r c h a q u e souche, les courbes de c ro i s sance on t ~t~ op t imis~es en fonct ion du mil ieu e t des diff6rents pa r am~t r e s . Les b i o m a s s e s recueil l ies dans ces cond i t ions p e r m e t t e n t d ' i so ler les ribo- s o m e s avec un m i n i m u m d ' a i t e ra t ions . En effet, les condi t ions de cu l tu re e t de r6cup~ra t ion des cellu- les on t une inc idence sur le r e n d e m e n t e t sur la qual i t~ des r ibosomes , n n ' ex i s t e a u c u n e re la t ion en t re les r e n d e m e n t s en b i o m a s s e e t en r ibosomes .

Les cellules on t tou jours ~t~ recueil t ies en fin de p h a s e de croissance , fl un s t ade off le r y t h m e de mu l t i p l i ca t i on es t encore ~lev~. Un p r o l o n g e m e n t de la cu l tu re en t r a ine des d~grada t ions i m p o r t a n - tes au n iveau des r i b o s o m e s et, p o u r ce r ta ines souches , une au to lyse .

(*) Centre d'Immunologie et de Biologie Pierre-Fabre, 17, avenue Jean-Mou- lin, 81106 CASTRES (France).

Les condi t ions su ivan t e s on t 6t6 r e t enues pou r la cu l tu re des diff6rentes souches :

Klebs ie l la p n e u m o n i a e

Les p r6cu l tu res son t r6alis6es en mil ieu ,, B ra in H e a r t infusion >~ ~ 37 °C p e n d a n t 15 heures . Le f e r m e n t e u r es t st6rilis6 avec 15 1 de mil ieu (ex t ra i t de v i ande : 300 g ; ex t r a i t de levure : 300 g ; saccha- rose : 300 g ; NaC1 : 75 g ; Na2H PO4, 12 H20 : 150 g ; p H 7) e t e n s e m e n c 6 p a r 500 ml de pr6cul ture . Apr~s 5 heu res d ' i n c u b a t i o n fl 37 °C et p H 7, la cu l tu re es t refroidie r a p i d e m e n t vers 15 °C p a r une c i rcu la t ion d ' e a u glac6e. On recuei l le alors p a r cen t r i fuga t ion con t inue la b i o m a s s e c o r r e s p o n d a n t ~ 200 g de cellules s~ches.

Dip lococeus p n e u m o n i a e

Les p r6cu l tu r e s s o n t 6ga le rnen t r6al is6es en ~ Bra in H e a r t infusion ~> p e n d a n t 15 heu res ~ 37 °C. Le fe r rnenteur es t st6rilis~ avec 15 1 de mil ieu (ex: t r a i t de levure : 150 g, p e p t o n e p a n c r 6 a t i q u e : 75 g, NaC1 : 75 g + ions m i n 6 r a u x e t T r y p t i c a s e soja) e t ensernenc6 p a r 500 rnl de pr6cul ture . La c ro i s sance dure 7 heu re s h 32 oC e t p H 7. La cu l tu re es t aussi- t6 t refroidie vers 4 °C et les cellules recueil l ies p a r c e n t r i f u g a t i o n c o n t i n u e . On o b t i e n t d a n s ces condi t ions 20 g de cellules s~ches.

S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s A I~

Pr~cu l tu re 500 ml de ~, Bra in H e a r t infusion ~, 20 heu res h 37 °C. Cul tu re darts 15 1 de mil ieu (ex t ra i t a u t o l y t i q u e de levure : 300 g, p e p t o n e pancr~a t i - q u e : 150g, N a C I : 1 5 0 g ; g lucose : 5 g + 5 g en cours de croissance) . L ' i nocu la t ion es t fa i te h p H 7

DUSSOURD D ' H I N T E R L ~ D L., NORMIER G., DURAND J. - - Les vaecins ribosomaux. Materiel et m~t~hodes de preparation. Rev. fran~. Allergol., 1977, 17 (n ° 4B), 15-19.

16 L. DUSSOURD D'HINTE~LAND ET COLLABOI~ATEURS

1 0 0

6 , E ~

- 5 , , - 7 '~ . . . . . . . .

i

densit~ optique

................ , ........ r~gu lc t ion pH

0 2 dissous

1 -

culture

F I G . 1. - - E x e m p l e de la c o u r b e de c r o i s s a n c e o b t e n u e p o u r le Streptococcus pyogenes A 12.

puis la cu l tu re s 'acidif ie p r o g r e s s i v e m e n t j u squ '~ p H 5,8. Le p H e s t m a i n t e n u tt ce t t e va leu r p e n d a n t 4 heu res e t les cellules son t i m m ~ d i a t e m e n t re- cueill ies pa r cent r i fuga t ion . 20 ~ 25 g de cel lules s~ches son t ainsi o b t e n u e s (fig. 1).

Hemophilus influenzae

Pr~cu l tu re 600 m l de ,, B r a i n H e a r t infus ion ~ enrichie p a r de l ' e x t r a i t g lobuiaire , p e n d a n t 24 heu res ~ 3~ °C. Cul tu re darts 15 1 de mil ieu (ex t ra i t de levure : 150 g ; p e p t o n e p a n c r ~ a t i q u e : 75 g ; NaC1 : 75 g ; ex t r a i t g lobula i re : 1 500 ml), p e n d a n t 24 heu re s a p H 7 e t fi 37 °C. Darts ces condi t ions , 20 g de cellules seches son t recueili les.

Act~nomyces viscosus

Pr~eu l tu re de 600 ml en mi l ieu ,, T S B ~ Oxo id p e n d a n t 20 heures ~ 37 °C. Cul tu re darts 15 1 de mi l ieu ( t ryp tone : 75 g ; l evure : 75 g ; s a c c h a r o s e : 75 g ; T w e e n 80 : 7,5 rnl) p e n d a n t 46 heures ~ 37 ~C e t ~ p H 6,8. Darts ces condi t ions , on recuei l le 7 g de cel lules s~ches p o u r u n fe rmen teur .

Pasteurella hemolytica H~

Pr~cu l tu re de 300 ml, 15 heu re s fi 37 °C, avec le m i l i e u ( e x t r a i t d e l e v u r e : 5 g/i, e x t r a i t d e v i a n d e • 5 g/l, s a e c h a r o s e : 3 g/l, p h o s p h a t e disod[-

q u e : 2,5 g/l). Cul tu re dans 15 1 du m ~ m e mil ieu p e n d a n t 16 heu res ~ 37 °C et fi p H T . Apr~s un r e f ro id i s semen t r ap ide vers 15 °C, on recuei l le 10 g de cellules s~ches.

T o u t e s les cu l tu res on t ~t~ recuei l i les p a r centr i- fuga t ion con t inue au m o y e n d ' une supercen t r i fu - geuse Sha rp i e s t o u r n a n t t~ 40 000 tou r s p a r minu te . Les r a c c o r d e m e n t s avec le f e rmen teu r , ainsi que le rotor , son t steri l is6s p a r au toc l avage . Une l~g~re su rp ress ion d 'a i r s ter i le darts le f e r m e n t e u r p e r m e t de chas se r le mi l ieu en con t i nu darts la centr ifu- geuse. Apr~s cent r i fuga t ion , le c o n c e n t r a t bact~- r ien es t e x t r a i t du ro to r darts une ence in te ~ flux l amina i r e afin d '6v i te r rou te c o n t a m i n a t i o n de la b iomasse . Les cellules son t auss i t6 t lav~es p a r rernise en suspens ion darts du t a m p o n Tris-HC1 0,001 M p H 7 c o n t e n a n t NaC1 0,15 M, steri le e t glac~, puis centr i fug~es ~ nouveau .

Les cel lules lav~es son t conserv~es congel~es ba s se t e m p e r a t u r e en a t t e n d a n t d ' e t r e utilis~es. P lus de 1012 ge rmes son t revivi f iables p a r g r a m m e de c o n c e n t r a t humide .

B r o y a g e des ce l lu les b a c t ~ r i e n n e s

Les c o n a e n t r a t s bac t~r iens son t s u s p e n d u s dans du t a m p o n Tris-HC1 0,001 M p H 7 c o n t e n a n t MgC12 0,001 M e t NaC1 0,15 M p o u r avoi r une concen t ra - t ion de 50 g de cel lules s~ches pa r l i tre de suspen- sion.

RIBOSOMES BACTf£RIE1VS ET DEFENSE IMMUNITAI!~E 17

Apr~s une ho m og6n6 i s a t i on r ap ide p a r un dis- pe r seu r Ul t r a -Tur rax , la su spens ion es t s oumise au broyage .

Ce t t e o p e r a t i o n se fa i t ~ une t e m p e r a t u r e inf6- r ieure ~ 12 °C, soi t au m o y e n d ' un g~n~ra teur d 'ul- t r a sons p o u r les pe t i t s vo lumes , soi t dans un ho- mog~n~iseur sous 500 kg de p ress ion p a r c m ~ pou r les vo lumes p lus i m p o r t a n t s .

Preparation de la fraction ribosomale

La suspens ion cel lulaire broy~e es t d6bar rass~e des d~bris pa r deux cen t r i fuga t ions suecess ives 30 000 e t 55 000 g ~ + 4 °C. Le s u r n a g e a n t c o n t e n a n t les r i b o s o m e s e t la f rac t ion soluble es t conserv& Les r i b o s o m e s son t ensu i t e isol6s du s u r n a g e a n t 55 000 g p a r une s~rie d ' u l t r a c e n t r i f u g a t i o n s 125 000 g a l te rn~es avec des l avages p a r le dod6cyl su l fa te de sod ium. Les r i b o s o m e s son t ainsi obte- nus, d6bar rass~s des pro t~ ines adsorb~es .

L ' e n s e m b l e de ces ope ra t i ons es t r~alis~ en t a m - p o n Tris-HC1-MgCl~ de p H 7,2. La p r6sence de MgC12 ~ une mola r i t~ b ien d~finie p e r m e t de pr~- se rve r l ' int~gri t~ du r ibosome .

La p r e p a r a t i o n es t f i na l emen t st~rilis~e p a r fil- t r a t i on sur m e m b r a n e puis lyophilis~e, en ence in te sterile.

Preparation de I'ARN ribosomal

L ' A R N es t e x t r a i t de la su spens ion de r i b o s o m e s a v a n t lyophi l i sa t ion p a r du pheno l ~ 80 p. cen t ~quilibr~ avec un t a m p o n Tris-HC1, EDTA, SDS & p H 7.

Trois e x t r a c t i o n s cons6cu t ives de 10 m n ~ 65 °C son t p ra t iqu~es , la p h a s e a q u e u s e ~ tan t recueil l ie p a r cen t r i fuga t ion ~ 10 000 g e t ~ 0 oC. La p h a s e a q u e u s e finale c o n t i e n t I 'ARN r ibosomal . Le phe- nol res iduel es t e x t r a i t ~ l '6ther. Un b a r b o t a g e d ' azo t e p e r m e t d '~ l iminer l '6 ther res tan t .

L ' A R N es t a lors pr~cipi t~ p a r l '~ thanol ~ ba s se t e m p e r a t u r e en p re sence de NaC1 et le pr~cipi t6 es t lav~ p lus ieurs lois p a r un m~lange alcool-eau-NaC1. Le pr6cipi t~ d ' A R N lav~ es t repr is darts du t a m p o n Tris-HC1-NaC1 p H 8 ~ ra i son de 2 m g d~ARN p a r ml de solut ion.

Purification de ]'ARN ribosomal

Tel qu ' i l e s t o b t e n u p a r e x t r a c t i o n au phenol , I ' A R N r i b o s o m a l peu t , se lon les souches , ~tre c o n t a m i n ~ p a r 4 ~ 5 p. cen t de c a r b o h y d r a t e s . Une pur i f ica t ion s u p p l ~ m e n t a i r e p e r m e t de les ~l iminer de fa¢on p r a t i q u e m e n t quan t i t a t i ve . Ces con tami - n a n t s s o n t s ~ p a r ~ s d e I ' A R N p a r le 2- m e t h o x y ~ t h a n o l en p r e s ence de p h o s p h a t e dipo- t a s s ique 2,5 M. D e u x p h a s e s se f o r m e n t qui son t s~par~es p a r cent r i fuga t ion . La p h a s e sup~r ieure con t i en t I 'ARN tand i s que les c o n t a m i n a n t s pas- sen t darts la p h a s e inf~rieure.

L ' A R N es t pr~cipi t~ de la p h a s e sup~r ieure p a r add i t ion de b r o m u r e de c 6 t y l t r i m 6 t h y l a m m o n i u m .

T A B L E A U I. - - Representation schematique des differentes etapes de preparation de I'ARN ribosomal.

B iomasse - - p r e c u l t u r e en f l acon - - f e r m e n t a t i o n - - c e n t r i f u g a t i o n c o n t i n u e - - tavage p a r c e n t r i f u g a t i o n

C o n c e n t r a t bac te r i en

8 r o y a g e - - d i l u t i o n du c o n c e n t r a t - - h o m o g e n e i s a t i o n - - b royage

Clarification - - & 30 000 puis 55 OOO g f# culots 61imines

R i b o s o m e s - - s e d i m e n t a t i o n s & 125 000 g - - lavages pa r ]e SDS - - rep r i se t a m p o n

- - - - ) . F rac t i on r i bosoma le

ARN r i b o s o m a l - - e x t r a c t i o n au phenol 3 fois - - l avages & I ' e t he r de la p h a s e a q u e u s e - - p r e c i p i t a t i o n pa r I ' e thano l - lavage du p rec ip i t e - - repr ise t a m p o n

-----> ARN r i bosoma l

Pu r i f i ca t i on d e I ' A R N

- - s e p a r a t i o n des c o n t a m i n a n t s p a r K2HPO4- m e t h o x y - e t h a n o l

- - p rec ip i t a t i on de I 'ARN pa r le b r o m u r e de ce ty l t r i - m e t h y l a m m o n i u m darts le s u r n a g e a n t

- - lavage du precipJte pa r ETOH-CH3COONa - - repr ise t a m p o n - d ia lyse - - l y o p h i l i s a t i o n

ARN pur i f i e

Le pr~cipi t~ es t lav~ p lus ieurs lois pa r un m~lange a lcool-eau-CH3COONa, puis d i ssou t dans un t am- pon Tris-HC1 p H 7. Apr~s une d ia lyse d ' une nu i t con t re ce t a m p o n , la so lu t ion e s t st~rilisee p a r f i l t rat ion, puis lyophilis~e.

M~thodes analytiques physico-chimiques

Les m ~ t h o d e s s u i v a n t e s on t ~t~ util is~es p o u r le contrSle des diff~rentes p r e p a r a t i o n s .

Dosage de I'ARN : deux m 6 t h o d e s son t util is~es : - - une m ~ t h o d e s p e c t r o p h o t o m 6 t r i q u e p a r me-

sure de la densi t~ o p t i q u e ~ 260 n m ; - - la m ~ t h o d e ~ l 'orcinol se lon C.V. L u s e n a [3].

Dosage des prot~ines : p a r le r~act i f du b iure t se lon la m 6 t h o d e de A.G. Gornal l , C.A. Bardax i l l et V.V. Dav id [2].

Dosage des carbohydrates : p a r l ' a n t h r o n e sulf~- r ique selon T.A. Sco t t e t E.H. Melvin [6].

Dosage des arnino-acides: p a r le r~act i f ~ la n inhyd r ine selon la m ~ t h o d e de S. Moore e t W.H. S te in [5].

I~ L. DUSSOURD D'HINTERLAND ET COLLABORATEURS

densif~ optique

0,5 ["

o,~ i :~!

lO 20 30 4 0

densit8 optique 6 2 5 4 nm . . . . densit~ opt iqae d 2_80 nm • ~ . carbohydrates

Fig . 2. - - A R N r i b o s o n a l d e Klebsiella p n e u m o n i a e ( e x t r a i t Strep- tococcus pyogenes A ~ p h ~ n o l i q u e ) .

' densit~ optique

0,5

• 0,1

I0 20 30

densit~ opt ique a-~54 nm . . . . densit~ opt ique d 2 8 0 nm . . . . corbohydrafes

Fig . 3. - - A R N pur i t i~ d e Klebsiella pneumoniae .

Les m~thodes de dosage ~ l 'orcinol et ~ l'an- throne sont prat iquees sys t~mat iquement sur rou- tes les preparat ions d'ARN afin de corriger l'inter- f~rence due au ribose darts le dosage des carbohy- drates totaux.

R~sultats analytiques

L'analyse des trois fractions : ribosomes, ARN et ARN purifi~ donne les r~sultats suivants :

Fraction ribosomale: eUe est compos~e pour l 'ensemble des souches ~tudi~es de 70 ~ 75 p. cent d'ARN ; 20 ~ 25 p. cent de prot~ines et 6 ~ 10 p. cent de carbohydrates .

ARN ribosomal : aucune prot~ine n 'est d~celable darts cet te preparat ion, par contre, 4 ~ 8 p. cent de carbohydrates y sont presents.

ARN ribosomal purifi$ : le dosage ~ l 'anthrone de cet te fraction ne r~v~le pas de carbohydrates.

Chromatographie de tamisage mol~culaire

Les diff~rentes fractions obtenues par les m~tho- des p recedemment d~crites ont ~galement ~t~ ~tu- di~es en chromatographie de tamisage mol~cu- laire. Une colonne de biogel A 1,5 m de 2,5 × 82 cm a ~t~ ~quilibr~e avec un t ampon Tris-HC1 0,01 M pH 7,2 con tenan t MgC12 0,01 M e t NaC1 0,15 M.

Les ~chantillons sont mis en solution darts 2 ml de ce tampon, puis passes sur la colonne. La d~tec- tion est effectu~e ~ 280 ~ 254 nm simultan~ment en sortie de colonne. Le f rac t ionnement est r~gl~ 8 ml par tube. Les carbohydrates sont doses darts les f rac t ions par l ' an th rone afin de t race r la courbe correspondante sur les chromatogrammes (fig. 2 et 3).

PREPARATION DE LA FRACTION MEMBRANAIRE

Materiel et m~thodes

Jusqu 'au broyage cellulalre inclus, le proc~d~ est le m~me que pour la preparat ion des ribosomes.

Une centrifu~ation ~ 7 500 g permet d'eliminer les cellules intactes et les d~bris ceUulaires.

Les membranes sont s~diment~es du surnageant 7 500 g h 30 000 g donnant la fraction membranal re brute.

Cette fraction est alors purifi~e par une alter- nance de centrifugations ~ 7 500 et 30 000 g en presence d 'une molarit~ d~croissante en NaC1 (1 M

0,15 M). Le dernier cycle de lavage est falt darts l 'eau distiU~e.

La suspension opalescente obtenue est lyophili- s~e, puis d~lipid6e par deux ~puisements successifs pa r un m~lange ch lo ro fo rme-m~thano l , puis ~ther-~thanol. La poudre r~siduelle est remise en suspension dans l 'eau distillee, puis clarifl~e 7 500 g.

Le surnageant opalescent est recueilli, st~rilis~ par autoclavage et lyophilis~.

M~thodes analytiques

Les m~thodes suivantes ont ~t~ utilis~es :

Recherche de I'ARN: par mesure de la densit~ optique ~ 260 nm compara t ivement fi une gamme s tandard d'ARN.

Dosage des prot~ines : par le r~actif du biuret selon la m~thode de A.G. Gornall, C.A. Bardaxill et V.V. David [2].

RIBOSOMES BACTI~RIENS ET DEFENSE IMMUNITAIRE 19

TABLEAU II. - - Representation schematique de la preparation des fractions membranaires,

Biomasse -- m~me proc~de d'obtention que pour les ribosomes

-Broyage

Clarification - - & 7 500 g en centrifugation continue

S6dimentation - - par une serie de cycles de centrifugations & 7 500 et lavages puis 30 000 g avec lavages interm~diaires

- - dernier cycle'& I'eau distil lee

Lyophil isation

Epuisernents - - par le chloroforrne-m~thsnol - - par I 'ether-6thanol - - par sechage a I'~ther

Clarification - - apres remise en suspension dans I'eau distillee par centri fugation 9, 7 500 g

Lyophilisation ~ Fractions membranaires

Dosage des carbohydrates : par l ' a n t h r o n e sulfu- r i q u e d 'apr~s T.A. S c o t t e t E.H. M e l v i n [6].

Dosage des hexosamines: par la m ~ t h o d e de W.T.S. M o r g a n e t C.J.M. R o n d e l [4].

Dosage des acides uroniques : par la m ~ t h o d e au n a p h t o r ~ s o r c i n o l d e W. D e i c h m a n n [1].

Dosage des acides sialiques : par la m ~ t h o d e de L. Warren ~ l ' ac ide t h i o b a r b i t u r i q u e [7].

R ~ s u l t a t s a n a l y t i q u e s

La f r a c t i o n o b t e n u e a la c o m p o s i t i o n s u i v a n t e :

- - c a r b o h y d r a t e s 18 p. c e n t

- - p r o t ~ i n e s 62 p. c e n t

- - h e x o s a m i n e s 6 p. c e n t

- - a c i d e s u r o n i q u e s 2 p. c e n t

- - a c i d e s s i a l i q u e s 0,5 p. c e n t

- - A R N < 2 p. c e n t

REFERENCES

1. D E I C H M A N N W. - - J. Lab. elin. Med., 1943, 28, 770. 2. G O R N A L L A.G., B A R D A X I L L C.A., D A V I D V.V. - - J. biol.

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586. 5. M O O R E S., S T E I N W.H. - - J . Biol. Chem., 1948, 176, 367. 6. S C O T T T.A., M E L V I N E.H. - - Analyt. Chem., 1953, 25, 1956. 7. W A R R E N L. - - J. biol. Chem., 1959, 234, 8, 1971-1975.