Notes biologiques

MESURE AUTOMATISI E DE LA TRANSFORMATION DES LYMPHOCYTES T

PAR LA METHODE DES MEGAROSETTES LYMPHOBLASTIQUES

N. ABUAF (*), F. LEYNADIER (*), H. LUCE (*) C. PARENT (**) et J. DRY (*)

RI~SUM1~

N o u s a v o n s ntis au po in t une nouvelle mSthode per- me t t an t de quan t i f i e r le degr$ de s t imulat ion des lym- phocytes T : ceux-ei, apr~s t r ans fo rma t ion , f o r m e n t des m~garoset tes avee les globules rouges de m o u t o n . Celles-ei ont u n e v i t e s s e de sSdimenta t ion tr~s $1evSe. SSpar~es des rosettes E par sSdimentat ion diff~rentielle, l e s mSgaroset tes sont hSmolysSes et la densit$ opt ique e s t mesnr~e. Les rSsuhats m o n t r e n t une bonne corr6- lat ion avee ceux obtenus pa r le TTL uti l isant l ' incor- po ta t ion de thymid ine tritiSe. Cette t echnique peut ~tre appl iquSe en immunolog ie el inique .pour l '$ tude i n v i t r o des affections immuni ta i res et aussi pou r tes- ter la senSibilisation d ' u n individu h nn ant igone donn$.

SUMMARY

Automated measurement of the transformation oJ T lympho- cytes by the method of lymphoblastic megarosettes. - - We have developed a new method permitting quantification of the degree of stimulation of T lymphocytes : the latter, after transformation, form megaroset'tes with sheep red cells. These have a very high sedimentation rate. After separation from E rosettes by differential sedimentation, the megarosettes are haemolysed and their optical density is measured. The results show good correlation with those obtained by the lymphocyte transformation test utilizing the incorporation of tritiated thymidine. This technique may be applied in clinical immu- nology for the in vitro study of immune disorders and also to test the sensitivity of an individual to a given antigen.

La cuhure de cellul'es a ouvert de grandes pers- pectives ~n immunologic notamment darts l'dtude de la physiologie des lymphocytes humains. C'est ainsi que le test de transformation lymphoblastique (TTL) apprdeie, in vitro, la sensibilisation d'un in- dividu vis-h-vis d'un antigSne [9, 11, 15].

Pour stimuler un pourcentage dlevd de lympho- cytes, on utilis~ des initog~nes ; eertains d'entre eux sont plus ou moins spdcifiques des lymphocytes T (thymo-ddpendants) ou des lymphocytes B (burso- ddpendants) [3, 8]. Cela a permis eclalrclr le d ' " " "

mdcanisme de certaines maladies du syst~me im- munitaire [8]. Cependant, les techniques utilisdes aetuellement ne permettent pas d'identifier avec certitude 1' " " formds, ongme T ou B des lymphoeytes trans-

Rdcemment, certains travaux [12, 13, 14] ont l ' " soulignd existence, chez les atopiques, d 'un d~fi-

cit en lymphoeytes T ; il nous a sembld utile que

(*) Centre d'Allergie (pr DRY), HSpitaI Rothschild, 43, boulevard de Picpus, 75012 PARIS (France).

(**) Service d'Immunoloqie, Universit~ Laval, QUEBEC (Canada).

Re~u le 17 noTembre 1977.

l'immuno-allergologie puisse disposer d'un test per- mettant d'explorer in vitro la transformation de ces derniers en prdsence d'antig~ne ou de mitog~ne.

Pour eela, nous avons mis h profit la propridtd qu'ont l'es lymphocytes T humains de fixer sur leur membrane des globules rouges de mouton (GRM), phdnom~ne que l'on ddsigne par le terme rosette drythrocytaire (rosette E) [4, 5, 10].

Partant de lh, il a dtd observd par Fun d'entre nous [1, 2] qu'apr~s stimulation en culture, cer- rains lymphoblastes T acquiSrent la capacitd de former des rosettes gdantes atteignant 80 h 100 t~ de diam~tre avee 7 ou 8 couches de GRM. La nu- mdration de ces mdgarosettes (MR) quantifie le de- grd de stimulation d'une culture avee une sensibi- litd comparable h la mdthode utilisant l'ineorpora- tion de thymidine tritide (T3H) dans I'ADN eelIu- laire.

ABUAF N., LEYNADIER F., LUCE H., PARENT C., DRY J. - - I Mesure automatls6e de ]a transformation des Iyrnphocytes T par ]a m~thode des m6qarosettes lymphoblastiques. Re-c. fran~. AllerqeI., 1977, 17 (n ° 5), 275-278.

276 • N. ABUAF ET COLLABORATEURS/

Cependant, ce procddd adaptd h l '&ude de la phy- siologic du lymphocyte T, souffrait d 'un dcueil g~nant l'application pratique : la numdration des MR sur cellule de Malassez 'est longue et comporte une part de subjectivitd. Aussi, avons-nous mis au point une technique automatisde de lecture, basde sur la vitesse de sddimentation diffdrente des MR et des rosettes E.

MATERIEL ET METHODES

PREPARATION DES LYMPHOCYTES

Le sang est prdlevd sur EDTA (0,5 ml h 2,7 p. cent pour 9,5 ml de sang) (Thouzart et Matignon), centrifugal sur Lymphoprep (Eurobio) [7] . La cou- che de lymphocytes est prdlevde, lavde trois fois avec du liquide de Hanks (Sorga).

MILIEUX ET PRODUITS UTILISI~S

Le RPMI 1640, la concanavalin A, le tampon Hepes, la glutamine, la pdnicilline et la strcptomy- cine nous ont 6t6 livr6s par Flobio.

Le PPD (extrait prot6ique de la tub'ereuline) nous a 6t6 fourni par l 'Institut Pasteur Produc- tion).

MISE EN CULTURE

Les lymphocytes sont mis en suspension h la concentration de 106 cellules/ml dans du RPMI 1540 contenant 25 mM de tampon Hepes, 2 mM de L-glutamine, 100 000 U de pdnicillinc, 1 g de streptomycinc par litre et 10 p. cent de s~rum AB.

On met 1 ml de la suspension par tube de cul- ture (Block) et on incube h 37 °C dans une atmo- sphere contenant 5 p. cent de CO2.

FORMATION DES MI~GAROSETTES

Lcs cultures sort lavdes deux lois ; sur le culot cellulaire, on rajoute 25 ~tl de culot globulaire di- lud au 1/5 et 25 lxl de sdrum AB absorb~ sur GRM d6eompldmentd et dilud au 1/4.

On laisse une heure h 37 °C et une nuit h la tem- pdrature du laboratoire.

LECTURE AU SPECTROPHOTOMi~TRE

La suspension GRM-lymphoeytes contenant les rosettes est s~dimentde sur du sdrum absorbd sur GRM.

Le eulot est h~molys~ avec 0,35 ml de HC1 N/10 et la densit~ optique (DO) est d&erminde h 400 nm, longueur d'onde optimale pour d~terminer la quan- tit~ d'hdmoglobine prdsente-

La lecture est faite avee une microeuve (I = 10 ram) dans un speetrophotom~tre GiHord

300 T.

FI6. 1. - - Mdgarosette et rosette E. Apr~s sept jours de sti- mulation in vitro par la concanavalin As les lymphocytes ont 6t6 lav6s et mis en pr6scnce de globules rouges de mou- ton (GRM) une heure h 37 ° et une nuit ~t la temp6ra~ture du laboratoire. Certains lymphoblastes forment des rosettes h plusieurs couches de GRM.

MESURE DE L'INCORPORATION DE THYMIDINE TRI-

TIC.E

16 hcures avant l 'arr6t de la culture, on rajoute 1 ~tCi de thymidine tritide (25 Ci/mM-CEA) par millilitre de culture. On prdcipite I'ADN avec de l'aeide triehloraedtique et on lave trois lois. On dissout le culot avec du solu~ne (Packard) et on le mdlange axree un liquide scintillant (5 mg de 2,5 diphdnyloxazol par litre de toluene) et on d& termine le nombre de coup par minute (CPM) dans un eompteur Triearb (Packard).

R¢SULTATS

DESCRIPTION ET CONDITION D'APPARITION DES MR

Les MR sont des rosettes g6antcs quc forment avec l'es GRM unc sous-population de lymphocytes T transformds (fig. 1). Elles se diffdrcncient des ro- settes E par l'exisVence d'un hombre 61ev6 de cou- ches concentriques de GRM. Elles sort pr6sentes 48 heures apr~s stimulation et leur hombre s'accrolt jusqu'au 7 ~ jour ; par contre elles sort en quantitd n6gligcablc dans les cultures non stimuldes.

QUANTIFICATION DU DEGRI~ DE STIMULATION D'UNE

CULTURE PAR LA DO DES M R

Les lymphoeytes du sang p6riph6rique de trois sujets normaux h intradermo-r6action positive h 10 U de tuberculine sont stimul6s in vitro par la Con A e t le PPD aux doses optimales.

Rev. fran~. Allergol., 1977, 17, 5

/LYMPHOCYTES T • 277

T A B L E A U I

COMPARAISON DES INDEX DE STIMULATION OBTENUS PAR L'INCORPORkTION DE TKYMIDINE TRITI~E (Tall)

~T LA DEIWSIT~ OPTIQUE DES M~GAROSE~TES (MR)

5" ~n

QUL'£UR]~ STIMUL]~E

:PAR

T4moin PPD

Con. A

Tdmoin PPD

Con. A

T6moin Con. A

x

6,1 59 64

¢2 (9

96' 53 70 00~ 58 98 444

68 47 87 67

2,5 53 50

1 248 77 720

N F

865 62 176

z

72 101

62 N F

72

DO : densitd optique.

DOS-DOT : DO de la culture st imul4e - - DO de la cul ture t4moin.

DO xlO0

8 0 -

6 0 -

4 0 -

20- t ' ~" - C o n A

• . . . . . ~PPD

I I I I I - - Q2 2 20

l o g dose pg /m l

FIG. 2. - - Effet de la concentration du stimulus sur la densit4 optique des mdgarosettes. On a travaill6 darts les m~mes conditions techniques que le tableau I avec diffdrentes concentrations de PPD et de concanavalin A (Con. A) . Les doses sont exprimdes en logarithme (log). T = culture tdmoin.

Rev. ]rant. Allergol., 1977, 17, 5

106 lymphocytes de sujets normaux h IDR h la tuberculine positive, ont 6t6 cuhivds dans 1 ml de milieu de culture en pr4sence de doses optimales de PPD et de coneanavalin A (Con. A) . La T3H a 4t4 rajoutde h la 48 ° heure et les cul- tures art&des h la 72 ~ heure.

AprSs extraction de I'ADN, le nombre de coups par mi- nute CPM est ddtermind.

Pour les mdgarosettes, les cultures sont arrftdes au 6" jour, apr~s lavage, raises en prdsence de globules rouges de mou- ton (GRM) une heure h 37 ° C et une nuit h la tempdrature du laboratoire. Le lendemain, le m41ange lymphocyte-GRM est sddiment6 sur 200 ~1 de s4rum dans un tube de Beckman pendant 30 minutes. Le culot est hdmolys6 avec du Hcl ~ / 1 0 et la DO est d4terminde h 400 nm.

Les rdsultats obtenus sont compards en ddtermi. nant la DO des MR, avec l'incorporation de T3H. Dans la premiere mdthode, le mdlange lymphoey. tes cuhiv4s-GRM est d4pos6 sur sdrum pendant un temps suffisant pour la sddimentation des MR ; ensuite on ddtermine la DO du culot, tr~s enriehi en MR. Les deux techniques donnent des r6sultats qui concordent de fa~on trSs satisfaisante (ta- bleau I).

EFFET-DOSE DU STIMULUS SUR LES MR

La stimulation varie avec la concentration d'an. tig~ne ou de mitog~ne.

Pour la Con. A, l'optimum est proehe de 2 ~tg/ml et pour le PPD compris entre 7 et 20 ~tg/ml (fig. 2). Ces valeurs sont comparables h celles trouvdes par la mesure de l'ineorporation de TZH.

DISCUSSION

La formation de MR en prdsence de GRM par des ]ymphoeytes stimulds in vitro est un phdno- mbne rdeemment ddcouvert [1, 2] .

Seuls, les lymphoeytes T sont capables, apr~s transformation en cellules blastiques, de s'entourer de plusieurs couches eoncentriques de GRM et, par consdqn'ent, cette mdthode s'av~re particulibrement adaptde ~ l'&ude de la physiologic du lymphocyte T par le lipopolyoside (LPS) [6] ou par l'anti- immunoglobuline totale (non publid).

La nature de la liaison entre le lymphocyte T et les GRM les plus dloignds demeure hypothdtique aprSs 4tude au microscope 61ectronique (*).

La mesure de la DO du eulot apr~s sddimentation du mdlange lymphoeytes cultivds-GRM est utilis4e pour quantifier le degr4 d'e stimulation d'une cul- ture. La corrdlation avee l'incorporation de Tall est exeellente et elle prdsente sur cette derni~re eertains avantages : elle est spdcifique des lympho. cytes T ; les rdsuhats sont obtenus en valeur abso.

(*) Travail falt en collaboration avec le D r G. Pelletier de l'Universit6 Laval, Qu6bec (Canada).

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lue, ce qui n 'es t pas le cas pour l ' incorpora t ion de T3H. E n effet, la DO est fonet ion de la quant i t6 d 'hdmoglobine qui , elle-m6me ddpend d u nombre de GRM fix6s par les lymphoeytes : c'est ainsi que 106 lymphocytes cultiv6s pendan t sept jours fixent apr~s sddimentat ion 7 h 8 X 106 GRM de plus que la cul ture non stimulde. Cette diff6rence est due essentiel lement h l ' augmen ta t ion du nombre de GRM fix6s par certains lymphocytes T, dont les MR.

De plus, elle ne ndcessite pas u n appareillage eofiteux et n'e pr4sente aueun risque d ' i r rad ia t ion ou de pol lut ion.

Elle peut 6tre utilis6e pour reehercher in vitro la sensibil isation d ' u n ind iv idu h u n antigone, dont une applicat ion prat ique pourra i t 6tre l '6tude d ' une allergie mddieamenteuse, de suivre la t ransforma- t ion des lymphocytes T sous l 'effet des mitog~nes dans eertaines affections a t te ignant le syst~me im- m u n i t a i r e [ 1] , de tester l 'histoeompatibil i t6 [ 1, 2 ] par la cul ture mixte de lymphocytes.

REMERCIEMENTS

iNous remercions Mae J. CARABASSE pOUr son excellente assistance technique et M TM M.-C1. D~FER pour la r6alisation mat6rielle du manuscrit.

K ~ P ~ E N C E S

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