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MÉTHODE CINÉTIQUEappliquée à la reconnaissance isomérique
T. Fouquet - groupe masse – méthode cinétique
1
10 juillet 2009
MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
2
M H+
MH+
+ AP = -ΔHréaction
A H+
H2B iAH+
B i +k1
HBi+
A+k2
AH+
B i +
HBi+
A+
A H+
H2B i
D e0
A ≈ Bi
(Structure et interactions)
(voies uniques de fragmentation)
~ fonctions de partitions
Méthode de mesure de propriétés et données thermochimiques
Cinétiques de dissociations compétitives d’un cluster formé :De l’analyte AD’un composé de référence Bi
Nécessité d’une fragmentation limitéeLiaisons faiblesEnergie de collision faible
T. F
ouquet - M
éth
ode cin
étiq
ue a
ppliq
uée à
la d
istinctio
n
isom
ériq
ue
MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD (2)
Tracé (« kinetic method plot »)
Différentes versionsStandardIsentropique
Erreur sur la variation d’entropie constante Conservation de la linéarité
Etendue Mesure de l’entropie pour chaque point Tracés modifiés pour éliminer les corrélations Nécessité de données sur les variations d’entropie des
références
3
ln(k2/k1)
AP(Bi)
T. F
ouquet - M
éth
ode cin
étiq
ue a
ppliq
uée à
la d
istinctio
n
isom
ériq
ue
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE
4
[MII + réf*2 + sucre – H]+
ré f*
M II
sucre
ré f*
sucre
M IIré f*
- H+
T. F
ouquet - M
éth
ode cin
étiq
ue a
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uée à
la d
istinctio
n
isom
ériq
ue
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (2)
Dissociation du cluster primaire (trimérique)
5
ré f*
sucre
M IIré f*
- H+
ré f*M IIré f*
- H+
M IIré f* sucre
- H+
k2
k1
R =k1
k2
[M II + réf*2 - H ]+
[M II + ré f + sucre - H ]+=
T. F
ouquet - M
éth
ode cin
étiq
ue a
ppliq
uée à
la d
istinctio
n
isom
ériq
ue
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
Modélisation des cinétiques de dissociation par l’abondance des ions fragments.
6
100 200 300 400 5000.0
2.0e+5
4.0e+5
6.0e+5
8.0e+5
1.0e+6
1.2e+6
1.4e+6 [MnII + Asp2 + sucre – H]+
- réf*
- sucre
R =[M II + Asp2 - H ]+
[M II + Asp + fru - H ]+
[MnII + Asp2 – H]+
[MnII + Asp + sucre – H]+
T. F
ouquet - M
éth
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ue a
ppliq
uée à
la d
istinctio
n
isom
ériq
ue
0
2e+5
4e+5
6e+5
8e+5
1e+6
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
Par exemple D-gal et D-fru discriminés par Mn – L-Asp
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T. F
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ue a
ppliq
uée à
la d
istinctio
n
isom
ériq
ue
0.0
2.0e+5
4.0e+5
6.0e+5
8.0e+5
1.0e+6
1.2e+6
1.4e+6
D-gal
R = 0,40
D-fru
R = 0,88
DANS NOTRE CAS
Métal :Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn
RéférencesAcides aminés
Similitudes structurales
Interaction Pi
AnalytesMonosaccharides : glucose, galactose et fructose
8
NH2
OH
O
O
OH
L - acide aspartiqueAsp
NH2
OH
O
OOH
L - acide g lu tamique
G lu
NH2
OH
O
ONH2
L - g lu tamine
G ln
NH2
OH
O
O
NH2
L - asparagine
Asn
NH2
OH
O
OH
L - thréonine
Thr
NH2
OH
O
OH
L - serine
Ser
NH2
OH
O
L - phényla lan ine
Phe
O
OHH
HH
OHOH
H OH
H
OH
O
OHH
HOH
HOH
H OH
H
OH
O
OHOHH
H
OHH
OH H
HOH
T. F
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istinctio
n
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ue
QUELQUES SYSTÈMES DISCRIMINANTS
métal (II)Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Aspgal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phegal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
perte de sucre quasi unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi exclusive
perte de sucre quasi exclusive
perte de sucre quasi exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Sergal
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
2,32 +/- 0,04fragmentation secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln perte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thrgal
perte de réf* uniquement0,04(2) +/- 0,006
non répétablePas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01pas de distinction, perte de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glugal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate faiblement formé)
peu répétable (chélate faiblement formé) protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
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ré f*
sucre
M IIré f*
- H+
EVOLUTIONS
Trois problèmes :Pas de formation du cluster trimériquePas de distinction isomérique, absolue ou
partielleFragmentation secondaire forte (> ion fragment attendu)
Utilisation d’un ligand fixe
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ré f*
sucre
M IIL fixe - H |+
unité fixe
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LIGAND FIXE
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[Fe – Asn2 – glc – H]+[Fe – Asn2 – gal – H]+[Fe – Asn2 – fru – H]+
– gal– fru– glc
– Asn
Pour le déterminerPar exemple : Asn pour Fe
Perte nulle ou faible de réf* Lfixe
Perte nulle de Lfixe avec une autre réf*
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métal (II)Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Aspgal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phegal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
perte de sucre quasi unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi exclusive
perte de sucre quasi exclusive
perte de sucre quasi exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Sergal
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
2,32 +/- 0,04fragmentation secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln perte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thrgal
perte de réf* uniquement0,04(2) +/- 0,006
non répétablePas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01pas de distinction, perte de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glugal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate faiblement formé)
peu répétable (chélate faiblement formé) protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
métal (II)Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Aspgal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phegal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
perte de sucre quasi unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi exclusive
perte de sucre quasi exclusive
perte de sucre quasi exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Sergal
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
fragmentation secondaire forte
2,32 +/- 0,04fragmentation secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln perte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusiveperte de sucre quasi
exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thrgal
perte de réf* uniquement0,04(2) +/- 0,006
non répétablePas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01pas de distinction, perte de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glugal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate faiblement formé)
peu répétable (chélate faiblement formé) protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
100 200 300 400 5000.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
Formation du chélateRéf* = D – fucose (déoxy – galactose)Cu(Asn)fucose–sucre et Cu(Phe)fucose-sucre OK
Diminution des fragmentations secondaires Renforcement des discriminations
Fe – Thr : pas de distinction fru / glc Rgal = 0,06 Rfru = 1,2 / Rglc = 1
Fe(Asn)Thr : OK ! Rgal = 0,17 Rglc = 1,2 Rfru = 4,0
Inconvénient : faible abondance du cluster100 200 300 400 500
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
6e+5
[FeII + L-Thr2 + D-gal – H]+[FeII + L-Asn + L-Thr + D-gal – H]+
LIGAND FIXE
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QUANTIFICATION EN MÉLANGE
D’après Cooks :Méthode « intrinsèquement » linéaire(si l’on respecte les limitations :
Proximité structurale des composés Pas de barrière énergétique)
X et Y deux composés en mélangeRx et Ry facteurs de reconnaissance
Possibilité de quantifier N composés en mélange si N – 1 systèmes discriminants
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QUANTIFICATION – QUELQUES PROBLÈMES
DéviationsPositivesNégativesInflexion ?
Variable avec les sucres et les systèmes
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Cu – Ser – gal/fru
Cu – Ser – gal/glc
Co – Thr – gal/fru
T. F
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QUANTIFICATION ?
Trois conditions nécessaires et suffisantesSystème discriminantTrimère « suffisamment » formé
erreur absolue
Facteurs « suffisamment » différents Erreur relative, ou incidence de l’erreur absolue
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Co – Thr – glc/fru
Rglc = 1,34
Rfru = 1,80
Rfru = 23,3
Rgal = 2,38
Cu – Ser – gal/fru
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NON LINÉARITÉ DE LA MÉTHODE
Trois causes possibles (pour le moment)Entropie négligée
Interactions intramoléculaires (liaison H) Dissemblance réf* / analyte
Pb : impossibilité de correction « formelle » sans références
(interaction « métallique » et « moléculaire »)
Modification ou différence de rendement de formation du trimère en mélange selon l’analyte Exaltation ou diminution « artificielle » du ratio
Modification de R en présence d’un autre sucre Utilisation de sucres marqués 13C 16
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VARIATION DE RSUCRE ?
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Ln(Rfru marqué)
Ln(Rgal)
xgal
xgal
Utilisation d’un sucre marqué : 13C – fructose
Mélange gal – 13C-fru Clusters en m/Z et m/Z + 1
Fragmentation m/Z Rgal
Fragmentation m/Z + 1 R13C-fru et R13C, 15N, 2D-gal
Corrections : Isotopes naturels de gal R13C – fru / Rfru
Exemple (le seul ) : Cu – L-Ser
VARIATION DE RSUCRE (2)
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ln Rmélange – Cu-Ser
xgal
Modélisation grossière par une
parabole
Correction R13C – fru / Rfru
Abondance naturelle
a = -0.04b = 0.908
a’ = -1.93b’ = 3.14
~ 1.9 ~ -4.2 ~ 3.1
A PRÉCISER RIGOUREUSEMENT
Contrairement à ce qui a été fait ici…
R13C – sucre / Rsucre ? Simple rapport dans le cas précédent…
Abondance naturelle des isotopes de réf*, Lfixe et sucre non marqué
(Soit les deux corrections apportées !)
Et travailler avec d’autres systèmes et d’autres sucres…
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istinctio
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