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224 PRELIMINARY NOTES VOI 30 (1958) Nouveaux essais de purification de la lipase pancr~tique de porc Nous avons r~cemment purifi~ de fa~on tr~s notable la lipase pancrratique de porc I en soumettant les extraits aqueux de pancrratine ~ une srrie de precipitations fractionnres (SO4Ams, acrtone) et h une 61ectrophor~se de zone sur amidon daBs un tampon M/4o en vrronal pH 8.0 et M/zoo en CaC1 v Le taux de purification obtenu, calcul6 par rapport aux extraits, 6tait de 35 fois avec un rendement de 3 ° % et de 63 lois avec un rendement de 5 %. La technique de purification a 6t6 maintenant am61iorre grace ~ : (I) une meiUeure prrpazation de la pancrratine; (2) l'adsorption srlective de la lipase sur phosphate tricalcique (adsorption en solution aqueuse, 61ution par le phosphate disodique M/5o) et l'61imination d'impuretrs protriques par un gel d'alumine C 7 dabs le citrate M/io pH 5.5; (3) des 61ectrophor~ses de plus longue durre (4 ° h) dabs un gradient de potentiel plus 61ev6 (7.8 V/cm) au sein d'un tampon acide (acrtate M[4o pH 5.25). DaBs ces conditions, le taux global de purification drpasse 8.o lois (plus de 35o lois par rapport ~ la pancrratine) avec un rendement de 4 ° %. Au cours d'une nouvelle 61ectrophor~se de 3 6 h ~ pH 8.o, les prrparations ainsi purifires donnent un pic unique et symrtrique, dont toutes les fractions poss~dent la m~me activit6 sprcifique. Ces essais permettent 6galement de mieux drfinir les vrritables substrats de la lipase pan- crratique. Une simple percolation ~ travers l'amidon h pH 5.25 fait disparaitre l'activit6 sur les solutions de Tween-2o z et de butyrate de mrthyle alors qu'elle n'affecte pas l'activit6 proprement lipasique sur la trioMine en 6mulsion. L'61ectrophor~se ~ pH 8.0 ou 5.25 srpare tr~s nettement la lipase et les estrrases non sprcifiques agissant sur les solutions de butyrate de mrthyle ou d'acrtate de p-nitrophrnol a. Par contre, A la fin d'une 61ectrophor~se de longue durre g pH 5.25, les activitrs sur les 6mulsions de butyrate,* laurate et olrate de mrthyle, de laurate de p-nitrophrnol s, de triacrtine* et de tributyrine se trouvent encore exactement sous le pic de la lipase. Nranmoins, ces activitrs sont comparativement faibles (2- 4 % de l'activit6 sur la trioMine en 6mulsion), saul dans le cas de la triacrtine et de la tributyrine (respectivement, 34 et I75 %). De tels rrsultats confirment la conception 4 selon laquelle la lipase hydrolyse exclusivement les esters en 6mulsion. Ils montrent que: (I) Contrairement ~ ce que l'on pense trop souvent, les esters en solution (Tween-2o, acrtate de p-nitrophrnol, etc.) ne peuvent en aucun cas ~tre considrrrs comme des substrats lipasiques. (2) La lipase agit faiblement sur les 6mulsions d'esters de mono- alcools et de phrnols, la longueur de la chaine acyle ayant beaucoup moins d'importance que l'rtat physique sous lequel se prrsente l'ester (rmulsion ou solution). (3) Les substrats convenant le mieux h l'rtude de la lipase sont les 6mulsions de triglycrrides, en particulier de tributyrine et de triglycrrides g longues cha~nes. Tousles travaux concernant la lipase pr~tent A discussion 5 d~s que les principes prrcrdents ne sont pas respectrs. L. SARDA Laboratoire de Chimie Biologique, Facult~ des Sciences, G. MARCHIS-MOuREN Marseille (France) P. DESNUELLE 1 L. SAROA, G. MARCHIS-MouREN, M. J. CONSTANTIN ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Aaa, 23 (1957) 264- s R. A. BOISSONNAS, Helv. Chem. Acta, 31 (1948) 1577. s C. HUGGINS ET J. LAPIDES, J. Biol. Chem., 17o (1947) 467 • 4 L. SARDA ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Acta, (sous presse). 5 M. M. NACHLAS ET R. BLACKBURN, J. Biol. Chem., 230 (1958) lO51. Re9ue le 4 juillet, 1958 • Les 6mulsions d'esters solubles sont prrpar6es en utilisant plus de substance qu'il n'en faut pour saturer les solutions. • * La lipase agit A concurrence de 2 % sur la triac~tine en solution. La nature triglyc~ridique du substrat explique sans doute cette exception.

Nouveaux essais de purification de la lipase pancréatique de porc

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Page 1: Nouveaux essais de purification de la lipase pancréatique de porc

224 PRELIMINARY NOTES VOI 30 (1958)

Nouveaux essais de purification de la lipase pancr~tique de porc

N o u s a v o n s r ~ c e m m e n t purifi~ de fa~on tr~s no tab le la l ipase p a n c r r a t i q u e de porc I en s o u m e t t a n t les ex t r a i t s a q u e u x de p a n c r r a t i n e ~ u n e sr r ie de p rec ip i t a t ions f r ac t ionnres (SO4Ams, acr tone) et h une 61ectrophor~se de zone su r a m i d o n daBs u n t a m p o n M/4o en v r rona l p H 8.0 e t M/zoo en CaC1 v Le t a u x de pur i f ica t ion ob tenu , calcul6 pa r r a p p o r t a u x ex t ra i t s , 6 ta i t de 35 fois avec u n r e n d e m e n t de 3 ° % et de 63 lois avec u n r e n d e m e n t de 5 %.

La t e c h n i q u e de pur i f i ca t ion a 6t6 m a i n t e n a n t am61iorre grace ~ : (I) une meiUeure p r r p a z a t i o n de la p a n c r r a t i n e ; (2) l ' ad so rp t ion s r lec t ive de la l ipase sur p h o s p h a t e t r ica lc ique (adsorp t ion en so lu t ion aqueuse , 61ution pa r le p h o s p h a t e d isodique M/5o) et l '61iminat ion d ' i m p u r e t r s p ro t r iques p a r u n gel d ' a l u m i n e C 7 dabs le c i t r a t e M/io p H 5.5; (3) des 61ectrophor~ses de p lus longue du r r e (4 ° h) dabs u n g r a d i e n t de po ten t i e l p lus 61ev6 (7.8 V/cm) au sein d ' u n t a m p o n acide (acr ta te M[4o p H 5.25). DaBs ces condi t ions , le t a u x global de pur i f ica t ion d rpa s se 8.o lois (plus de 35o lois p a r r a p p o r t ~ la panc r r a t i ne ) avec u n r e n d e m e n t de 4 ° %. Au cours d ' u n e nouvel le 61ectrophor~se de 3 6 h ~ p H 8.o, les p r r p a r a t i o n s ainsi pur i f i res d o n n e n t u n pic u n i q u e e t s y m r t r i q u e , don t t ou t e s les f r ac t ions poss~den t la m ~ m e ac t iv i t6 sprcif ique.

Ces essais p e r m e t t e n t 6ga l emen t de m i e u x drf ini r les v r r i t ab le s s u b s t r a t s de la l ipase pan - c r r a t ique . U n e s imple perco la t ion ~ t r a v e r s l ' a m i d o n h p H 5.25 fai t d i spara i t re l ' ac t iv i t6 sur les so lu t ions de Tween-2o z et de b u t y r a t e de m r t h y l e alors qu 'e l le n 'a f fec te pas l ' ac t iv i t6 p r o p r e m e n t l ipas ique su r la tr ioMine en 6muls ion . L '61ectrophor~se ~ p H 8.0 ou 5.25 s rpa r e tr~s n e t t e m e n t la l ipase et les e s t r r a ses non sprc i f iques ag i s s an t sur les so lu t ions de b u t y r a t e de m r t h y l e ou d ' a c r t a t e de p - n i t r o p h r n o l a. P a r contre , A la fin d ' u n e 61ectrophor~se de longue du r r e g p H 5.25, les ac t i v i t r s su r les 6muls ions de b u t y r a t e , * l au r a t e et o l ra te de m r t h y l e , de l au ra te de p -n i t r oph rno l s, de t r i a c r t i ne* et de t r i b u t y r i n e se t r o u v e n t encore e x a c t e m e n t sous le pic de la lipase. N r a n m o i n s , ces ac t i v i t r s s o n t c o m p a r a t i v e m e n t faibles (2- 4 % de l ' ac t iv i t6 sur la tr ioMine en 6mulsion) , s au l dans le cas de la t r i a c r t i ne et de la t r i b u t y r i n e ( r e spec t ivement , 34 et I75 %).

De te ls r r s u l t a t s conf i rment la concep t ion 4 se lon laquelle la l ipase h y d r o l y s e e x c l u s i v e m e n t les es te rs en 6muls ion . Ils m o n t r e n t que : (I) C o n t r a i r e m e n t ~ ce que l 'on pense t r o p souven t , les es ters en so lu t ion (Tween-2o, a c r t a t e de p -n i t rophrno l , etc.) ne p e u v e n t en a u c u n cas ~tre cons id r r r s c o m m e des s u b s t r a t s l ipas iques . (2) La l ipase agi t f a ib l emen t su r les 6muls ions d ' e s t e r s de mono- alcools e t de phrno ls , la l ongueur de la cha ine acyle a y a n t b e a u c o u p mo ins d ' i m p o r t a n c e que l ' r t a t p h y s i q u e sous lequel se p r r s e n t e l ' es te r ( rmuls ion ou solut ion). (3) Les s u b s t r a t s c o n v e n a n t le m i e u x h l ' r t u d e de la l ipase s o n t les 6muls ions de t r ig lycrr ides , en par t icu l ie r de t r i b u t y r i n e et de t r ig lyc r r ides g longues cha~nes. T o u s l e s t r a v a u x c o n c e r n a n t la l ipase p r~ ten t A d iscuss ion 5 d~s que les p r inc ipes p r r c r d e n t s ne son t pas respec t r s .

L. SARDA Laboratoire de Chimie Biologique, Facult~ des Sciences, G. MARCHIS-MOuREN

Marseille (France) P. DESNUELLE

1 L. SAROA, G. MARCHIS-MouREN, M. J . CONSTANTIN ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Aaa, 23 (1957) 264-

s R. A. BOISSONNAS, Helv. Chem. Acta, 31 (1948) 1577. s C. HUGGINS ET J. LAPIDES, J. Biol. Chem., 17o (1947) 467 • 4 L. SARDA ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Acta, (sous presse). 5 M. M. NACHLAS ET R. BLACKBURN, J. Biol. Chem., 230 (1958) lO51.

Re9ue le 4 juillet , 1958

• Les 6muls ions d ' e s t e r s solubles son t p r rpa r6es en u t i l i san t p lus de s u b s t a n c e qu ' i l n ' en f au t p o u r s a tu r e r les so lu t ions .

• * La l ipase agi t A concur rence de 2 % sur la t r iac~t ine en solut ion. La n a t u r e t r iglyc~ridique du s u b s t r a t expl ique sans dou te ce t te excep t ion .