Biochemical Pharmacology, Vol. 24, pp. 1397 1399. Pergamon Press, 1975. Printed in Great Britain.

RECHERCHE DE LA CAUSE DE L'INACrlVITE DE L'HYDROXYPENTOBARBITAL

P. ALLAIN, P. CAILLEUX, G. LEBLONDEL, A. PREMEL-CABIC et A. CAILLEUX

Laboratoire de Pharmacologie C.H.U., 49036 Angers, France

(Received 26 August 1974; accepted 11 February 1975)

Abstract--Hydroxypentobarbital, the major metabolite of pentobarbital, given to animals in high doses has no hypnotic properties. This fact could be explained by lack of entry into brain from blood or by true inactivity in spite of entry into brain.

The study of concentration of hydroxypentobarbital in liver and brain measured by gas chromat- ography after an administration of a high dose (800 mg/kg intraperitonealy) has shown that penetration in brain is slow and in addition that even when its concentration in brain is high (190 #g/g), hydroxypen- tobarbital is inactive as an hypnotic.

Dickert et al. [1] ont montr6 que l 'hydroxypentobar- bital, reconnu comme le principal m6tabolite du pen- tobarbital, est d6nu6 d'effet hypnotique m~me ~ doses tr6s 61ev6es. Cette absence d'effet hypnotique de l'hyd- roxypentobarbital peut s'expliquer soit par un pass- age insuffisant dans le cerveau, soit par une inactivit6 r6elle en depit du passage dans le cerveau.

En 6tudiant l'6volution du taux d'hydroxypentobar- bital dans le cerveau apr6s administration d'une dose ~lev6e, nous nous proposons de r6pondre fi cette ques- tion.

/t sec et m6thyl6/~ 57 ° pendant 4 min par 0,l mt de sulfate dim6thylique en pr6sence de 2 ml d'une solu- tion m6thanolique/~ 10~ d'eau satur6e en carbonate de potassium.

L'excas de m6thanol est 6vapor6 et les barbituri- ques sont extraits deux fois par 1 ml d'hexane en pr6sence de 1 ml de tampon ac6tate pH 6. Apr~s 6vaporation de l'hexane, le r6sidu est repris par 100/A de BSTFA et port6 ~ l'6tuve ~t 70 ° pendant 15min. Apr6s refroidissement, on injecte 1 #1 de la solution

M E T H O D E S

NOUS envisagerons la synth~se et le dosage de l 'hydroxypentobarbital avant de d6crire l'exp~ri- mentation animale proprement dite.

Synth~se de l'hydroxypentobarbital. La synth~se a ~t6 effectu6e d'apr~s la m6thode de Dickert et al. [1] en apportant toutefois une modification en rue d'am- ~liorer la rapidit~ et le rendement de l 'hydrog6nation catalytique: une pression de 50 atm a 6t~ utilis6e au lieu de 3 arm; la r6duction est alors complete au bout de 12 h. Les structures des diff6rents produits ont ~t6 v~rifi6es au moyen des spectres infra rouge et r . m . n .

Dosage du pentobarbital et de Fhydroxypentobarbiml par chromatographie en phase gazeuse. AussitSt pr61ev6s, le foie et le cerveau des souris sont plong6s dans l'azote liquide, pes6s et conserv6s/i - 20 ° jusqu- 'au moment du dosage.

1 ° Pr(paration de Fdchantillon ?t chromatographier. L'organe pr61ev6 est broy6 clans une solution aqueuse de tungstate de sodium/~ 20~o (3 ml pour le cerveau et 5 ml pour le foie). On introduit dans l 'homog6nat ainsi obtenu une solution 6talon de m6thohexital (50/A d'une solution aqueuse de m6thohexital 0,3 mg/ml dans le cas du cerveau et 100 #1 ~t 0,9 mg/ml dans le cas du foie).

La d6f6cation est achev6e par adjonction d'acide sulfurique (5 ml de H2SO4 0,66 N pour le cerveau et 5 ml de H2SO, 1,33 N pour le role). Aprbs centrifuga- tion pendant 5 min h 3000 t/min, le surnageant est extrait par 10ml d'6ther. L'extrait ~th6r6 est 6vapor6

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0 I 2 3

Temps,

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Fig. 1. Analyse chromatographique du pentobarbital et de l'hydroxypentobarbital dans le foie d'une souris. Pics: A, pic de rionol, stabilisateur ajout6 /~ l'6ther d'extraction; B, pic de pentobarbital; C, pic de l'6talon, le m6thohexital; D, pic de l'hydroxypentobarbital. Colonne: SE-30 5~ sur chromosorb W 80-100 mesh Temp6rature en programma-

tion de 170 ~ 200 °/t raison de 6°/min.

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de BSTFA dans un chromatographe Intersmat, s6rie IGC 15, 6quip6 en ionisation de flamme. La s6pa- ration des produits est effectu6e sur une colonne en acier inoxydable de 1,50 m de longueur et 2 mm de dia. int., remplie par du chromosorb W AW DMCS 80-100 mesh impr6gn6 par 5~o de SE-30 (Fig. 1).

Les conditions op6ratoires sont les suivantes: tem- p6rature de l'injecteur et du d6tecteur: 240°; temp6ra- ture de four: programmation de 6°/rain de 170 ° fl 200 + ; d6bit du gaz porteur (azote): 10 ml/min.

La mesure du rapport des hauteurs des pics du pentobarbital et de l'hydroxypentobarbital par rap- port fl l'6talon permet, par lecture d'une droite d'6ta- lonnage, de d6terminer la quantit6 de barbituriques contenus dans le foie ou dans le cerveau.

Les courbes 6talons sont obtenues en introduisant dans un homog6nat de cerveau ou de foie, des quan- tit6s connues de pentobarbital, d'hydroxypentobarbi- tal et d'6talon.

Expdrimentation animale. Des souris SWISS raffles, d'un poids moyen de 20 g ont 6t6 utilis6es. Le pento- barbital (Nembutal) et l 'hydroxypentobarbital ont 6t6 administr6s par voie intrap6riton6ale aux doses res- pectives de 40 et 800 mg/kg.

Les taux de pentobarbital ou d'hydroxypentobarbi- tal ont 6t6 mesur6s dans le foie et le cerveau h des temps d6termin6s apr6s l'injection intrap6riton6ale (4, 12 et 36rain pour le pentobarbital; 4, 12, 36, 72, 108 et 324 min pour l'hydroxypentobarbital). Le sommeil a 6t6 recherch6 par appr6ciation de la perte du r6flexe de redressement. Au moins six souris par lot ont 6t6 utilis&s.

RESULTATS

Les r6sultats obtenus sont rassembl6s dans la Fig. 2. Les taux de pentobarbital dans le foie et le cerveau sont sensiblement identiques, ce qui indique un pass- age rapide du pentobarbital dans le cerveau o~ il d6passe le taux de 25 #g/g apr~s une administration de 40 mg/kg i.p., dose suffisante pour provoquer un effet hypnotique.

"~ H.P. foie O~ ::L

• + . . . . . . . . . •

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"~x P. cerveou o IC x P. fo ie

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Temps, min

Fig. 2. Taux d 'hydroxypentobarb i ta l (H.P.) dans le foie ( H ) et ]e cerveau ( O - - - t l ) apr~s injection intrap6ri- ton6ale de 800 mg/kg. Taux de pentobarbital (P.) dans le foie ( x - - x, ) et le cerveau ( x - - - x ) apr6s injection in-

trap6riton6ale de 40 mg/kg.

Apr+s une injection intrap6riton6ale de 800 mg/kg, l 'hydroxypentobarbital atteint dans le foie fl la 12e min une concentration de plus de 1200/~g/g, alors que le taux maximum dans le cerveau n'est obtenu qu'fl la 108e minute et est de 190#g/g soit environ six fois moins que dans le foie. A cette dose, fl aucun moment, l 'hydroxypentobarbital n'a provoqu6 d'effet hypnotique.

Si l'on compare les r6sultats obtenus avec le pento- barbital et son m6tabolite hydroxyl6, on constate que ce dernier atteint clans le c e r v e a u ~ a n s nos condi- tions exp6rimentales---un taux sept fl huit fois plus 6lev6 que celui du pentobarbital. On peut donc d6duire que l'hydroxypentobarbital est pratiquement d6nu6 d'effet hypnotique, m~me lorsqu'il atteint des concentrations 61ev6es dans le cerveau.

DISCUSSION

Nous avons utilis6 l'hydroxypentobarbital sous forme rac6mique sans chercher comme Christensen et al. [2] fl 6valuer l'activit6 relative des isom6res. Le seul crit+re d'efficacit6 biologique retenu a 6t6 l'effet hypnotique appr6ci6 par la perte du r6flexe de redres- sement et aucune 6tude des 6ventuelles propri6t6s s'6datives ou anticonvulsivantes de l'hydroxypentobar- bital n'a 6t6 envisag6e. L'utilisation d'une dose tr6s 61ev6e d'hydroxypentobarbital (800 mg/kg i.p.) nous a paru la m6thode la plus rapide pour appr6cier le pass- age de la barri6re h6matoenc6phalique tout en ayant des chances d'atteindre des taux 61ev6s dans le cer- veau. Le remplacement d'un hydrog6ne sur le carbone 3 de la chaine isopentyl du pentobarbital par un groupe hydroxyle conduit fl une nouvelle mol6cule qui passe tr6s difficilement la barri+re h6matoen- cgphalique et se r6v+le inefficace alors qu'elle atteint, moyennant l'administration d'une dose tr6s forte, une concentration 61ev6e dans le cerveau.

Ni les 6tudes physico-chimiques consacr6es aux barbituriques par Jeffrey et al. [3], Bolton [4], Cra- ven [5], Bideau et al. [6] et Bobranski [7] ni les recherches de relations entre la structure et l'activit6 effectu6es par Hanseh et Anderson 1-8] front permis de saisir le mode d'action intime des hypnotiques bar- bituriques. Voet et Rich [9] ont soulign6 l'importance des liaisons hydrog6ne et la possibilit6 de formation de complexes entre les barbituriques et l'ad6nine. Le m6canisme par lequel le remplacement d'un hyd- rog6ne par un hydroxyle fair perdre fl la mol6cule de pentobarbital ses propri6t6s hypnotiques reste donc fl pr6ciser.

Remerciements--Nous adressons nos remerciements fl Mon- sieur Riob6, Directeur de Recherche au CNRS, pour nous avoir permis d'utiliser certains appareils de son Labora- toire lors de la synth6se de l'hydroxypentobarbital et fl Madame Courtin pour la qualit6 de son aide technique.

Ce travail a b6n6fici6 d'une aide de I'INSERM CRL n ° 73.1.111.9.

BIBLIOGRAPHIE

1. Y. J. Dickert, P. J. Shea et L. P. McCarty, J. reed. Chem. 9, 249 (1966).

2. H. D. Christensen, L. Barnett et F. I. Carroll, J. Pharm. Sci. 62, 2722 (1973).

3. G. A. Jeffrey, S, Ghose et J. O. Warwicker, Acta Cryst. 14, 881 (1961).

Cause de l'inactivit6 de rhydroxypentobarbi tal 1399

4. W. Bolton, Acta Cryst. 16, 166 (1963). 5. B. M. Craven, Acta Cryst. 17, 282 (1964). 6. J. P. Bideau, L. Marly et J. Housty, C.R. Acad. Sci.

Paris, 269, s6rie C, 549 (1969).

7. B. Bobranski, Roczn. Chemii 43 (1971). 8. C. Hansch et S. M. Anderson, J. reed. Chem. 10, 745

(1967). 9. D. Voet et A. Rich, J. Am. chem. Soc. 94, 5888 (1972).

R£~sum~-L'hydroxypentobarbital, principal m6tabolite du pentobarbital est d6pourvu d'effet hypnoti- que m~mc lorsqu'il est administr6 ~ doses 61ev6es fi l'animal. Cette absence d'effet hypnotique pouvait s'expliquer soit par une pdnOtration insuffisante darts le cerveau soit par une inactivit6 r6elle en d6pit de la pdn6tration dans le cerveau. L'6tude du taux d 'hydroxypentobarbital dans le foie et le cerveau apr~s injection intrap6riton6ale de 800mg/kg a montr6 que ce m6tabolite traverse real la barri6re hematoenc6phalique et qu'en outre il est v6ritablernent inactif car lorsque, moyennant l 'injection d'une dose tr6s 61evde, il atteint dans le cerveau la concentration de 190/~g/g (soit un taux sept fi huit fois plus 6lev6 que celui du pentobarbital) aucun effet hypnotique n'appara]t.