insiiiuf de zoologie, Facult6 des sciences, Universit6 de Kioto; Institut de biologie, Universit6 de Kob6, Japon

Recherehes sur l'expression des facteurs ldtaux hdrdditaires chez l'embryon de la drosophile

I I . L e s 6 1 6 m e n t s e t l e s p r o p r i 6 t 6 s t i n c t o r i a l e s d u p r o t o p l a s m e p e n d a n t l a p r e m i e r e p 6 r i o d e d u d 6 v e l o p p e m e n t

Par

Tadashi Imaizumi et Yoshikazu Kimoto

Avec 3 figures

(Refu le 50 juin 1955)

Introduct ion

Les noyaux, aux premiers stades, sont envelopp6s dans le eytoplasme et ils consti tuent l 'ilot protoplasmique; ils se meuvent graduel lement vers la p6riph6rie de l'o~uf off ils for- ment une couche unicellulaire de cellules. Le cytoplasme se com- pose de l 'hyaloplasme et de nom- b reux peii ts granules dispers6s dans celui-ci. Ces petits granules se groupent plus abondamment aux stades in i t iaux dans l 'ilot protoplasmique; apr~s la for- mation des cellnles du blasto- derme, au stade 5, la majori t6 des granules se eoneentrent g Fin- t6rieur de la couche eellulaire p6r iph6rique (couche corticale int6rieure) (Fig. 1); dans les cel- lules p6riph6riques, une mino- Fig'. 1. Pr@aration faite au stade 4 rit6 seulement se distr ibue aux (blast'me tardif) d~ez D. oirilis; colora- environs des noyaux. Les noyaux tion ~ l'h6matoxyline ferrique de Heiden- se t rouvent donc dans un syst~me hain. On voit la couche corticale p6ri- dont la s t ruc ture change au ph6rique et la couche int6rieure. cours du d6veloppement. On sait aussi que les capacitds de mouvement cent r i fuge des noyaux sont faible dans les embryons 16taux d6pourvus de chromosome X (formula YY),

12 T. Imaizumi et Y. Kimoto

quoiqu'ils se divisent dans le cytoplasme (Poulson) . C'est pourquoi nous avons dtudid les affinitds tinctoriales des 61~ments du protop]asme avec l'espoir de parvenir s pr~ciser le m~canisme du mouvement centrifuge des noyanx.

Materiel et m~thodes

Les observations ont 06 ex6cutges sur des embryons des mouches sauvages de Kitakata-24~ pour D. oirilis, d'Oregon-R pour D. meIanogaster, et sur des embryons l~taux hullo X de D. melanogaster. Tousles embryons ont 6t~ d6chorionnds avant l'observation. Trois stades:contract6 (stade 2), blast 'me (stades 5 et 4) et blastodermique (stade 5) ont ~t6 choisis pour cette Oude. L'alcool ~t 70%, le m61ange d'alcool 70% et d'acide acdtique glacial (15: 1); et le mglange de formol, d~ 70% et d'acide ac6tique glacial (5 : 15 : l) ont 6tg employ~s comme fixateurs. Ces trois m6thodes de fixation ont les avantages et les d6fauts suivants : La premiere permet une bonne coloration, mats le fix ateur provoque une ~orte rgduction au protoplasme. La derni~re ne produit gu~re de rdduction du protoplasme, mats elle rend h alt6rer la basophilie. L'alcool acdtique est favorable tant pour la fixation que la coloration et c'est pourquoi il a 6t6 employ6 dans cette 6tude.

Les oeufs ont 6t6 fixgs apr~s perforation de l'extr6mit~ cdphalique de l'~euf prdalablement plong6 dans le fixateur. L'hdmatoxyline ferrique de Heidenhain, l'hgmatoxyline de Delafield, la pyronine, le vert de m6th~y'le, le Sudan III et la r6action de Feulgen ont dt6 employ~s pour la coloration; de plus, la m~thode de coloration discut~ par P i s c h i n g e r a ~t6 utilis6e pour cette recherche (solution de bleu de toluidine et de fuchsine-S en con- centration de 1/~o00 M dans le tampon de Mcllvain). Dans ce cas, les obser- vations ont 6t6 faites apr~s une coloration pendant 24 heures dans cette solution et inclusion dans ]a glycerine immddiatement.

De plus, des observations ont 6t6 faits sur des embryons qui avaient 6t6 6cras~s par compression dans de la solution de Ringer, de la solution tamponnge de SiSrensen et de McIlvain on une solution de KC1.

Observations

I. Les ~ldments qui constituent l'eeuf.

La cellule se compose des noyaux, du cytoplasme e~ granules vitellins. Dans le cytoplasme, on peut distinguer clairement deux parties : de petits granules et l 'hyaloplasme dans lequel ceux-ci se dispersent. En outre, comme d~crits par H u e t t n e r (1925), il y a quelques granules dans ]a r@ion polaire post~rieure de l'embryon; ils sonf bien teint~s par l'h~matoxyline et ils seramnt incorpor~s plus tard dans les cellules polaires.

(1) Noyau. Le noyau au repos, au moment off le volume se rgduit, mani- feste l'aspect comme s'il est opflquement homog~ne et il donne tr~s faible- ment la r~action caract~ristique de Feulgen; cependant en prophase, les chromosomes se teintent par la r~action de Feulgen. Au stade du blast,me,

L'expression des faeteurs 16taux h6rdditaires, etc. 13

les noyaux au repos mont ren t un ret iculum qui est feint6 faiblement au Feulgen. Chacun des noyaux au repos dans les cellules du blastoderme poss~de une masse .de chromatine ou amphinucl~ole [~, nucleolus ~ de S o n- n e n b l i c k (1947 et 1950)]; cette masse donne for tement la %action de Feulgen et elle se localise /t la par t ie la plus externe des noyaux fixds. Les noyaux ne se colorent pas par le Sudan I lL La dimension du noyau est gdn~ralement de 3 # au repos. On sait, d'ailleurs, que t ous l e s no y a u x n 'effectuent pas leur migrat ion centr i fuge et qu 'un certain nombre d 'entre eux s 'arr~tent dans le cytoplasme int6rieur o~ ils torment les noyaux vitellins ou vitellophags.

(2) Cytoplasme. L 'hya loplasme est acidophile et les petits granules baso- philes; le premier se compose peut-6tre de part icules ul tramicroscopiques; les petits granules, au ddbut, sont disperses dans tout du cytoplasme, mais ils sont surtout abondants aux environs des noyaux. Ces granules pr~- sentent les part iculari tds suivantes : leur dimension est gdn6ralement de 0,5 # et ils ont une forme globulaire qui ne change pas au cours de ddve- loppement . La %act ion de Feulgen et la coloration de ver t de m~thyle sont n@atives; ils sour avoides de pyron ine ou de bleu de toluidine; ils se colorent aussi par le Su- dan III faiblement. Cet te baso- philie dispara~t par t ra i temenf avec une solution de H C I O , 10% en 24 heures ~t 6 ~ ou de ribo- nucl6ase cristalline; dans ces con- ditions, on peut oberserver claire- ment l 'acidophil ie de l 'hyalo- Fig. 2. Granules vitellins s6par6s (stade2). plasme. En raison de leur insolu- Fixation ~t l'alcool chaud, et coloration bilit~ dans l 'acide ac6tique, ces par h~matoxyline ferrique de Heiden- granules ne peuvenf ~t~ confon- hain. Comparez avec ]a Fig. 1. dus avec les mitochondries et ils se dist inguent des microsomes submicroscopiques par leur plus grande dimension. Ces observations indiquent que la majeure pa t t ie des acides ribonucl6iques du cytoplasme est concentr6e dans ces granules.

(5) Granules vitellins. Ils sont d 'une forme sph6rique; leur dimension est var iable , en moyenne de 3-5 #; ils sont for tement l 'acidophiles, et ils se colorent bien aussi pa r le Sudan IIL Ils n 'ont aucune affinit6 avec les noyaux et le cytoplasme, et se t rouvent gdndralement dans une vacuole apr~s fixation; ils seraient donc hydrophobes . Ces granules vitellins sont accompagn~s de nombreux petits granules secondaires, qui peuvent en ~tre s@a%s pa r une f ixat ion ~ l 'alcool chaud (Fig. 2).

II. Les affinitds tinctoriales de chacun des 61~ments apr~s coloration double au bleu de toluidine et la fuchsine-S.

14 T. Imaizumi et g. Kimoto

(1) Noyan. Les noyaux all repos pendant les stades 3 et 4 ont 6t6 surtout 4tudids. L'affinit6 tinetoriale esf seh4matis4e dans le tableau suivant.

Tableau 1. L'affinit6 tinctoriale des noyaux au repos chez D. oirilis. La rangde sup6rieure repr6sente la coloration /l la fuchsine-S, l'inf4rieure repr6sente la colo- ration au bleu de toluidine. La marque + indique une forte coloration h ee pH, celle (q-) indique une coloration faible et eelle -- reprdsente une coloration n6ga-

tire. Ces indications sont valable pour tousles tableaux suivants.

pH 2,2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4

Stade Fixateur

4

aehroma- fique

ehroma- tique

+ + + + + + + (+) (+) (+) + § + § + §

+ + + + + + + (+) (+) (+) (+) + + + + + +

+ + + q- + + §

q- + + + + - - + +

+ (+) (+) (+) (+) + § + + +

+ + (+) (+) (+) § + + + +

aleool et aeide ac6tique

aleool seule- ment

aleool et aeide ae6tique

Une observation exacte est impossible, ear le noyau n'est pas homog6ne praf iquement et sa structure n'est pas simple. Lorsque la ehromafine se loealise dans la part ie la plus ext6rieure des noyaux des eellules du blasto- derme, on peut eomparer les deux parties ehromatique et aehromafique; eelui-ei (sue nuel6aire) est aeidophile et dans une large zone de pH, la coloration est interm6diaire entre le rouge et le bleu; eerie zone est la m~me ehez D. melanogaster, mats elle est plus clair que ehez D. r)irilis. L'affinit6 finetoriale du sue nuel6aire ehez D. melanogaster est repr6sent6e dans le tableau suivant.

Tableau 2. L'affinit6 tinctoriale de la partie adlromatique dans le noyau au repos ehez D. melanogaster.

pH 2,2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4

Stade Fixatenr

+ + + + + + (+) (+) (+) + + + + +

alcool et acide ac6tique

(2) Cytoplasme. L'affinit6 tinetoriale du cytoplasme est indiqu6e dans le tableau suivant.

L'expression des faeteurs 14taux h6r6ditaires, etc.

Tableau 3. L'affinit6 tinctoriale du cytoplasme au stade 2.

15

pH

Esp~ce

D. virilis

Embryon sain de D. mela- nogaster

Embryon 16tal de D. mela- nogaster

2,2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4

+ + (+) (+) + + + + + + + + +

+ + + (+) + + + + + + + + +

+ + + + (+)

§ + -t- § § -t- +

+ + + (+) + + + + + § § +

Fixateur

alcool et acide ac6tique

aleool s e u l e -

men%

aleool et aeide ae6tique

L'affinit6 tinetoriale de l 'e lnbryon 14tal de D. melanogaster ne montre aucune diff4rence par r appor t ~ l ' embryon sain. Le profoplasme est baso- phile en g4n4ral, Inais l 'hyaloplasme et les petits granules coexistent; la basophilie de ces derniers peut 6tre enlev4e par la rfbonucl4ase ou une solution de HC104, et on peut alors observer l'affinit4 tinctoriale de l 'hyalo- plasme seulement. Les r4sultats se trouvent dans le tableau suivant.

Tableau &. L'affinit6 tinetoriale de l'hyaloplasme seul au stade 2.

pH 2,2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4:

Esp~ee Fixafeur

D. virilis

Embryon s a i n de

D. mela~ nogaster

Embryon 16tal de

D. mela- nogaster

+ + + + + + (+) (+) + + + +

+ + + + + + _ _ ( + ) + + § +

+ + + + + (+) (+) + + + +

alcool et aeide ae6fique

On voit que les propri4t4s tinetoriales de l ' h y a l o p l a s m e ont une tendanee h la ressemblanee ehez D. melanogaster et D. oirilis. EI l'affinit4 tinetoriale de la eouehe eorfieale int4rieure est plus inelin4e vers le e6t4

16 T. Imaizumi et Y. Kimoto

alcalin ehez D. melanog~ster que ehez D. oirilis. Ce r6sultat est indiqu6 dans le tableau suivant.

Tableau 5. L'affinit6 tinetoriale de la eouehe eortieale int6rieure.

pH 2,2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4

Esp~ee Fixateur

D. virilis § + (+) (+) + + + + + + + +

alcool et acide

D. mela- + § § (+) ac6tique

nogaster I + + + + + + § +

(3) Granules vifellins. Peu de variations de coloration ont 616 observdes au cours de la premiere p6riode du ddveloppement. Ce sont les 61dments les plus acidophiles du protoplasme.

Tableau 6. La sp6cialit6 finetoriale des granules vitellins.

pH 2~2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4

Esp~ee ! Fixateur

D. virilis L'muf

ovarien

Stade 2

Stade 5

Embryon sain de

D. mela- nogaster Stade 5

Embryon 16tal de

D. mela- nogaster

Stade LBD 1

+ + + + + + + + ( + ) - ( + ) + + +

+ + + + + + + + + + - - ( + ) + + +

+ § + + + + + § + + (+) + +

§ + + -I- + + + + -- --

-- -- + + -I- +

§ + + t § § § + -- -- § § § +

aleool et aeide ae6tique

i En ce qui concerne ce stade, voir le texte III.

III . Les oariat ions de l 'aff initd t inctoriale dans l ' hyMoplasme au cours d u ddoe Ioppemen t .

L'hyaloplasme proche du noyau dans l'ilot protoplasmique pr~sente des propri6tds acidophiles plus marqu6es qua clans les r6gions avoisinantes; ces

L'expression des facteurs 16taux h6r6ditaires, etc. 17

propri~t~s s 'observent apr~s coloration par les solutions tamponnde h p H 5,4, 4,0 et 4,4. Cette aeidophil ie se change ~ la basophilie dans la touche corticale pdriph~rique et la cellule blastodermique, aussi que le montre le tableau suivant.

Tableau 7. Changement de l'affinit6 tinctoriale de l'hyaloplasme de la coud~e corticale p6riph~rique chez l'embryon de D. oirilis

pH 2,2 2,4 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0 6,4

Stade Fixateur

+ + + + (+) (+) (+) + + + + + + +

§ § + + § + § + § § § +

+ § - - ( + ) + + § + + + § +

alcool et acide ac6tique

Au stade du blastoderme, la majorit~ des petits granules est concentrde dans la eouehe eortieale int6rieure, mais un certain hombre des petits granules sont aussi eontenus dans les cellules et ils sont distribu~s aux environs des noyaux, toutefois, il est obscur qu'ils sont los mSmes ~ ceux de l 'ilot protoplasmique ou bien ils y ont 6t~ formgs g nouveau.

Los observations ci-dessus permet ten t d'6tablir, pour chacun des ~16- ments, ~ quel pH l'affinitg t inetoriale ehange; voici un r~sum$ de ces donn~es.

Tableau 8. Valeur du pH auquel l'affinit~ tinetoriale change pour chaque ~l~ment qni constitue l'ceuf.

Esp~ce

D. virilis

Stade

~gaster ~

Embryon 5- 2 sain de D.

melane

Embryon LBD l~tal de D.

melanogaster] P. rotoplasma, Bd. XLIV/1

Noyau (au repos)

4,0-5,4 3,4-5,0

4,0-5,0

Hyalo- plasme

4,4 3,4-4,4

4,4

4,4

Cytoplasme

Petits granules

2,4-3,9 2,4-3,0

3,4

3,0-3,4

Couche corticale

int6rieure

2,4

3,0-3~4

Granules vitellins

5,4-6,4 6,0 6,0

5,0-5,4 5,0-5,4

5,0-5,4

18 T. Imaizumi et Y. Kimoto

IV. Coagulation de l'hgMoplasme et des petits granules en faisant oarier le pH des solutions.

L'hyaloplasme qu'on fait sortir dans le milieu ambiant par ~crasement prgsente des images caractgristiques de coagulation quand la solution est remplacge par d'alcool ou une solution tamponn~e. Les petits granules peuvent se disperser dans une solution de 0,0015 0,003M de K C l : s i on remplace celle-ci par des solutions de divers pH, on peut observer les figures caract~ristiques dc~eur coagulation. Elles sont indiquges schgmatiquement dans la Fig. 3 et les rgsultats sont d~crits ci-dessous.

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Fig. 5. Figures de coagulation gt divers pH. u: granule vitellin; p:petits granules.

Les solutions tamponn~es de S6rensen et de McIlvain donnent le m6me r~sultat et les observations ont gt~ faites surtout avee les premieres.

pH 2,4. Les petits granules flottent au d~bnt dans la solution, agit~s d'un mouvement brownien; bientgt ils sont assembles en petits ~ groupes et ils montrent une figure bacilliforme.

pH 3,4,. Les petits grannies, d~s que la solution est remplae~e par le tampon, eessent leur mouvement brownien et forment des groupes dont la masse est plus grande clue dans le premier eas.

L'expression des facteurs 16taux h6r6ditaires, etc. 19

pH 4,0. Comme dans le eas pr6e6dent, mats la masse est plus grande et elle est quelque peu ramifi6e.

pH 4,4, Quand la solution est ehang6e, le eytoplasme est eoagul6 sous une forme fibroide. Cet aspect provient peut-6tre de ee que l'hyaloplasme a 6t6 coagul6; ies petits granules sont aecol4s ~ eelui et ils torment un ehapelet.

pH 5,0-6,0. Les petits granules se groupent en masse, eomme au pH 3,4; cette masse n'indique pas l'aspeet fibroide oberserv6/t pH 4,4. Mats le degr6 d'attaehement de ehaque granule est plus laehe qu'h pH 3,4. Le mouvement brownien ne se manifeate pas dans ee eas.

pH 7,0. Les petits granules sont dispers4s librement dans la solution; ils subissent ]e mouvement brownien et ils ne se groupent pas ensemble.

D i s c u s s i o n

I1 eat impossible de tirer des conclusions d6finitives des observations ei-dessus, it eat eependant possible de diseuter deux probl6mes : la relation existant entre le milieu ambiant et les 616ments qui constituent la eellule, et l'affinit6 tinetoriale de ehaque 616menI.

I. Les granules peuvent 6tre distingu6s en deux sortes par rapport au milieu ambiant :hydrophiles et hydrophobes. Les observations ei-dessus indiquent que le noyau eat hydrophile et le granule vitellin hydrophobe. Ce dernier, en pr6paration fix6e, est toujours eontenu dans vacuole sans entier en contact avee l'hyaloplasme. Cette vacuole est sans doute un art6- fact eaus6 par le earaet6re hydrophobe du granule vitellin. Cette id4e est eonfirm4e par le fair que des lipides sont eontenus dans lea granules vitel- lins, mats qu'ils sont absents ou tr6s rares dans le noTau. Bien que la dimen- sion du noyau et lea granules vitellins sont du m4me ordre, leur c0mporte- ment eat oppos4 pendant les premiers stades du d6veloppemenI, eomme nous l'avons d6erit claus le travail prde4dent. Ce fair est peut-4tre dfi g une diff4renee dans les earaet6res physieo-ehimiquea de Fun et l 'autre. Ces diff6renees sont r4sum4es dans le tableau suivant.

Tableau 9. Les diff6renees des earactgres du noyau et du granule vitellin &ez l'embryon de D. t)irflis.

Dimension

Caraet6re

Point minimum de fixation du colorant

Noyau Granule vitellin

g6n6ralement 3 f~ (au repos)

J hydrophile

: pH 5,4~pH 7,0 i

3/~-5 #

hydrophobe

pH 5,4-pH 6,0

II . D'apr6s Re i s s (1926), la diff6rence des valeurs du pHi (point mini- mmn de fixation du colorant) et du pH est la r6action critique; sa valeur repr6sente l'6tat de la charge libre du protoplasme.

2*

20 T. Imaizumi et Y. Kimoto

Puisque le constituant principal de ehaque dl6ment du protoplasme est un ampholyte eomme les prot6ines, sa charge libre dgfend de la concentra- tion en ion H + du milieu ambiant et, par eonsdquent, il existe un pH du milieu qui permet une dissociation 6gale des valences aeide et alealin. Dans ees conditions, la densit6 d'anions et de cations est h u n minimum et, par consdquent, la fixation du colorant est aussi h un minimum. La zone off change la coloration d6erite ei-dessus correspond peut-etre/ t ee point. Mats, la coloration vitale et la coloration du tissu fix6 sont trbs diff6rentes, et le point minimum de fixation du colorant dans les tissus fixds ne reprdsente pas n6eessairemenf celui de la eellule vivante.

En ee qui eoneerne l 'embryon Idtal ddpourvu de chromosome X, on a vu que la zone minimum de fixation du eotorant ne montre gu~re de diffdrence quand on compare l 'embryon 16tal h l 'embryon sain. Dans l'ceuf de la drosophile, le pH du protoplaslne n'a pas encore jusqu'iei 6t6 mesur6 pour les raisons suivantes : a fin :de mesurer le pH du protoplasme, il est ndcessaire que la cellule salt en ban 6tat; on salt que le pH du proto- plasme varie tr~s fort quand la eellule meurt ou a 6t6 bless6e. La coloration vitale et la mieroin~eetion d'indieateurs son/ impossible ehez l'ceuf de Drosophila ~ cause des earaet~res spdeiaux de la membrane vitelline : l'61as- tieit6, l'imperm~abititd d'eau etc. ~

Or, dans l 'embryon ldtal, le mouvement centrifuge des noyaux vers la pdriph6rie est imparfait; les eonsiddrations ei-dessus, avec les observations suivantes, donneraient une donnde p%eieuse sur les raisons pour les- quelles la migration des noyaux est anormale dans les embryons ldtaux. (1) D'apr~s P o u l s o n (t945), B o e l l et P o u l s o n (1939) ant mesurd, ~t l'aide du ludion, la consommation d'oxyg~ne de l'(euf ldtal : la respiration s'61~ve de fa~on normale au tout premier stade de dgveloppement; ellc eesse alors de s'dlever, si bien qu'elle tombe au einqui~me du mdtabolisme du tdmoin. (2) C a s p e r s s o n et S e h u l t z (1938) ant mesur6 les speetres d'absorptions ultra-violette des ooeytes ehez les femelles XXY et XX: ces auteurs ant trouv6 que le protoplasme de la femelle XXY est plus ridm en substances absorbant t'ultra-violette, qui soni principalement des aeides nu- el6iques. Si on admet que ee fair est eaus6 par la pr6sence d'un Y suppldmen- taire, il est possible que l 'embryon 16tal, qui poss~de la constitution chromosomale de YY, salt peut-~tre plus riehe en aeide nueldique que l'em- bryan normal.

Rdsumd

Des recherches sur les propridtds tinctoriales des dldmems qui consti- tuent l'ceuf ant dt6 exdcutdes. Le protoplasmc est compos6 de noyaux, d'hyaloplasme, de petits granules et de granules vitellins. Les petits gra- nules ant les earaetdristiques suivantes : tent dimension est gdndralement de

1 La seule mdthode qui laisse disparaltre l'impermdabilit6 de ta membrane x:itelline eonsiste & tremper un moment l'ceuf dans xylol ou ehloroforme. Mats, un tel traitement emp~ehe le ddveloppement nltdrieur. Nous essayons eependant d'amdliorer.

L'expresslon des facteurs ldtaux h6r6ditaires, etc. 21

0 ,5# et leur forme est globuleuse. Leur forte basophi l ie peut 6tre enlevge p a r une solution H C 1 0 , 10% en 24 heures /t 60 C ou p a r la ribonucl6ase. I1 est donc p robab le que la Inajeure pa r t i e des acides ribonucl6iques du cy top lasme est concentrge dans ces granules. L ' hya lop l a sme dans lequel les peti ts granules d ispersent est, au contraire, acidophile; mais cet te acido- phil ie se change en basophi l ie dans les cellules blastodermiques. A c e stade, les pet i ts granules sont concentr6s dans la couche cort icale int6rieure en dessous des cellules du blastoderme. Enfin, l 'affinit6 t inctoriale de chaque 61dinent du p ro top lasme au cours du d6ve loppement p r ima i r e chez l'ein- b ryon norinal et l~tal a 6t~ discut~e.

Travaux cites

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