Souris transgéniques: un tour d'horizon

Souris transg6niques : un tour d’horizon

Charles Babinet

La mise au point, il y a une quinzaine d’annkes, de m6thodologies permettant la crkation expkrimentale d’organismes modifiks g&Aiquement (ou transgCniques), par addition ou remplacement de g&es, a fourni aux biologistes un outil extraordinaire pour l’ktude de ces organismes. Chez la souris, cet outil a 4tC utilisk en vue de mieux comprendre des mkcanismes mol&zulaires qui sous-tendent le dCveloppement embryonnaire et la physiologie ou la pathologie des systemes nerveux, immunitaire, musculaire, reproductif, etc. La transgenke a donnk kgalement une impulsion remarquable h la crkation de mod6les murins de maladies g&Ctiques humaines.

Unit6 de biologie du dheloppement, lnstitut Pasteur, 25, rue du Docteur-Roux, 75724 Paris cedex 15, France.

I 1 y a plus de 50 ans, dans un article devenu c&bre puisqu’il identifiait pour la premiirre fois

l’acide d&oxyribonucl&que (ADN) comme ktant le support mokulaire du matQie1 hkreditaire, Avery et al ecrivaient : (c Biologists have long aftempfed by chemical means to induce in higher organisms predictable and specific changes which thereafter could be transmitted in series as here- ditary characfers N [l]. 11 faudrait aux biologistes attendre encore une bonne quarantaine d’annees pour que les premiers organismes complexes gf?nktique- ment modifiks de manike expQi- mentalement contrBEe voient le jour. C’est peu de dire que cette lon- gue attente, durant laquelle furent mis au point les diffkrents outils ex- pQimentaux nkcessaires (biologie mokulaire pour le clonage de s& quences d’ADN, embryologie ex- pkimentale pour la culture et la mi- cromanipulation des embryons), n’a pas et6 vaine : en effet, la possibilitk d’introduire de man&e stable une information g&-&ique nou- velle sous forme d’ADN - le trans- g&e - et de crker ainsi des organismes transgkniques, a littkralement r&olutionnk l’approche de trk nombreux domaines de la biologie des organismes multicellulaires. Les premiers animaux transgkniques furent des souris et naquirent vers la fin des an&es 1970, mais depuis cette date, la transgengse a et+? ktendue a de nombreux organismes depuis les plantes jusqu’aux mammifkes (cochons, moutons, la- pins, etc), en passant par le ver &ma- tode ou la drosophile. Nous nous limiterons, dans cette courte revue, aux souris transgkniques qui, grke aux innombrables &udes qui leur ont 6t6 consacrkes, permettent d’illustrer les multiples fa-

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1997) 8,1,19-32 0 Elsevier, Paris

cettes de l’utilisation de la transgenke (12-71, pour quelques revues et ouvra- ges sur les animaux trangciniques).

La crkation d’armaux transgkniques

Deux mkthodes sont le plus souvent utiliskes pour cri?er des souris transgkniques : la premiere consiste & injecter 1’ ADN clon4 - le transgilne - directement dans l’un des deux pronuclei de l’ceuf tout juste f&on- de. L’animal transghnique n6 de cette operation (figures 1 et 2) contient de une 2 plusieurs dizaines de copies du transgPne, intkgrkes au hasard et organiskes Ien tandem (< &e-queue B (5’-+ 3’- 5’4 3’). Ain- si, ni le nombre de copies du trans- g&e ni le site d’insertion ne sont contr616s. NtSanmoins, comme nous le verrons, cette mkthode d’obtention est couramment utiliske car le transgene, pourvu qu’il contienne les &quences de rkgulation appro- prikes, est le plus souvent exprimk de man&e spkcifique. Cette observation remarquable a ‘constituk le point de dkpart de pratiquement toutes les utilisations ultkieures de ce type de souris transgenique, que nous illustrerons plus loin et qui peuvent @tre schkmatiquement &parties en deux catkgories : d’une part l’analyse des sequences kgulatrices agissant en cis, qui gouvement l’expression spkifique des gPnes in vivo ; d’autre part, le (X ciblage H de l’expression d’un transgPne, qui permet soit la surexpression d’u:n produit g& nique don@, soit son expression ectopique, approche qui s’est avk-tk t&s fkonde dans l’6tude de multiples aspects du dkveloppement ou de la physiologie, normale ou pathologique, de la souris. La deuxiPme voie d’obtention de souris transg6niques tire avantage

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R&implantation chez la souris

(3)

Souris normale x

I Transgt%que! FO flz2 pi (4)

Transgtniques htttrozygotes FI

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Production de F2 transgkniques homozygores et de lignks de souris transgtniques

(6)

fi&.fre 1. Obtention de @n.@es de souris transg&ques par micro-injection dans l’cauf fbcondg. La solution #ADNestinjectt+e (I) dans un pronucleus de kzwf toutjuste fbcondt;, ti l’aide d’un micro-mantipulateur qui commande deux microptipettes, l’une pour la micro- ivkction de So& Sautre pour son mainfien. L Injection entraine fe gonflemenf du noyau (voir Qure 2). Les owfs inject&s sont ensuite r%mplant& dans une m&e potteuse (2 3). Dans un petitnombre de cas, l’appareif enzymatique de kwfpermet ci SADNinjectte’ d’ktre intkgrb dans IADN des chromosomes de l’hbte, avant la premidre division. Par la suite, au fif des divisions, SADN exogkne ou transgkne est transmis aux ceffules Mes et une sour&, Me transgbnique, va naitre, contenantle transgt;ne dans toutes ses cellules, y compnk les cellules de la @nt+egerminale. Les souris transg&iques sont rep&bes paranalyse de leur ADN total ri l’aide d’une sonde radioactive qui hybnde seulement avec lADN inject6 $ l’onigine dans l’o%f (4). Le croisemenf des souris transg&iques avec une soutis non transgbnique donne naissance 2 des individus FI dont la moiti& a hkk’te’ du transgkne (5, 6). Le croisement de deux sourk FI produit des sour& donf un quarf est homozygote pour le transgt’ne (7. On dispose alors d’une @n&e de sound transgbniques.

figure 2. Micro-injection d’une sofutiion diADN dans le pronoyau mile dun ceuf fkconde’ de sounk Noter le gon flement du pronoyau (en B) apr& S?tection.

de l’existence de cellules souches embryonnaires (ou cellules ES, pour embryonic stem cells) (figures 3 et 4). Ces cellules, qui sont d&i&es directement de la mise en culture de trPs jeunes embryons de souris (ap- pel6s blastocystes), ont la propri& remarquable, lorsqu’elles sont r&n- troduites dans un jeune embryon (figure 41, de participer B la formation de tous ses tissus, y compris la lignee germinale [8-l 01. L’individu ainsi obtenu est done une chimke, constituee de cellules issues pour partie des cellules ES, et pour partie des cellules de l’embryon h6te. Le croisement de cette chim$re avec une souris normale don:nera naissance 21 des individus ayant regu le patri- moine gkktique des cellules ES et ce, dans une proportion refktant le de- gr6 de colonisation de la lignile germinale de la souris chink-ique par les descendants des cell.ules ES. L’introduction prkalable d’un trans- gPne dans les cellules ES permet done, via l’obtention de chimkes, de g6nQer des souris transgeniques. Mais la vertu principale de l’utilisation des cellules ES pour la crkation de souris transgkniques r6- side dans le fait que l’on peut Glee- tionner et verifier un type de modification genetique rare que I’on sou- haite in fine introduire chez l’animal. L’adoption d’un tel s&na- rio a ouvert de nombreuses possibilit&, en particulier dans l’ktude du dkveloppement embryonnaire et de la physiologie de diffkrents systP- mes (nerveux, immunitaire, musculaire, etc). En effet, des mkthodes ont kt6 mises au point, permettant le remplacement d’un alkle endo- gPne par une version mutee, ouvrant ainsi la voie ii l’klucidation de la fonction des genes dans ces processus.

La transgenkse par addition du gkne

n Analyse des skquences rkgulatrices responsables de I’expression spkcifique des genes in viva

L’un des probkmes centraux de la biologie du dkveloppement est de

20 ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualitks (1997) 8,l

(2) Stlec~ian in vitro des clones recombinanls homologues

4 (3) lnlection dans II: blastocyste

4 (4) RtimplantaLion chew la souris

DCtection des transgtniques httCrorygotes

1 (6)

Production de F2 et Cludc des effers du transgtne A I’ttal homozygote

figure 3. Obtention de lgnees de souns transgeniques mutantes, grace a la recombinaison homologue dans les celfufes souches embtyonnaires plun@otentes (celfules ES) : remplacement programme dun gene normal de la souns par un gene mute. L A DN exogene (ou transgene) consiste en une version mutee dun gene endogene qui va remplacer par recombrnaison homologue Sun des alleles sauvages presents dans les cellules ES transfectees. La mutation arnsi introduite pourra etre transferee in viva, jusqu;i l’obtention de souns homozygotes pour cette mutation, comme indique sur le schema.

comprendre comment une cellule unique, le zygote, donne naissance, par un double processus de division et de diversification cellulaires, a un organisme compose de multiples tissus differents. L’information genetique qui preside a ce processus etant presente a l’identique dans toutes les cellules de l’organisme, il est clair que le developpement et la differentiation doivent proceder de l’expression, stricte- ment regulee dans le temps et dans l’espace, de genes ou groupes de genes ; d’ou l’importance de comprendre les mecanismes qui presi- dent a cette regulation. De tres nombreuses experiences effect&es, soit ex vivo (cultures de cellules) soit in vitro (systemes acellulaires), ont permis d’aboutir a la conclusion que la regulation genique resultait d’un processus complexe d’interactions entre des proteines agissant en trans, les facteurs de transcription, et des sequences en cis presentes dans l’ADN a l’interieur ou au voisinage des genes. Cependant, ces etudes ont leurs li- mites, d’une part parce qu’elles ne permettent pas d’aborder le pro-

bleme de la regulation temporelle (a differents moments du developpement de l’organisme), d’autre part parce qu’elles ne prennent pas en compte les multiples niveaux de regulation a l’ceuvre in vivo (interactions entre cellules ou tissus, regu- lations a distance, facteurs diffusi- bles ou hormones, etc). L’utilisation d’organismes transgeniques permet precisement de tourner cette difficult6 ; en effet, l’expression d’un transgene don& peut etre re- cherchee dans toutes les cellules et a tout moment du developpement, dans le contexte de l’organisme in toto. Cette strategic ouvre la voie a l’identification des sequences regulatrices impliquees dans la regulation genique in vivo ; en effet, differentes versions contenant des parties variees d’un gene donne peuvent etre utilisees pour creer autant de lignees transgeniques differentes, chez lesquelles l’expression du transgene peut etre analysee en detail [ll, 121. Une telle strategic a et6 appliquee pour la premiere fois au gene de l’elastase, une proteine specifiquement exprimee dans les cellules du

figure 4. Micro-injection de cellules ES dans la ca vite dun blastocyste.

pancreas exocrine : en ef feet, en 1987, Hammer et al 1131 (voir aussi [14]) demontraient qu’une sequence de 205 paires de bases en 5’ du gene de l’elastase etait necessaire et suffi- Sante pour entrainer une expression regulee de ce gene, a la fois dans le temps (au tours du developpement embryonnaire) et dans l’espace. Cette strategic a ete depuis cette date &endue a de tres nombreux genes, permettant de determiner la nature et la localisation Ides sequences regulatrices necessaires a leur regulation correcte in vivo. 11 faut noter toutefois une difficulte de cette approche, lice au lmode particulier d’obtention des souris transgeniques : en effet, comme nous l’avons vu, le transgene ilp&S micro- injection dans le noyau du zygote, s’integre au hasard dans le genome et les sequences qui avoisinent le site d’integration peuvent eventuellement interferer avec L’expression du transgene ; ce phenomene, ap- pele c( effet de position >:’ [15], se manifeste en particulier de deux fa- cons : d’une part le niveau d’expression d’un meme transgene peut varier d’une lignee transgenique a

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1997) 8,l

l’autre et n’est generalement pas proportionnel au nombre de copies du transgene ; d’autre part, de ma- niere plus rare, une expression ectopique du transgene peut avoir lieu, l’interpretation etant ici que son expression est soumise a l’influence dominante de sequences regulatrices d’un autre gene present au voisinage du site d’integration. 11 est interessant de noter a cet egard l’identification d’un type particulier de sequences, appelees locus control region, qui ont la capacite de conferer a un (trans)gene une expression independante du site d’integration et proportionnelle au nombre de copies. Ce type de sequence a ete identifie a l’origine dans le cas du locus globine, qui comprend plusieurs genes codant des isoformes de la globine synthe- tisees, selon un profil complexe au tours du developpement embryonnaire et chez l’adulte, seule la p-globine etant synthetisee chez ce dernier. Ainsi, l’analyse de souris transgeniques portant des transgenes contenant ou non la LCR a permis de montrer que cette derniere, loca- lisle a plusieurs dizaines de kilobases des sequences codantes des genes globines, avait la propriete remarquable d’induire la constitution d’un domaine chromatinien actif, de l’isoler de l’influence des sequences adjacentes et de conferer a des promoteurs heterologues une expression tissu-specifique, en I’oc- currence dans les lignees erythro’i- des [ 161. Depuis la decouverte de la LCR dans le locus globine, des elements de type LCR ont ete identifies dans divers genes. Etude de ces elements a egalement contribue a la prise de conscience que des sequences regulatrices es- sentielles a l’expression correcte d’un gene pouvaient @tre sit&es a plusieurs dizaines, voire plusieurs centaines de kilobases de leurs sequences codantes ; dans ces conditions, l’utilisation de transgenes clones dans des plasmides ou des cos- mides et contenant done au maximum 40 a 50 kb de sequences genomiques constituait une limita- tion importante.

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Cette situation a change grace a la mise au point recente de differentes techniques rendant possible la creation de souris transgeniques portant des sequences genomiques clo- nees dans des chromosomes artifi- ciels de levure et pouvant atteindre des longueurs de deux megabases [17,181. Malgre certaines difficult& techniques (preparation de quantites suffisantes d’ADN de YAC, con- tamination par l’ADN de levure, risques de coupures des sequences d’ADN du YAC lors de sa manipu- lation, etc), les avantages de leur utilisation en transgenese sont multiples : 1) l’affranchissement, lie a la longueur des sequences introdui- tes, des effets indesirables des sequences flanquant le site d’integration du transgene ; 2) la possibilite d’identifier des sequences regulatrices eloignees et d’etudier la regulation de tres grands genes ; 3) la faculte d’aborder l’etude de pheno- menes biologiques mettant en jeu de tres grands domaines chromati- niens, comme l’empreinte genomi- que parentale ou l’inactivation du chromosome X 117,181. Enfin, iI faut souligner un aspect tres important de l’utilisation des YAC en transgenese et qui tient a leur propagation dans la levure ; en effet, il est relativement aise d’introduire dans les sequences genomiques portees par le YAC n’importe quel type de mutations (mutations ponctuelles, deletions, inversions, duplication) en tirant avantage des capacites de la levure a effectuer la recombinaison homologue. Le YAC modifie dans la levure peut alors etre reintroduit dans le genome de la souris et l’effet de la

A

mutation sera etudie chez la souris transgenique obtenue.

H Le ciblage de l’expression des transghes et ses multiples applications

L’identification des sequences regulatrices necessaires et suffisantes a l’expression normale d’un gene in vivo a ouvert la voie a de t&s nombreuses investigations dans pratiquement tous les domaines de la biologie de la souris, ainsi qu’a certaines applications pratiques (figure 5). En effet, une fois identifiees ces sequences, on peut construire, par les methodes classiques de la biologie moleculaire, un nouveau type de transgene, que nous appel- lerons transgene << hybride F) (fusion transgene) contenant d’une part les sequences regulatrices d’un gene A, et d’autre part les sequences codantes dun gene B. Les souris transgeniques creees avec un tel transgene exprimeront done, en principe, la proteine codee par le gene B, dans les tissus ou types cellulaires oil c’est normalement le gene A qui s’exprime. Avant d’indiquer quelques exemples de cette approche, notons qu’elle peut @tre utilisee pour l’identification elle-meme des sequences regulatrices des genes : le gene B, qui est alors un simple gene c( rapporteur jj de l’activite des sequences regulatrices du gene A, est choisi de ma- niere a coder une proteine facilement rep&able et dont la presence est saris effet delettlre pour la physiologie cellulaire. Le gene rapporteur le plus couramment utilise jusqu’a present est cel.ui de la P-galac-

B

fiaure 5. Utikation des souris fransg&@es potfeuses dun transgkne hybnde.


tosidase d’E coli, dont l’activite est tres facilement rep&able, y compris a l’echelle cellulaire, grace au developpement d’une coloration bleue en presence d’un substrat particulier. De fait, l’analyse des sequences regulatrices de nombreux genes a et6 effect&e de cette man&e 1191.

H DCrCgulation de l’expression gtkique : ktudes fonctionnelles et physiopathologiques

Selon le choix du type de transgene hybride utilise qui peut @tre varie a I’infini, les souris transgeniques pourront exprimer ou surexprimer une version normale ou modifiee d’une proteine don&e, dans un type cellulaire particulier, ou dans un petit nombre de tissus ou dans l’ensemble des tissus. La deregulation ou l’expression ectopique d’un gene donne, obtenue de cette ma- niere et l’etude de son effet permettent d’apporter des lumieres sur sa fonction. Une strategie de ce type a et6 utilisee dans l’analyse aussi bien de systemes physiologiques varies (systeme immunitaire, nerveux, he- matopo’ietique, etc) que dans l’etude du developpement embryonnaire et de nombreuses pa- thologies. Nous donnerons deux exemples d’une telle approche, choisis parmi de tres nombreux autres, dans le domaine du developpement et de la tumorigenese. Au tours des an&es 1980, fut decouverte chez la drosophile une famille de genes, les genes du complexe HOM-C, codant pour des facteurs de transcription contenant une sequence specifique de liaison a I’ADN la c( boite homkotique >j [20,21]. 11 fut alors demontre, grace a des experiences raffinees de genetique moleculaire, que ces facteurs de transcription jouaient un role crucial dans le developpement de la drosophile, en particulier dans la determination de l’identite des seg- ments le long de l’axe anteroposte- rieur [22]. Par la suite, les genes du complexe Hox-C, homologues des genes du complexe HOM-C de la drosophile, furent identifies chez la souris [23]. La strategic que nous avons d&rite

plus haut fut alors precieuse et con- tribua largement a la demonstra- tion du role des genes Hex dans le developpement embryonnaire de la souris. Ce fut le cas pour la premiere fois avec le gene Hoxa-7 : en effet, l’expression ectopique, chez des souris transgeniques, de ce gene mis sous la dependance du promoteur de l’actine p de poulet, entrai- nait une transformation de certaines vertebres en vertebres plus pos- terieures, une transformation de type homeotique comme on en observe chez les drosophiles mutees dans les genes du complexe HOM- C ([24,251). Depuis, cette strategic a ete appliquee a de nombreux autres genes du complexe HOM-C (revue, [la). Un autre exemple representatif de cette approche concerne une situation pathologique, la formation de tumeurs, et a trait a l’etude du role des oncogenes dans ce processus. Les oncogenes, decouverts en 1976 dans certains retrovirus canceroge- nes et identifies alors comme des versions mutees d’un gene cellulaire normal [26], constituent un groupe de genes codant des proteines de types varies (depuis des facteurs de transcription, jusqu’a des facteurs de croissance en passant par des recepteurs membranaires) qui ont en commun d’etre impli- q&s dans la regulation de la division cellulaire. Leur mutation ou la deregulation de leur expression a pour effet d’induire la formation de tumeurs 1271. En dehors de l’kude de la fonction des differents types d’oncogenes dans la vie cellulaire et le developpement, la creation de souris transgeniques oh l’expression de differents oncogenes est ciblee a permis d’une part d’obtenir des modeles reproductibles d’etude du developpement tumoral in vivo, et d’autre part d’analyser l’implication du role specifique de differents oncogenes dans differents types de tumeurs [4,281. De plus, elle a permis de mettre a jour la cooperation entre differents oncogenes dans la formation des tumeurs, ainsi que le role d’autres genes dont l‘activite contribue a la tumorigenese [29,301.

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1997) 8,1

Une extension t&s interessante des souris trans (0nco)geniques est la possibilite qu’elles offrent d’obtenir l’immortalisation de types cellulaires varies. Pour de multiples rai- sons, il est interessant de pouvoir maintenir en culture un type cellulaire donne. Or, parmi la grande va- riete de cellules differenciees presentes dans un organisme comme la souris, seule une petite proportion se prete a la mise en culture. Pour tourner la difficulte, on peut creer des souris transgeniqu.es oti l’expression d’un oncogene immortali- sant est ciblee dans un ou plusieurs types cellulaires : il devient alors possible, apres prelevement et mise en culture des tissus oh le trans- oncogene est exprime, de deriver des clones cellulaires qui se divisent indefiniment en culture : par exemple, Vicart et al 1311 ont pu deriver des cultures de types cellulaires varies a partir de souris transgeniques pour un transgene constitue des sequences codantes de l’antigene T de SV40 (Tag), un oncogene immorta- lisant, likes au promoteur de la vimentine, qui a la propriete d’etre active dans des conditi.ons de culture ex vivo, meme dans les types cellulaires oti il n’est pas exprime in vivo (voir aussi 1321 et [33] pour le ciblage de Tag avec d’au.tres promoteurs, et revue dans [34]).

m Ablation spkcifique de populations cellulaires

11 peut etre interessant, pour l’etude de la physiologie ou du developpement des differents systemes biologiques, de tenter de supprimer specifiquement telle ou. telle population cellulaire. Lapp-roche transgenique consiste ici 2 cibler specifiquement l’expression d’une proteine toxique, comme la ricine ou la toxine diphterique, dans un tissu ou un type cellulaire donne, a l’aide d’un transgene contenant les sequences regulatrices appropriees, provoquant ainsi la mart des cellules oti le transgene s’exprime (revue dans 1351). Ce protocole peut etre raffine en rendant la mort cellulaire condi- tionnelle, en ciblant l’expression de

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la thymidine kinase du virus de l’herpes (HSV-tk). Cette proteine, qui par elle-m@me n’est pas toxique, peut le devenir en presence dun mkdicament, le Gancyclovir, qui est metabolise par l’HSVtk et transfor- me en produit toxique pour la cellule. Dans ce cas, l’ablation cellulaire dependra du site d’expression de l’HSV-tk et du moment d’admi- nistration du Gancyclovir. Outre leur interet dans l’etude du role de telle ou telle population cellulaire dans l’homeostasie de differents systemes physiologiques, ces approches, parfois qualifiees de <( toxigenetiques >>, peuvent contri- buer a l’etude des lignages cellulaires qui participent a la formation d’un tissu ou d’un organe. Une etude tres recente illustre ce dernier point : le ciblage specifique de l’expression de l’HSV-tk dans les cellules de la paroi de la muqueuse gastrique, puis le traitement des souris transgeniques par le Gancyclovir entraine une regression de celle-ci. Lorsque le traitement au Gancyclo- vir est interrompu, on constate une reconstitution de la structure glan- dulaire, avec restauration des differents types cellulaires. L’utilisation de ce systeme a ainsi permis a Can- field et al de reveler l’existence d’une cellule souche pluripotente, a l’origine des nombreux types cellulaires qui peuplent la muqueuse gastrique 1361. Une autre etude illustre l’interet de I/ablation cellulaire en vue de l’etude d’un systeme physiologi- que : en ciblant l’expression de la toxine diphterique (chaine A) dans le tissu adipeux, Lowell et al ont g&-&e des souris transgeniques chez lesquelles ce tissu etait deficient. Ces souris developpent alors un syndrome d’obesite, sans pour autant presenter d’hyperphagie, ce qui suggere tres fortement un role crucial du tissu adipeux brun dans l’homeostasie nutritionnelle de la souris 1371.

W Les animaux transgCniques comme CC biofermenteurs >> ?

La production de proteines d’interet biologique ou medical par genie

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genetique a debute il y a plus d’une dizaine d’annees et constitue un en- jeu a la fois economique et de Sante publique. Parmi les multiples approches utilisees, la transgenese pourrait rep&enter une solution interessante. 11 s’agit de cibler la synthese de ces proteines sur un site particulier de l’animal, d’oti elles pourraient etre ensuite extraites avec une relative facilite. Par exemple, en utilisant les sequences regulatrices d’un gene exprime specifiquement dans la glande mammaire, il est possible de cibler l’expression d’une proteine dans le lait de la souris. Cependant, le but recherche est d’obtenir de grandes quantites de proteines ; la souris, compte tenu de sa petite taille, ne sert ici que de modele (voir par exemple 138, 391) pour la production d’al-antitryp- sine ou de surfactant-C dans le lait de souris transgeniques). De multiples etudes sont en tours, sur des animaux de plus grande taille (la- pins, moutons), visant a mettre au point des systemes de ciblage de l’expression dans les animaux transgeniques aussi efficaces que possible (voir revues 140-421).

W Les transghes comme agents mutaghes

Mutations d’insertion au hasard et isolement de nouveaux g&es

Nous avons vu que l’insertion d’un transgene a lieu au hasard dans le genome de la souris. Si celle-ci s’effectue a l’interieur dun gene, cela peut entrainer une mutation, appelee alors mutation d’insertion, dans ce gene, et done eventuellement un phenotype lorsque l’insertion du transgene est amenee a l’etat homozygote. Ainsi, le croisement syste- matique de souris transgeniques heterozygotes pour un transgene peut @tre un moyen d’identifier des mutations d/insertion. Lint&et de ce type d’insertion transgenique est que le transgene peut servir d’,) hamecon >) pour le clonage moleculaire des sequences flanquant le transgene et l’identification du gene qui a subi la mutation (revues dans 1431 et 1441). Bien que cette approche soit alkatoire

(environ 5 a 10 % des insertions d’un transgene aboutissent a une mutation) et que l’insertion dun transgene induise asset frequem- ment des rearrangements genomiques rendant parfoils le clonage du gene concern6 difficile, elle a permis, en particulier, d’isoler de nouveaux genes importants dans le developpement embryonnaire, comme par exemple ceux codant les formines, des proteines importantes dans la morphogenese du membre (voir [45] et references incluses), le gene microphtalmia, qui est implique dans de multiples aspects du developpement (revue clans [461), et le gene nodal qui code pour un nouveau membre de la f,amille des TGF- B et dont le role est essentiel dans la gastrulation 147,481.

Une approche plus cibl6e pour I’isolement de nouveaux genes : les cc pikges t) 2 g&es

Dans cette approche, au contraire de celle d&rite ci-dessus, qui repose sur l’insertion aleatoire dun transgene donne, de nouveaux types de transgenes, appeles <c pieges >) a genes ont ete concus de man&e a reveler l’activite dun gene endogene et/au de ses sequences regulatrices (revues, [4!)-521). Typique- ment, un vecteur <c piege )> contient un gene rapporteur (en general la B-galactosidase) et une cassette ser- vant a la selection. AprPs transfert dans les cellules ES, une selection appropriee est appliquee et l’activite du gene rapporteur peut etre re- cherchee dans les cellules ES ou pendant le developpement de chi- meres obtenues a partir de l’injection des cellules ES modifiees dans un blastocyste hate. Bien qu’il existe de multiples va- riantes des vecteurs de piegeage, on peut distinguer deux grandes cate- gories : dans la premiere, les pieges a sequences regulatrices (ou enhancer trap) (figure 6A), les sequences codantes du gene rapporteur sont liees h un promoteur minimal : le gene rapporteur ne sera done exprime que si le vecteur piege s’est integre au voisinage die sequences activatrices de type enhancer dun gene endogene. Dans la deuxieme cate-


A Piege 1 dquence r&ulatrice

Pm LacZ P nko

Integration et activation par l’activateur (E) du gene X

ATG I

I Pm LacZ P n&o P G&e X

ARNm -*

Prot6ines

B Piege B gPne AE Lac Z P nko

lnt6gration dans un gene endoghe, dans la bonne orientation et en respectant le cadre de lecture

A ,

Px G&wX AE Lac Z P n60

Epissage v-

Protbine de fusion X Lac Z

Protkine N&o

&we 6 A. PGge ri skquences acfllatrices. Le pigge ri skquence activanke contient un promoteur minimum (F “) branch& sur les sdquences codantes de la p -galactosidase et une cassette de s,4lecfon. La p -galactosidase pourra skyprimer si le transgC;n s Mgre au voisinage de sbquences activatnices (E) (d’aprks /S/). 0. Pi&ge ri g&e. llest constitut4 d’un accepteur d’t;pissage (AE) en s’des sbquences de la p -galactosidase Lac Z(hachures noires) saris promoteu< ainsi que dune cassette de s6Vection fonctionnant indt’pendamment (P-n&o). La p-galactosidase pouna s’exprier sous fonne dune prvt&e de fusion, si le transg&ne s%gte dans la bonne onkntai7on dans un g&e endogkne (#apr&/5l].

gorie (figure 6B), les pieges 2i gPnes (gene trap), le gene rapporteur est depourvu de promoteur et comprend kventuellement un site accepteur d’gpissage dans sa partie 5’. Dans ce dernier cas, le gPne rapporteur pourra s’exprimer m@me s’il est intkgrk dans un intron ; au contraire, en l’absence de site accepteur d’kpissage, le g&e rapporteur ne pourra s’exprimer que s’il s’est intkgrk en phase dans un exon d’un gPne endoggne. L’activite du gene pikgk peut @tre recherchke, soit au tours du dkveloppement embryonnaire soit au tours d’un processus de diffkenciation. Ainsi, des genes pourront @tre identifiks, dont le profil &expression est rkgule au tours

de ces processus, indiquant par 12 qu’ils pourraient y jouer un r61e important (figure 7). Outre la possibiliti! de suivre l’activitk du gtine rapporteur, qui, en principe, mime celle du gene endo- gPne, l’utilisation des vecteurs de piegeage de gPnes prksente deux autres avantages : l/insertion du transgPne a toutes les chances, dans la mesure oti elle interrompt l’unite de transcription du gPne piegk, d’@tre mutagkne, et done de provo- quer des anomalies phenotypiques chez les souris hktkrozygotes ou homozygotes pour l’insertion ; d’autre part, la presence d’un ARN messager hybride contenant les skquences du gPne rapporteur et des


sgquences endogkes faicilite le clonage du gPne endogkne interrompu : en effet, l’utilisation d’un oligo- nuclkotide antisens choisi dans les skquences du gene rapporteur permet par transcription reverse de cc remonter 1) en 5’dans les sequences de l’ARN messager endogPne (technique dite d’amplification ra- pide des extremitk de l’ADNc ou a RACE PCR ,)) [531. Plusieurs etudes rassemblant des skies de pikgeage de g&es [54-561 ou d’activateurs 1571 lent et6 pu- blikes ces dernikes an&es et d& montrent que cette approche permet d’identifier des gPnes dont l’activite est rkgulke au tours du developpement ou de la diffkren- ciation. De plus, dans les cas oh les g&es pikg& ont &k clank, il a &G montrG que l’activitk du g&e rapporteur mimait de maniPre satisfai- Sante l’activite du g&e pi@gk Enfin, l’examen de plusieurs dizaines &insertions transmises & la lignke germinale montre qu’environ 40 % d’entre elles entrainent un phknotype l&al embryonnaire 2 l’ktat homozygote et concernent done des genes importants pour le dilveloppement embryonnaire. En- fin, un certain nombre ‘de ces g&es ont d’ores et dkj2 gtk identifies (voir par exemple [58-641) et pour de nombreuses autres insertions le clonage des g&es pikgk test en tours. Ainsi, la stratkgie de pikgeage constitue l’une des voies d’identification de g&es du dkveloppement.

De I’addition au remplacement de gknes : la mutagen&se dirigke par recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires

L’une des limitations d.e la transge- n&se par addition de gPnes, nous l’avons vu, reside dans le fait que ni le site d’intkgration, ni le nombre de copies du transgkne intkgrkes ne peuvent @tre contrGl&. La mise au point de cultures des cellules ES, capables de coloniser la lignke germinale ainsi que de mkthodes permettant le remplacement d’un allele endogPne par une verljion mutee a permis de pallier ces inconvtkients et

25

Introduction dans les cellules ES et s6lection par la Nhmycine

R&klation de l’activit6 P-galactosidase

Rhtroduction des cellules dans les blastocystes

/! I u @@@@@ Rkvklation de l’activit6 P-galactosidase au stade

voulu du developpement

A B C D E

figure Z Recherche de g&es impt?qu&s dans le de’veloppemenf : examen du prowl d’expression des g&es pi&g&. Apr& introduction dans les cellules ES du transgine et s&lection par la N6omyc/he, l’actikit& p -galactosidase (d&veloppement &me coloration bleue en pr&ence d’un substrat, le X-gal) estrecherchbe dans les oVt&ents clones (cellule expnhant @) et n ‘expn’mant pas (0) la p -galactosidase). Cen’ains des clones r&Stants ri la nkomycine produisent de la p -galactosidase (B, C, D), o’autres non. Apr& injection des &5rents clones dans un blastocyste hbte, Sactivk+dug&ne pi&g& est recherchbe dans les chimkes obtenues $ pan% de ces bkistocystes, B un stade donne’ du de’veloppement embr/onaire, schdmatise’ sur la demikre @ne. Flusieurs situations sont illustr&es ; A : g&e active’ au tours du de’veloppement; I3 : g&e dont l’activitk est &einte durant la m&me p&de ;C :g&e dont l’actitit& est rt?gul&e au tours du de’veloppement; D : g&e ri actitiiie’ ubiquitaire et constitfuljve ; E : g&e thactif durant la p&ode consid&e (flap& /5?//.

d’ktendre de man&e spectaculaire pourvu qu’il soit clank, reprksente l’int&t de la transgenke (revues, un outil privilkgi~ pour acckder 5 la [51, 65-671). En effet, la possibilitk fonction des gtines ; en outre, elle d’introduire des mutations dans permet la crGation de modkles de n’importe quel @ne de la souris, maladies g&-&iques humaines.

1 2 NW 2 3 I- Vecteur de ciblage

3 n AlMe endogkne

1 2 2 3

n Allkle mute

Egure 8. Introduction d’une mutafion nulle dans un g&e par recombinaison homologue . vecteur de ciblage. la n cassette )) Neo est introduite dans un exon @i exon 2), crbant ainsi une interruption de l’unite’ de transcripfion. La recombthaison s’effectue gfAce 9 la prksence, dans le vecteur de ctblage, des sbquences homologues au g&e endogkne.

E La mutagen&e dirigCe in vivo : crhation de souris porteuses de mu.tations nulles dans un gene donnC

Le schkma g&&al d’obtention de cellules ES mutees dans un g&e don& repose sur un scenario dont le principe de base est assez simple : un transgene est construit, contenant les sequences de ce gPne, au sein desquelles est in&&e une cassette de selection permettant l’expression d’un gPne de rkistance B un antibiotique, cette cassette &ant placee a l’intkrieur d’une exon de man&e g empkher la formation d’un ARN messager fonctionnel. AprPs transfection du transgPne dans les cellules ES, la culture en prksence de l’antibiotique permet de klectionner des clones ayant intkgrk le transgPne ; l’expkrience montre cependant que la proportion des clones oh le transgPne s’est intkgrk par recombinaison avec les sequences homologues du gPne en- dog&e (figure S), bien que variable d’un gene & l’autre, est g&&ale- ment trPs faible ; aussi, des m&ho- des de si?lection particulkkes, permettant d’enrichir en clones ayant subi la recombinaison homologue ont-elles dG Ctre mises au point 168, 691. AprPs rep&age de ces clones, les souris porteuses de la mutation nulle ainsi introduite dans l’un des deux alleles du gPne endogkne peuvent etre obtenues via l’obtention de chimPres (figure 3). L’analyse de l’effet phknotypique des mutations dans un g&ne donnk est une approche privilegike pour accGder g la fonction de ce g&e ; il n’est done pas ktonnant que la facultk offerte de mutagkni- ser n’importe quel gPne, pourvu qu’il soit clank, ait &? mise 2 pro- fit de maniPre extensive depuis la crbation des premikes souris mo- difikes g&Gtiquement par recombinaison homologue dans les cellules ES. De fait, une liste etablie en 1995 [70-721 fait &at de plusieurs centaines de genes mutes de cette manike. L’analyse des phkno- types engendrk par ces mutations a permis, dans la ,grande majoritk des cas, d’tklairer de man&e saisis-

26 ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1997) 8,l

sante la fonction des genes corres- pondants. 11 importe de souligner aussi le ca- ractere precieux de la mutagen&e dirigee in vivo pour la creation de modeles murins de maladies genetiques humaines. En effet, de t&s nombreuses maladies de ce type existent chez l’homme et dans bien des cas, les genes incrimines et les mutations correspondantes ont ete identifies et caracterises. On peut des lors envisager d’introduire dans le genome de la souris des mutations dans le gene homologue du gene humain concerne et d’obtenir de cette man&e un modele murin de la pathologie humaine. Cette strategic a deja et& appliquee avec SUCCPS dans de nombreux cas, comme par exemple la mucovisci- dose, les thalassemies ou l’athero- sclerose (revue, 1731). 11 est clair que ces modeles, meme s’ils ne reproduisent pas 21 l’identique la pathologie humaine, sont tres utiles pour les etudes de physiopathologie et les mises au point de therapeuti- ques de ces maladies.

n Progrb rkents de la mutagen&se dirigke in vivo : mutations non nulles et mutations conditionnelles

Le scenario que nous avons decrit plus haut aboutit a la creation de mutations nulles ; c’est celui qui a ete le plus couramment utilise jusqu’a une periode recente. Cepen- dam, il est clair qu’il serait tres interessant de creer egalement d’autres types de mutations plus subtiles, comme des mutations ponctuelles ou de courtes deletions, qui permet- traient de raffiner l’analyse, par exemple, de la fonction de proteines presentant de multiples domaines fonctionnels. Cela vaut egalement pour la creation de modeles de maladies genetiques humaines qui, tres souvent, ont pour origine d’autres types de mutations que les mutations nulles. Le probleme se pose alors de la presence des sequences etrangeres de la cassette de selection qui pourraient interferer avec la regulation de l’expression du gene cible ou m&me de genes voi-

RH

+

ES3Hpn- +

figure 9. Utiilisatton de la selection HPRT pour l’obtention de mutations (( propres >> parrecombinaison bomologue dans les cel- /u/es ES Les cellules ES1 (HPRT) sonf transfectees avec un premier vecteur de crblage contenant des sequences homologues augene dint&t et une cassette d’expression HPRT Apres sefecflbn des clones HPR P, les recombinan ts homo logues (ES2) sont identifies par une analyse en Southern blot. L es ceflules ES2 sont ala/s transfectees par un deuxieme vecteur de cibage constitue uniquement de sequences homologues au gene diner/t et porteuses dune mutafin (‘1. La selection en faveur des cellules HPRT donne naiksance uniquement a des cellules ES (ES3), porteuses de la mutation (*) et completement depourvues de sequences etrangeres [6$ 751 (RH = recombinarson homologue).

sins (notons que dans ce dernier cas le probleme peut se poser egalement pour les mututations nulles ; voir discussion de ce point dans [741). Deux types d’approches ont ete imaginees, qui permettent l’obtention d’un gene mute depourvu de sequences etrangeres, la mutation pouvant alors etre appelee mutation (( propre )j (figures 9 et 10). Le premier utilise la possibilite de se- lectionner pour ou contre l’expression du gene codant l’hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) ([751, revues, 165, 761). Des cellules ES HPRT- de genotype male XY et portant une mutation dans le gene HPRT endogene sur le chromosome X sont utilisees et transfectees avec une construction contenant comme sequences de selection une cassette d’expression HPRT (au lieu de la cassette Neo), localisee dans un intron du gene (figure 9). Apres selec-

Frgure 10 Schema .stmpM de l’utisation du systeme Cre-LoxP pour la creation de mutations c( propres ‘>. Le vecteur de ciblage est consftue de sequences homologues au gene dint&et et #contenant une mutation 1’). Leg&e de selection (Neo) est ftanque de sequences Lox P (+) et place dans un infron du gene o’MM. Apres selection, puis idenr%cation des clones re- combrnants homologues (ZQ), ces der- niers soflt transfectes par un vecteur d’expression de la recombinase Cre, qui entraine Sexcision des sequences de selection Neo. Les cefiules ainsiobtenues (ES2) pon’enf une mutation (*) dans le gene din- t&et et sont depoutvues de sequences &rang&es a l’exception dune sequence LoxP de 34 pb, reliquat de Saction de la recombrnase Cre (voir[63 78) (RH = recombrnaison homologue).

tion des clones HPRT+ et recherche de ceux ayant subi un evenement de recombinaison homologue, ces der- niers sont transfectes avec une construction comportant uniquement des sequences homologues au gene d’interet et porteuses d’une mutation dans ce gene. Les clones HPRT- obtenus par une selection appro- price seront porteurs de l’allele modifie, depourvu de tome sequence &rang&e. Une deuxieme methode pour la creation d’alleles mutes depourvus de sequences de selection (figure 10) tire avantage des proprietes des recombinases dites specifiques de sites (revue, [77]). Lune d’entre elles, la recombinase Cre, isolee du bacteriophage Pl, a ete particulierement etudiee dans le clontexte de la recombinaison homologue chez les cellules ES. Cette enzyme a la propriete d’induire l’excision d’une sequence d’ADN, lorsqu’elle est: flanquee de

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1997) 8,l 27

deux copies d’une sequence particuliere de 34 bp appelee LoxP (la probabilite de la presence de cette sequence dans le genome de la souris est quasiment nulle) . AprPs l’excision, seul reste un exemplaire du site LoxP. Ainsi, apres introduction dans les cellules ES dune construction contenant une mutation dans un gene d’interet et des sequences de selection flanquees de sites LoxP, les clones ou la recombinaison homologue a eu lieu sont tout d’abord identifies ; dans un deuxieme temps, un vecteur exprimant la recombinase Cre est transfecte dans les clones recombinants homologues, ce qui entraine l’excision des sequences de selection ([78,79], revue, [65]) (figure 8). 11 faut noter une extension recente et particulierement interessante de l’utilisation du systeme Cre-LoxP, qui permet d’obtenir des cellules ES et/au des souris porteuses de translocations [80] ou de tres grandes deletions [81] (jusqu’a environ 4 cMo). La disposition de souris presentant des rearrangements chromo- somiques devrait faciliter l’analyse genetique de regions chromosomi- ques particulieres, et aussi ouvrir la voie a l’obtention de modeles des anomalies du developpement ou de tumorigenese : en effet, dans l’espece humaine les rearrangements chro- mosomiques sont une importante cause de mort f&ale [821 et de nombreuses translocations sont a l’origine de tumeurs [83]. Un raffinement supplementaire dans l’utilisation de la mutagen&e dirigee a ete introduit recemment par la possibilite de creer des mutations conditionnelles. Pourquoi creer des mutations conditionnelles ? Essentiellement pour trois rai- sons : d’abord, cela permet d’eten- dre l’etude de la fonction de genes dont la mutation entraine une leta- lite embryonnaire au-dela du moment ob elle survient ; ensuite, parce que cela devrait permettre de simplifier l’analyse de l’effet dune mutation dans un gene dont la fonction s’exerce dans plusieurs types cellulaires ; et enfin, cela ouvre la voie a la creation de modeles de maladies humaines liees & l’appari-

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tion de mutations somatiques, comme les translocations, qui sont a l’origine de certains types de can- cers humains [83]. Pour ce faire (figure ll), deux lignees de souris transgeniques sont utilisees : dans la lignee A, le gene d’interet est encadre de sites LoxP (gene <( floxe PX) places de telle sorte qu’ils ne perturbent pas l’expression du gene en question ; une deuxieme lignee transgenique, la lignee B, obtenue par addition de gene, contient un transgene hybride constitue d’un promoteur et de ses sequences regulatrices fusionnees avec les sequences codantes de la recombinase Cre. Le croisement de ces lignees A et B permet d’induire la deletion du gene d’interet, et done l’expression de la mutation dans tel ou tel type cellulaire, qui depend de la nature du promoteur utilise dans le transgene hybride. Ainsi, en principe, la voie est ouverte a l’etude des effets d’une mutation dans n’importe quel type cellulaire ou a n’importe quel moment du developpement. La faisabilite d’une telle strategic a ete demontree recemment, en utilisant l’ADN polymerase B comme gene floxe et un transgene hybride ciblant l’expression de la recombinase dans les cellules T. L’analyse des souris issues du croisement entre les lignees A et B a en effet montre que le gene de l’ADN polymerase B etait specifiquement delete dans les cellules T [loll. Une alternative t&s interessante a la creation de souris transgeniques chez lesquelles la recombinase pourrait @tre induite de man&e contrblee est suggeree par un recent travail de Gossen et al (1841, revue, [85]). Les auteurs ont tree une construction codant une proteine de fusion (appelee rtTA) entre une version mutee du represseur tetracycline et les sequences activatrices de la proteine VP16 du virus de l’herpes. 11s ont alors montre dans des cellules en culture que cette proteine de fusion etait capable, en presence de tetracycline, de se lier a l’operateur tetracycline (t&O), en- tramant ainsi l’activation d’un gene rapporteur (la B-galactosidase ou la

luciferase), annex6 a un promoteur minimal. 11 devrait etre possible en utilisant ce protocole de rendre l’expression de la recombinase Cre in- ductible par la tetracycline. Ainsi, des souris transginiques pourraient @tre c&es, contenant deux transgenes, l’un exprimant la proteine rtTA et l’autre constitue de sequences t&O likes a un promoteur minimal suivi des sequences codantes de la recombinase Cre. Ainsi, selon les sequences regulatrices utilisees pour gouverner la synthese de rtTA, ces souris transgeniques devraient, apres un traitement a la tetracycline, exprimer la recombinase dans un type cellulaire particulier, et ce, au moment choisi pour le traitement. Pour terminer ce tour d’horizon des possibilites ouvertes par la mutage- r&se dirigee, nous tenterons de tirer quelques conclusions g&&ales, qui se degagent de l‘iitude des tres nombreuses souris mutantes obtenues a ce jour par cette methode.

n Profil d’expression gknique et fonction

Lexpression d’une proteine dans un type cellulaire donne est generalement consideree comme une indi- cation que cette proteine a une fonction dans ce type cellulaire. L’analyse des differentes souris porteuses de mutations nulles vient pourtant battre en b&he cette conjecture : en effet, il n’est pas rare d’observer, chez une souris mutante, que le phenotype concerne seulement une partie des types cellulaires, tissus ou organes ou le gene est normalement exprime. Par exemple, des souris mutees dan:s le protoonco- gene c-src, une tyrosine kinase, qui est exprimee fortement dans les pla- quettes et dans les neurones, ne presentent aucune anomalie dans ces deux tissus [86] ; le phenotype prin- cipal de ces souris est une osteope- trose grave, et c’est d’ailleurs a partir de cette observation qu’il fut rea- lise que cette proteine etait exprimee dans les osteoclastes 1871. De meme, des souris invalidees dans le gene LEF-1 (lymphocyte en- hancingfuctor-U, presentent un phe-


notype demontrant son implication dans le developpement de plusieurs organes requerant des interactions epitheliomesenchymateu- ses ; neanmoins, d’autres organes, qui expriment LEF1, se developpent de man&e normale [BBI. Cela pourrait @tre dQ a des problemes d’economie cellulaire dans l’organisme : en effet, si un gene necessaire a une cellule doit a l’evidence @tre exprime dans cette cellule, on peut imaginer qu’il puisse etre egalement exprime dans un autre type cellulaire, oii son expression n’est pas utile, du moment qu’elle n’entraine pas d’effet toxique. Autre- ment dit, un controle negatif de cha- curie des milliers de proteines syn- thetisees par une cellule serait inutilement cotiteux et done super- fetatoire 1891.

q Redondance fonctionnelle

Une autre hypothese pour expliquer l’absence de phenotype dans un type cellulaire ou tissu depourvu d’une proteine normalement presente reside dans la possibilite d’une coexpression d’une proteine ayant une fonction similaire. 11 s’agirait alors de redondance fonctionnelle. Bien qu’une redondance genetique stricte soit tres proba- blement impossible d’un point de vue evolutif (discussion dans [90]), elle pourrait expliquer les phenotypes tres discrets observes chez certaines souris porteuses d’une mutation nulle. Une telle situation a ete observee dans le cas, par exemple, de deux proteines, MyoD et Myf5, qui font partie dune famille de facteurs de transcription myogeni- ques. Les souris porteuses dune mutation nulle, dans le gene MyoD [91] ou Myf5 [921 respectivement, presentent une differentiation musculaire apparemment normale. Ainsi, la seule presence de MyoD ou de Myf5 parait suffisante pour une differentiation musculaire normale, ce qui suggere que leur fonction est redondante. Cette hypothese est renforcee par le phenotype des souris doubles mutantesMyeD/-, Myfs-I- : en effet, ces souris sont totalement depourvues de myoblas-

Prth Cre (

1) Thymocytes

* Y excise

2) Autres types cellulaires

Y actif

figure 11. Vue scbematique de l’ufilisation d’HFf?T en vue de la creatioIn de mutations conditionnelfes. La souns transgenique A, obtenue parrecombinaison homologue dans les cellules ES, conttent le gene dint&et Y flanque par deux sequences Lox I’, positionnees de telle sorte quelles ne petturbent pas l’activite du gene Y gene n floxe J>. La souris transgenique B obtenue par addition de genes (micro-injection dans le pronucleus du zygote), contient un transgene hybnde constitue des sequences regulatnces dun gene specifiquement expnme dans les thymocfles (P?‘) raboutees aux sequences codantes de la recombinase Cre. Le croisement des souris A et B donne naissance a des souns chez lesquelles la recombtnase Cre nest exprimee que dans les thymocytes : finvalidation du gene Y n’a done lieu que dans ces demiers. Dans les autres &pes celllrlaires, le gene (( floxe )) fonctionne normalement / 1Olj

tes et de tissu musculaire (1931, revue dans [941). Un cas extreme peut egalement se presenter oti les souris, en l’absence d’une proteine don&e, se developpent et se reproduisent d’une ma- niere apparemment normale. Ainsi en est-il par exemple des souris sans vimentine [951, une proteine des filaments intermediaires du cytos- quelette ou sans tenascine 1961, une proteine de la matrice extracellu-

laire. Ces resultats sont d’autant plus intrigants que les genes en question sont hautement conserves au tours du developpement des vertebres. De plus, il n’existe pas de candidat evident pow prendre en charge la fonction de la tenascine ; de meme le remplacement de la vimentine par un autre membre de la famille des filaments intermediaires n’a pu etre mis en evidence dans les souris sans vimenti-ne. I1 est done

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1997) 8,l 29

clair que ni la tenascine, ni la vimentine ne sont necessaires au dkveloppement normal. Est-ce 2 dire que ces protkines sont totalement super- flues ? Cela est trks invraisembla- ble, sinon impossible du point de vue Gvolutif : en effet, un gPne su- perflu et done non soumis .3 une quelconque pression de sglection devrait @tre rapidement inactive du fait du taux constant de mutation. L’explication est sans doute 2 re- chercher dans la difficult4 de trou- ver un test approprik pour dktecter un phenotype : soit qu’il soit t&s subtil, soit parce qu’il ne se manifes- terait que dans des conditions inha- bituelles. Enfin, il ne faut pas perdre de vue que la recherche du phknotype s’effectue dans les conditions particulikes d’un glevage en ani- malerie. Ainsi des changements kventuels de valeur adaptative liees B une mutation ne peuvent @tre pris en compte : il a pu &re calculk qu’un changement de 1 %, signifi- catif dans une perspective kvolu- tive, de la valeur adaptative n&es- siterait pour @tre rep&t! l’analyse de 600 000 animaux (revue dans [97]) !

effectue des comparaisons phkno- typiques entre des souris mutantes et des souris sauvages, l’influence possible du fond gknktique ; d’autre part, l’observation de diffkren- ces dans l’expressivitk ou la p&n&- trance d’une mutation en fonction du fond gknetique ouvre la voie 21 l’identification des genes, appek gsnes modificateurs, qui modulent l’expression du phenotype lik 21 cette mutation. De ce point de vue, la souris constitue un modPle privi- legi d’analyse, parce que de nombreuses lignkes consanguines existent, porteuses kventuellement d’alkles diffilrents de ces gPnes modificateurs [lOOI, ce qui devrait faciliter la recherche des diffkents g&- nes qui contribuent 2 l’expression d’un phenotype donnk

Conclusion

sibilitk de pr&lect:ionner ex vivo une mutation particulike dans un gene don&, puis de la transfkrer in vivo chez l’animal. Si jusqu’g pr& sent, la grande majoritk des mutations cr&es sont des mutations nulles, des mkthodes nouvelles com- mencent 21 Gtre mises au point pour la creation de mutat ions plus subtiles, permettant d’affiner l’analyse gknktique. Enfin, se dkveloppent des mGthodes qui permettront de cibler la survenue de la mutation dans tel ou tel type cellulaire ou tissu, ce qui, dans le cas d’une mutation l&ale embryonnaire, par exemple, ouvre la v,oie a l’ktude de la fonction du g&e mutk, au-de15 de la date oti se manifeste la l&alit& Ainsi, il est clair que l’approche transggnique continuera dans les annkes & venir 21 constituer un outil privilkgik dans l’ktude de la biologie de la souris.

Le dkveloppement de methodolo- gies permettant l’introduction d’une information g&-ktique nou- velle dans la lignee germinale d’un organisme complexe comme la souris a fourni un outil d’une puissance inkgalke pour l’analyse de pratiquement tous les aspects de la biologie de cet animal. La modification g& netique ktant stable, puisque trans- mise aux gknkrations successives, les chercheurs disposent ainsi d’animaux en quantitk illimitke, chez lesquels l’effet de la modification gikktique peut @tre analyse en d&ail, aussi bien dans l’espace (dans les diffkrents tissus) que dans le temps (a toutes les etapes du developpement). 11 n’est done pas ktonnant que cette methodologie ait pris une importance grandissante dans les scknarios expkrimentaux destines g mieux comprendre le rale des gPnes dans le dkveloppement embryonnaire, dans le fonctionne- ment de diffkents systPmes physiologiques de l’animal et dans les pa- thologies dont rls peuvent Gtre le siPge. La disposition de cellules souches embryonnaires, un privi- 1Pge limit6 pour le moment 6 la souris, a encore elargi les possibilit& de la transgenke, en ouvrant la voie 6 la crkation contrblke de mutations dans un g&ne don& grke g la pos-

RBf6rences 1

n PhCnotype et fond gkktique

Une autre leqon de l’analyse des souris mutantes obtenues par mu- tag&&e est l’importance, previsi- ble mais parfois sous-estimke, du fonds gknktique dans l’expression phenotypique des mutations. Deux ktudes de Threadgill et al 1981 et Sibilia et Wagner 1991 illustrent ce point de man&e saisissante : ces auteurs ont cr& des souris invalid6es dans le g&e codant le rkcepteur au facteur decroissance (EGF-r). Par des croisements approprik., ils ont transfer4 la mutation dans trois fonds gknktiques diffkrents : dans le premier, ils ont observe une l&alit6 t&s prkoce de la mutation, vers quatre jours de gestation, dans le second, la l&alit6 se produisait 2 mi-gestation et enfin dans le troi- si&me fonds gknktique, les souris survivaient jusqu’a environ trois se- maines aprk la naissance. Deux leqons peuvent @tre tirkes de cet exemple : d’une part, il faut gar- der prksente 2 l’esprit, lorsque l’on

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Souris transgéniques: un tour d'horizon