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SCIENCES SUP ANALYSE CHIMIQUE Méthodes et techniques instrumentales modernes 6 e édition Francis Rouessac Annick Rouessac avec la collaboration de Daniel Cruché 1 er cycle/Licence • Pharmacie Cours et exercices corrigés

Analyse chimique[1]

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  • 1.SCIENCES SUP ANALYSE CHIMIQUE Mthodes et techniques instrumentales modernes 6e dition Francis Rouessac Annick Rouessac avec la collaboration de Daniel Cruch 1er cycle/Licence Pharmacie Cours et exercices corrigs

2. ANALYSE CHIMIQUE 3. ANALYSE CHIMIQUE Mthodes et techniques instrumentales modernes Cours et exercices corrigs Francis Rouessac Professeur mrite de l'universit du Mans Annick Rouessac Matre de confrences honoraire Avec la collaboration de Daniel Cruch Professeur agrg l'IUT du Mans Prface de Guy Ourisson Membre de lAcadmie des Sciences 6e dition 4. Illustrations intrieures : Francis Rouessac Illustration de couverture : Lionel Auvergne Dunod, Paris, 2004 Masson, Paris, 1992 pour la 1re dition ISBN 2 10 048425 7 5. Prface Une lente volution, lente, lente, se produit-elle dans les pratiques universitaires franaises ? Des livres scientiques en franais deviennent disponibles. En trente ans, on a vu disparatre les gros classiques davant-guerre, dmods, puis sortir quelques livres qui taient essen- tiellement des notes de cours amliores, peu diffuses sans doute parce que correspondant davantage un besoin local qu une tentative srieuse de rnover la pdagogie. Puis des traductions plus ou moins profondment remanies de livres amricains. Et enn quelques ouvrages succs, dont le grand nombre dditions, et le tirage, ont d remplir daise au- teurs et diteurs et cela parce quils sont utiles aux tudiants et quils sont originaux par rapport leurs homologues trangers. Sil nous tait possible depuis quelques annes de conseiller aux tudiants de se procurer pour la Chimie Organique le H.&C. , ou de leur indiquer que le niveau de Chimie Phy- sique atteint en DEUG tait celui de la 15e dition du A , il tait bien difcile jusquici de pouvoir miser sur un livre dintroduction gnrale en Chimie Analytique. Le R , le Rouessac, va pouvoir combler cette lacune. Analyse Chimique , en fait, tel est son titre. Il y a quelques annes, des collgues spcialiss en Chimie Analytique mavaient effectivement expliqu que je confondais leur domaine et lanalyse chimique : la Chimie Analytique tait une science dsincarne, loi- gne des basses applications, celles de lanalyse chimique (notez le jeu dinitiales majus- cules et minuscules). Pourtant, je nen crois rien, et je nai jamais su si le cours de Chimie Analytique que jai introduit Strasbourg il y a une quinzaine dannes tait Ceci ou cela. Le Rouessac est lun ou lautre. Son sous-titre est plus explicite : il sagit de Mthodes et Techniques Instrumentales Modernes . Explicite, mais peu informatif : lanalyse chimique sest toujours faite laide dinstruments, et ils nont jamais cess de se moderniser. Pendant longtemps, le plus important a t la balance ; il reste essentiel (et on peut esprer quune prochaine dition du R. dcrira ce quest devenue cette mthode instrumentale moderne - il y sufra de quelques pages). Aujourdhui, ce sont des mthodes bien plus varies et plus complexes qui font la loi dans les laboratoires. Le R. les dcrit de faon systmatique et simple, mais prcise. Que ce soit pour les mthodes de sparation comme, bien sr, toutes les variantes des chroma- tographies, ou pour les mthodes didentication structurale on y trouvera une introduction bien quilibre. Livre denseignement, le R. lest dans la mesure o un chimiste qui en connatrait tout le contenu (et aurait reu une initiation pratique, bien sr) ne serait gure en peine de se rendre utile dans nimporte quel laboratoire. Livre denseignement russi, il lest aussi, par le soin quil met aux explications. 6. VI Prface Une prface logieuse se doit dvoquer de futures ditions. Dans ces nouvelles versions, jespre que F. Rouessac et son pouse pourront trouver la place de quelques complments : sur la balance, je lai dit, mais aussi sur les mthodes lectrochimiques, lchantillonnage si rarement discut , et sur le traitement des donnes numriques (conservation des donnes primaires, archivage, traitements statistiques, prsentations graphiques, etc.). Guy Ourisson Membre de lAcadmie des Sciences 23 avril 1992. 7. Table des matires AVANT-PROPOS XVII INTRODUCTION 1 PARTIE 1 MTHODES SPARATIVES Linvention de la chromatographie 6 CHAPITRE 1 CHROMATOGRAPHIE, ASPECTS GNRAUX 7 1.1 Gnralits sur la chromatographie analytique 7 1.2 Le chromatogramme 9 1.3 Pics dlution gaussiens 11 1.4 Modle des plateaux 11 1.5 Coefcient (ou Constante) de distribution de Nernst (K) 14 1.6 Efcacit dune colonne 15 1.7 Grandeurs de rtention 17 1.8 Facteur de sparation (ou slectivit) entre deux soluts 18 1.9 Facteur de rsolution entre deux pics 19 1.10 Inuence de la vitesse de la phase mobile 20 1.11 Optimisation dune analyse chromatographique 23 1.12 Les diverses techniques chromatographiques 24 ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE 27 1.13 Principe et relation de base 27 1.14 Aires des pics et logiciels de chromatographie 27 1.15 Mthode de ltalonnage externe 28 1.16 Mthode de ltalonnage interne (talon interne) 30 1.17 Mthode par normalisation interne 32 EXERCICES 33 8. VIII Table des matires CHAPITRE 2 CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE 36 2.1 Lorigine de la CLHP 36 2.2 Conception gnrale dun appareil de CLHP 37 2.3 Pompes et gradients dlution 38 2.4 Injecteurs 40 2.5 Colonnes 41 2.6 Phases stationnaires 42 2.7 Chromatographie liquide chirale 47 2.8 Phases mobiles 48 2.9 Chromatographie dappariement dions 50 2.10 Chromatographie dinteraction hydrophobe 51 2.11 Principaux dtecteurs 52 2.12 Tendances actuelles de la CLHP 57 EXERCICES 59 CHAPITRE 3 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE 61 3.1 Principe dune installation de CPG 61 3.2 Gaz vecteur et rgulateur de dbit 63 3.3 Introduction de lchantillon et chambre dinjection 64 3.4 Enceinte thermostate 68 3.5 Colonnes 68 3.6 Phases stationnaires 70 3.7 Principaux dtecteurs 73 3.8 Dtecteurs conduisant des donnes structurales 77 3.9 Chromatographie rapide 78 3.10 Indices de rtention et Constantes des phases stationnaires 80 3.11 Chromatographie multidimensionnelle 84 EXERCICES 85 CHAPITRE 4 CHROMATOGRAPHIE IONIQUE 88 4.1 Principe de la chromatographie ionique (CI) 88 4.2 Phases stationnaires 90 4.3 Phases mobiles 92 4.4 Dtecteurs conductivit 94 9. Table des matires IX 4.5 Le suppresseur dions de llectrolyte 95 4.6 Analyseurs dacides amins 96 EXERCICE 99 CHAPITRE 5 CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE 100 5.1 Mise en uvre de la chromatographie planaire 100 5.2 Particularits lies la CCM 102 5.3 Phases stationnaires 103 5.4 Paramtres de sparation et de rtention 105 5.5 CCM quantitative 105 EXERCICES 107 CHAPITRE 6 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE 108 6.1 Rappel sur les uides supercritiques 108 6.2 Les phases supercritiques comme phase mobile 109 6.3 Instrumentation en SFC 110 6.4 Comparaison de la SFC avec la CLHP et la CPG 111 6.5 Place de la SFC en chromatographie 112 CHAPITRE 7 CHROMATOGRAPHIE DEXCLUSION STRIQUE 114 7.1 Principe de la chromatographie dexclusion strique (CES) 114 7.2 Phases stationnaires et phases mobiles 115 7.3 Traitement du chromatogramme 117 7.4 Instrumentation 118 7.5 Domaines dapplication 119 EXERCICES 121 CHAPITRE 8 LECTROPHORSE CAPILLAIRE ET LECTROCHROMATOGRAPHIE 123 8.1 De llectrophorse de zone llectrophorse capillaire 123 8.2 Mobilit lectrophortique et ux lectro-osmotique 125 8.3 Instrumentation 129 8.4 Techniques lectrophortiques 131 8.5 Performances 133 8.6 lectrochromatographie capillaire (ECC) 135 EXERCICES 137 10. X Table des matires PARTIE 2 MTHODES SPECTROMTRIQUES Les inventeurs de la colorimtrie 140 CHAPITRE 9 SPECTROMTRIE DABSORPTION DE LULTRAVIOLET ET DU VISIBLE 141 9.1 Le domaine spectral UV-Vis et lorigine des absorptions 141 9.2 Le spectre UV-VIS 143 9.3 Transitions lectroniques des composs organiques 144 9.4 Groupements chromophores 146 9.5 Effets dus aux solvants : solvatochromie 148 9.6 Rgles de Woodward-Fieser 149 9.7 Instrumentation dans lUV/Visible 150 9.8 Les diffrentes congurations des spectromtres UV/Vis 154 9.9 Analyse quantitative : lois de labsorption molculaire 158 9.10 Mthodes utilises en analyse quantitative 161 9.11 Analyse dun seul analyte et contrle de puret 162 9.12 Analyse multicomposants (MCA) 164 9.13 Mthodes de correction de ligne de base 167 9.14 Distribution des erreurs relatives dues aux appareils 168 9.15 Spectromtrie drive 169 9.16 Colorimtrie visuelle par transmission ou rexion 171 EXERCICES 172 CHAPITRE 10 SPECTROMTRIE DU MOYEN ET DU PROCHE INFRAROUGE 175 10.1 Origine de labsorption lumineuse dans linfrarouge 175 10.2 Prsentation des absorptions dans linfrarouge 176 10.3 Bandes de vibration-rotation dans linfrarouge 177 10.4 Modle simpli des interactions vibrationnelles 178 10.5 Les composs rels 179 10.6 Bandes caractristiques des composs organiques 181 10.7 Spectromtres et analyseurs infrarouges 182 10.8 Sources et dtecteurs dans le moyen IR 187 10.9 Examen des chantillons 189 10.10 Spectroscopie dimagerie chimique 193 10.11 Archivage des spectres 193 11. Table des matires XI 10.12 Comparaisons de spectres 197 10.13 Analyse quantitative 197 EXERCICES 202 CHAPITRE 11 FLUORIMTRIE ET CHIMILUMINESCENCE 205 11.1 Fluorescence et phosphorescence 205 11.2 Origine de la uorescence 206 11.3 Relation entre uorescence et concentration 208 11.4 Diffusion Rayleigh et diffusion Raman 210 11.5 Instrumentation 212 11.6 Quelques applications de la uorescence 215 11.7 Fluorimtrie rsolue dans le temps 217 11.8 Chimiluminescence 218 EXERCICES 221 CHAPITRE 12 SPECTROMTRIE DE FLUORESCENCE X 223 12.1 Principes de base 223 12.2 Le spectre de uorescence X 224 12.3 Modes dexcitation des lments en uorescence X 226 12.4 Dtection des rayons X 230 12.5 Les diverses catgories dinstruments 231 12.6 Prparation des chantillons 235 12.7 Absorption des rayons X - densimtrie X 236 12.8 Analyse quantitative par uorescence X 237 12.9 Applications de la uorescence X 237 EXERCICES 239 CHAPITRE 13 ABSORPTION ATOMIQUE ET MISSION DE FLAMME 242 13.1 Effet de la temprature sur un lment 242 13.2 Application aux appareils actuels 244 13.3 Absorption atomique contre mission de amme 245 13.4 Dosages par SAA ou par EF 246 13.5 Instrumentation de base en absorption atomique 247 13.6 Photomtres de amme 253 12. XII Table des matires 13.7 Correction des absorptions parasites 253 13.8 Perturbations physiques et chimiques 257 13.9 Sensibilit et limite de dtection en SAA 258 EXERCICES 260 CHAPITRE 14 SPECTROMTRIE DMISSION ATOMIQUE 262 14.1 Spectromtrie dmission optique des atomes (OES) 262 14.2 Principe de lanalyse par mission atomique 263 14.3 Procds pour dissocier lchantillon en atomes ou ions 264 14.4 Systmes dispersifs et raies spectrales 267 14.5 Appareils simultans et appareils squentiels 269 14.6 Performances 272 14.7 Couplage CPG/mission atomique (CPG/ICP-OES) 273 14.8 Applications de la spectromtrie dmission atomique 274 EXERCICES 275 CHAPITRE 15 SPECTROMTRIE DE RSONANCE MAGNTIQUE NUCLAIRE 277 15.1 Gnralits 277 15.2 Interaction spin/champ magntique pour un noyau 278 15.3 Les noyaux qui peuvent tre tudis par RMN 280 15.4 Thorie de Bloch pour un noyau dont I = 1/2 281 15.5 Frquence de Larmor 282 15.6 Obtention du spectre par RMN impulsionnelle 284 15.7 Les processus de relaxation des noyaux 287 15.8 Le dplacement chimique 288 15.9 Mesure des dplacements chimiques 288 15.10 Noyaux blinds ou dblinds 289 15.11 Facteurs affectant les dplacements chimiques 290 15.12 Structure hyperne Couplages spin-spin 292 15.13 Couplages htronuclaires 292 15.14 Couplages homonuclaires 295 15.15 Dcouplage de spin et squences particulires 298 15.16 Couplage CLHP/RMN 300 15.17 RMN du uor et du phosphore 301 13. Table des matires XIII 15.18 RMN quantitative 302 15.19 Analyseurs utilisant la RMN impulsionnelle 305 EXERCICES 310 PARTIE 3 AUTRES MTHODES Les analyses de trace 314 CHAPITRE 16 SPECTROMTRIE DE MASSE 315 16.1 Principe de base 315 16.2 Le spectromtre de Bainbridge (1933) 318 16.3 Analyseurs lectromagntiques de type EB 320 16.4 Analyseurs temps de vol (TOF) 323 16.5 Analyseurs ltre quadripolaire par transmission 325 16.6 Analyseurs pigeage dions par quadripole 329 16.7 Analyseurs rsonance cyclotronique (FTMS) 330 16.8 Performances des spectromtres de masse 332 16.9 Principaux procds dionisation sous vide 335 16.10 Procds dionisation pression atmosphrique 339 16.11 Spectromtres de masse en tandem (MS/MS) 342 16.12 Dtecteurs ions 343 QUELQUES APPLICATIONS EN SPECTROMTRIE DE MASSE 345 16.13 Identication au moyen dune spectrothque 345 16.14 Analyse de la composition lmentaire des ions 346 16.15 Mesure des rapports isotopiques dun lment 349 16.16 Fragmentation des molcules organiques 350 EXERCICES 355 CHAPITRE 17 MTHODES DE DOSAGE PAR MARQUAGE 357 17.1 Principe des mthodes de marquage 357 17.2 Dilution isotopique avec un marqueur radioactif 358 17.3 Mthode substchiomtrique 359 17.4 Tests radio-immunologiques (RIA) 359 17.5 Mesure des activits radio-isotopiques 360 17.6 Antignes et anticorps 363 17.7 La mthode de dosage immunoenzymatique (EIA) 363 14. XIV Table des matires 17.8 Autres techniques immunoenzymatiques 366 17.9 Avantages et dfauts des tests ELISA en chimie 367 17.10 Fluoro-immunologie (IFA) 367 17.11 Marquage avec un isotope stable 368 17.12 Analyse par activation neutronique (NAA) 369 17.13 Sources de neutrons thermiques 369 17.14 Activit induite Dure dirradiation 370 17.15 Dtection par comptage principe des mesures 370 17.16 Applications 371 EXERCICES 372 CHAPITRE 18 ANALYSEURS LMENTAIRES 374 18.1 Analyses particulires 374 18.2 Analyse lmentaire organique 375 18.3 Analyseurs dazote total 377 18.4 Analyseurs de soufre total 379 18.5 Analyseurs de carbone total 380 18.6 Analyseurs de mercure 380 EXERCICES 382 CHAPITRE 19 MTHODES POTENTIOMTRIQUES 383 19.1 Gnralits sur les cellules de mesure 383 19.2 Une lectrode slective particulire : llectrode pH 385 19.3 Les principaux types dlectrodes ioniques slectives 386 19.4 Les calculs et les diffrentes mthodes 389 19.5 Quelques applications 391 EXERCICES 392 CHAPITRE 20 MTHODES VOLTAMPROMTRIQUES ET COULOMTRIQUES 394 20.1 Gnralits sur la mthode voltampromtrique 394 20.2 Llectrode goutte de mercure tombante 396 20.3 Polarographie courant continu 396 20.4 Le courant de diffusion 397 20.5 Polarographie impulsions 398 15. Table des matires XV 20.6 Dtection voltampromtrique en CLHP et ECHP 400 20.7 Capteurs de type ampromtriques 401 20.8 Voltampromtrie redissolution (stripping voltammetry) 405 20.9 Dosages coulomtriques courant ou potentiel constant 406 20.10 Le dosage de leau daprs la mthode de Karl Fischer 407 20.11 Conduite dun dosage selon la mthode de Karl Fischer 409 EXERCICES 412 CHAPITRE 21 TRAITEMENT DES CHANTILLONS 414 21.1 La ncessit dun traitement pralable 414 21.2 Extraction en phase solide (SPE) 415 21.3 Cartouches dimmuno-extraction 417 21.4 Procds de micro extraction 418 21.5 Extraction gazeuse sur colonne ou sur disque 419 21.6 Espace de tte (headspace) 420 21.7 Extraction par solvant ltat supercritique 422 21.8 Racteurs digestion par micro-ondes 423 21.9 Analyseurs en ligne 424 CHAPITRE 22 PARAMTRES STATISTIQUES DE BASE 426 22.1 Valeur centrale, justesse et dlit dun ensemble de mesures 426 22.2 Variance et cart-type 427 22.3 Erreurs alatoires ou indtermines 429 22.4 Intervalle de conance de la moyenne 431 22.5 Comparaison de rsultats Tests paramtriques 432 22.6 Test de rejet Quotient Q ou test de Dixon 434 22.7 Courbes dtalonnage 434 22.8 Mthodes robustes ou tests non-paramtriques 437 22.9 Optimisation par la mthode un seul facteur la fois 438 EXERCICES 439 RPONSES AUX EXERCICES 441 TABLE DES CONSTANTES PHYSICO-CHIMIQUES 454 BIBLIOGRAPHIE 455 INDEX 459 16. nos enfants et petits enfants 17. Avant-propos Ce manuel est destin donner un ensemble de connaissances de base sur les mthodes les plus souvent rencontres actuellement en analyse chimique, qualitative, quantitative et structurale, dans des secteurs aussi varis que constituent les industries chimiques, phar- maceutiques, agroalimentaires, ainsi que ceux de lenvironnement et des rglementations diverses. Les mthodes passes en revue dans cet ouvrage sont classes en mthodes sparatives, mthodes spectrales et autres mthodes. Chacune delles fait lobjet dune tude qui sap- puie sur les ides de base pour se prolonger par les principales techniques instrumentales correspondantes. Lensemble est illustr de photographies, de nombreux dessins et schmas de principe, dont beaucoup sinspirent dinstruments rels et de documents obtenus auprs des constructeurs. An de maintenir une taille raisonnable lensemble de cet ouvrage, les mthodes plus rarement utilises ou celles en volution rgressive, nont pas t traites. Rdig aussi clairement que possible, le texte sadresse un large ventail dtudiants des IUT (Dpartements chimie, mesures physiques, biologie applique...), des classes de techniciens suprieurs (BTS), des premiers cycles universitaires (DEUG, DEUST), ainsi quaux tudiants des seconds cycles scientiques (licence, IUP, DESS) qui veulent com- plter ou retrouver des connaissances de base, tudies de manire fragmentaire. Ce livre devrait galement tre utile aux participants de cycles de formation continue, aux formations du CNAM et aux agents de matrise de lindustrie, confronts aux problmes danalyse de composs chimiques ou qui ont lintention de prparer des concours. Les besoins en ana- lyse chimique dans des secteurs professionnels qui en taient rests lcart, allie au choix grandissant des techniques et instruments disponibles, justient galement linformation et la mise niveau de nombreuses personnes dont les connaissances ncessitent un recyclage. Ce livre a t conu pour rpondre aux besoins des lecteurs dans le domaine de la chi- mie analytique applique en tant quoutil utilis dans beaucoup de sciences exprimentales et domaines divers. Les connaissances requises pour aborder cet ouvrage correspondent celles des tudiants en premire anne des premiers cycles universitaires, voire pour les- sentiel celles des bacheliers scientiques. Les auteurs se sont donc limits au rappel des principes fondamentaux et ont tenu compte de lvolution des connaissances des tudiants dont lapproche des phnomnes physiques et le bagage mathmatique ont volu. Le texte comporte un minimum de rappels thoriques sur les phnomnes concerns, an de ne pas carter une partie des lecteurs auxquels ce livre est destin. Les intresss pourront, si n- cessaire, aborder ultrieurement, sans difcult majeure, la lecture douvrages spcialiss, en ayant acquis avec ce livre une vision densemble assez complte des mthodes actuelles et de leurs aspects pratiques. 18. XVIII Avant-propos Le contenu de ce livre rete aussi le profond changement dans les techniques analytiques des laboratoires, qui rsulte de laccroissement de la demande, du volume des donnes qui en rsulte, de linformatisation et des besoins nouveaux en analyses de traces notamment. Prsenter plus dune vingtaine de mthodes, avec des exercices (et leur corrigs) sur environ 450 pages peut sembler un d, chacune delles pouvant faire lobjet dun long dveloppement compte tenu du grand nombre dapplications dont elles font toutes lobjet. Cest la raison pour laquelle les auteurs ont prfr se limiter la prsentation des outils plutt que de dcrire tout ce que leur usage permet de faire. Seules les mthodes ont un caractre universel. Les applications ont donc t simplement choisies dans un but illustratif. Ce livre a pour origine le cours et les travaux dirigs effectus aux tudiants de lIUT du Mans depuis de nombreuses annes. Cette nouvelle dition a t actualise et complte, par rapport la prcdente. Une version proche de la 4e dition de cet ouvrage a t traduite en langue anglaise. Elle a pour titre Chemical Analysis, Modern Instrumentation Methods and Techniques, John Wiley & Sons (Chichester, 2000). La 5e dition a t traduite en langue espagnole. Elle a pour titre Anlisis Quimico. Methodos y Tcnicas Instrumentales Modernas, McGraw-Hill Interamericana de Espana, S.A.U. Les auteurs remercient Daniel Cruch, Professeur agrg lIUT du Mans pour ses sug- gestions et qui a complt, pour certains chapitres, le nombre des exercices proposs. Ils remercient galement toutes les socits franaises et trangres contactes pour leur information et qui ont toujours rpondu favorablement. Leur aide a t tout fait prcieuse, tant donn que linstrumentation analytique est un secteur qui simprgne sans retard des progrs technologiques dans des domaines trs varis. Les auteurs expriment enn leur vive reconnaissance au professeur Guy Ourisson, Pr- sident de lAcadmie des Sciences, pour le grand honneur quil leur a fait en acceptant de prfacer les premires ditions de ce livre. Le Mans, Juillet 2004 F. Rouessac & A. Rouessac Liste non exhaustive des socits qui ont aimablement accept de fournir des renseigne- ments et documents, dont certains sont reproduits dans ce livre : Agilent Technologies, American Stress Technologies, Anotec, Antek, Arelco, Asoma, ATI, ATS, Aurora, Bio-Rad, Bosch, Bruker, Camag, Carbone-Lorraine, Chrompack, Ciba, CTTM, Daiiso Com- pany, Desaga, Dionex, DuPont, EG& G-ORTEC, Erba Science, ETP Scientic, Eurolabo, Finnigan, Fisons-Instruments, Foxboro, Galileo, Grasby-Electronics, Hamamatsu, Hamilton, Imaging Sensing Technology, Jeol, Jenway, Jobin-Yvon, Jordan Valley, Labsystems, Leeman Labs., Leybolds, Merck, Metorex, Metrohm, Mettler-Toledo, Microsensor Technology, Nicolet, Oriel, Ortec, Oxford Instru- ments, Perkin-Elmer, PESciex, Pharmacia-Biotech, Philips, Photovac, Polymer Lab., PSS, Rheo- dyne, RTI, Scientec, Scientic Glass Company, Servomex, Shimadzu, Siemens, SMIS, Supelco, Tekmar, Teledyne, Thermo Electron, Thermo-Optek, Thermo-Quest, Thermo Jarrell Ash, Tosohaas, Varian, VG Instruments, Waters, Wilmad. 19. Introduction La chimie analytique est une science proche de la chimie physique. Elle se rapporte ltude du comportement chimique et physique des composs purs ou en solution soumis diverses conditions. En cela cest une science fondamentale et quelquefois abstraite. Elle a aussi pour rle dinterprter les informations recueillies. Mais on la peroit souvent sous son as- pect appliqu, ayant pour objet de mettre en uvre des mthodes appropries dans le but dacqurir des informations sur la nature, la composition et la structure de composs pr- sents dans des chantillons varis. Cet aspect rduit de la chimie analytique nest autre que lanalyse chimique qui rassemble toutes les mthodes et procds permettant de rsoudre les problmes concrets danalyse. Le terme chimique rappelle quil sagit de lanalyse des lments chimiques et des composs dnis qui en drivent. Son tude implique daborder des domaines de connaissances varis. Cest une science multidisciplinaire, de transfert, dont les retombes se font dans toutes les sciences expri- mentales. Elle fait appel pour parvenir ses ns beaucoup de notions dont certaines sont fort loignes de la chimie, au sens habituel de ce terme. En analyse chimique, il est dusage de distinguer deux catgories de mthodes. La pre- mire regroupe les mthodes chimiques proprement dites qui mettent en jeu les proprits chimiques pour obtenir linformation chimique sur la matire traite et la seconde, dorna- vant au premier plan, qui comprend les mthodes physiques et physico-chimiques utilisant des proprits particulires de la matire pour aboutir des mesures en relation avec cette mme information chimique. Les mthodes traditionnelles, dites par voie humide, lorigine du terme de chimie analytique ont beaucoup diminu dimportance. Les analyses actuelles, dont plus de la moiti concerne des composs ltat de traces, vitent en effet de mettre en jeu des r- actions chimiques parce que souvent ces mthodes sont laborieuses, ncessitent des chan- tillons importants car moins sensibles et risquent dtre fausses si on doit utiliser des rac- tifs dont la puret est insufsante. En revanche, un grand nombre danalyses seffectuent par lintermdiaire dinstruments varis que lon trouve souvent installs ailleurs que dans des laboratoires danalyses clas- siques. Beaucoup relvent par exemple de la spectroscopie applique. Ainsi est ne lana- lyse instrumentale avec son formidable arsenal de procds, grce auquel lanalyste est mme de rpondre des demandes de plus en plus nombreuses et varies La chimie analytique est indispensable dans de nombreux secteurs autres que ceux, tra- ditionnels, de la chimie ou de la parachimie. Elle est de plus en plus prsente au sein des activits humaines. Ainsi on la retrouve dans le mdical (elle dbouche ainsi sur les diag- nostics), la biochimie, lagroalimentaire, lenvironnement (pollution), la scurit dans un monde souvent dangereux et dans de nombreux secteurs industriels. 20. 2 Introduction Tout un chacun en bncie. Il nest qu prendre pour exemples toutes les analyses sur la qualit de lair, de leau, des aliments et autres produits essentiels, quentranent les rglementations mises en place au niveau de lEurope, ou concernant la libre circulation des produits. Parmi les tendances actuelles de lanalyse on observe une augmentation des instruments portables et miniaturiss, des analyseurs spciques pour les drogues, les explosifs, les odeurs, les procds, et des applications qui touchent lenvironnement, la bio-pharmacie. Chromatographie liquide Chromatographie gazeuse 28% 17%14%11% 9% 4% 17% Infrarouge Spectromtrie de masse Autres mthodes LIMS Spectromtrie UV/VIS Pour 2003, le chiffre d'affaire mondial prvu est de l'ordre de 20 milliards d'Euros Analyse molculaire Une faon de dnir limportance dune technique est de se reporter aux statistiques co- nomiques concernant les ventes des instruments correspondants. La diffusion dune tech- nique se rpercute sur la probabilit, pour lanalyste, de la rencontrer dans sa vie profes- sionnelle. Ainsi, la statistique ci-dessus fait apparatre que la chromatographie, elle seule, reprsente une large part du chiffre daffaires de linstrumentation danalyse molculaire (par opposition lanalyse lmentaire, 2 fois moins importante). Dans ce domaine rien nest g. Des secteurs nouveaux de lanalyse mergent, des mthodes font leur apparition. Par ailleurs, laspect conomique nest pas le seul qui doit tre pris en compte pour dnir limportance dune mthode. Pour certaines analyses, une mthode, mme trs rare, peut tre la plus importante, ds lors quelle est la seule permettre de rsoudre le problme pos. Lanalyse chimique fait preuve de beaucoup dinnovations. Lvolution des technologies a permis la ralisation dinstruments trs performants, apportant des possibilits nouvelles, notamment avec lintroduction des mthodes couples et des mthodes non destructives, domaine du contrle non destructif qui se contentent de petits chantillons ne ncessitant pas, ou trs peu, de prparation pralable la mesure. Les utilisateurs peuvent dsormais ac- qurir des appareils qui rpondent des normes de prcision et de qualit, ncessaires pour accder la certication, tape importante sinon sufsante, pour faire reconnatre ofciel- lement la qualit des rsultats du laboratoire. Ces procdures daccrditation sont imposes par de nombreux organismes de contrle de tous pays. Pour mener bien ces tudes, lanalyste doit tre form aux diffrentes techniques. Il doit tre expert et connatre les concepts de base de la chimie, sachant quil arrive souvent quun compos puisse tre dos par des mthodes diffrentes. Choisir une bonne mthode, et si possible la meilleure, exige la connaissance de beaucoup de paramtres. On doit se poser tout un ensemble de questions : de quel type dchantillon sagit-il (acier, terre, eau...) ? est-ce un constituant majeur, mineur ou ltat de trace (moins de 0,01 %) ? 21. Introduction 3 sagit-il dune analyse partielle ou complte de lchantillon ? lchantillon doit-il tre rcupr aprs la mesure ? lanalyse demande est-elle unique ou sera-t-elle rptitive ? quel est le degr de prcision ncessaire ? dispose-t-on du personnel comptent pour mener bien lanalyse ? quel sera le cot de lanalyse ? quel est le laps de temps dont on dispose pour fournir le rsultat ? quelle est la abilit des rsultats de la mthode envisage ? quelles sont les consquences derreurs possibles ? Ainsi lorsquun nouvel objectif danalyse a t dni, le problme doit tre abord m- thodiquement. Au dpart, compte tenu de la nature de lanalyte doser, on doit faire le choix de la mthode : mthode spectroscopique, lectrochimique, sparative... Puis vient le choix de la technique : si, par exemple, on a choisi la mthode chromato- graphique, fera-t-on appel la chromatographie en phase gazeuse ou la chromatographie en phase liquide ? Mais avant de commencer lanalyse, se pose galement le choix du procd relatif au prlvement et au traitement pralable faire subir lchantillon, Enn le suivi dun protocole correspond au mode opratoire retenu. Cest la recette du dosage , gnralement un processus faisant lobjet de normes dnies (AFNOR). Cette normalisation porte sur la standardisation des tapes, de la prparation de lchantillon la conduite des mesures. Les rsultats, enn, seront tablis suivant les normes en vigueur, et les donnes brutes de lanalyse seront conserves, par exemple sous forme dun chier informatique qui ne peut tre rcrit. Cet aspect important du travail a fait lobjet de textes ofciels connus sous le nom de Bonnes Pratiques de Laboratoire, ou BPL. Pour conseiller la meilleure mthode an de rsoudre le problme danalyse, il existe une science, appele chimiomtrie. Elle a pour but de venir en aide lanalyste, en fonction des impratifs exigs et selon plusieurs orientations : mthodologie approprie, plan dchan- tillonnage minimum, traitement des donnes et interprtation des rsultats. En sappuyant sur loutil informatique, elle cherche apporter une rponse correcte par exploitation des rsultats au moyen des mthodes statistiques an de rduire le nombre dessais pour les analyses longues ou coteuses. En conclusion, la chimie analytique englobe lanalyse chimique et la chimiomtrie : Lanalyse chimique qui a pour but de donner des rsultats, gnralement quantitatifs (concentrations) ; la chimiomtrie qui regroupe lensemble des mthodes dexploitation et dinterprtation des rsultats pour rsoudre le problme pos. 22. PARTIE 1 Mthodes sparatives 0 2 4 6 8 10 14 1612 18 min. 23. LINVENTION DE LA CHROMATOGRAPHIE On a coutume dattribuer Michel Tswett linvention, peu aprs 1900, de la chromato- graphie actuelle. Au travers de ses publications successives, on peut en effet reconstituer sa dmarche intellectuelle qui en fait un pionnier, si ce nest linventeur, de cette impor- tante mthode sparative. Son domaine de recherche tait li la biochimie des plantes. son poque on savait extraire avec de lthanol la chlorophylle et les autres pigments des plantes vertes, souvent des feuilles. En vaporant ce solvant, il restait un extrait noirtre qui pouvait tre redissous dans bon nombre dautres solvants et en particulier dans lther de ptrole (on dirait maintenant des solvants polaires ou non polaires). Cependant on ne comprenait pas bien pourquoi ce dernier solvant tait incapable dextraire directement la chlorophylle des plantes. Tswett mit lhypothse que dans les plantes la chlorophylle devait tre retenue par des forces qui la xait sur la cellulose, empchant ainsi lther de ptrole de lextraire. Il entrevoyait ici le principe de ladsorption. Pour tester cette hypothse il eut lide de dissoudre lextrait de pigments dans lther de ptrole et dajouter du papier ltre (cellulose), comme succdan du tissu des feuilles. Il saperut alors que le papier captait la teinte et quen ajoutant de lthanol au mlange on pouvait r-extraire ces mmes pigments. En prolongement de ce travail, il dcida de faire des essais systmatiques avec toutes sortes de poudres dont il pouvait disposer. Pour gagner du temps, il avait ralis un montage qui lui permettait de faire plusieurs essais simultanment. Il plaait les poudres tester dans les tubes et il ajoutait chacun deux une solution des pigments dans lther de ptrole. Cela lui permit dobserver que dans certains tubes les poudres laissaient apparatre des anneaux superposs aux couleurs diffrentes, ce qui tmoignait que la force de rtention variait avec la nature des pigments prsents. En rin- ant les colonnes avec des solvants diffrents, il put recueillir sparment certains de ces constituants. La chromatographie moderne tait ne. Cest un peu plus tard, en 1906, quil rdigea la publication (parue dans Ber. Dtsch. Botan., Ges.), dans laquelle il crivit le paragraphe le plus souvent cit : Comme les radiations lumineuses dans le spectre, les diffrents composants dun mlange de pigments, obissant une loi, se trouvent spars sur la colonne de carbonate de calcium et peuvent ensuite tre dtermins qualitativement et quantitativement. Jappelle une telle prparation un chromatogramme et la mthode cor- respondante la mthode chromatographique . 24. Chapitre 1 Chromatographie, aspects gnraux La chromatographie est une mthode de sparation des constituants prsents dans des mlanges varis. Elle sert en analyse pour identier et quantier des composs au sein dchantillons divers. Le principe de base repose sur les quilibres de concentration qui apparaissent lorsquun compos est mis en prsence de deux phases non miscibles. En chromatographie, lune, dite stationnaire, est emprisonne dans une colonne ou xe sur un support et lautre, dite mobile, se dplace au contact de la premire. Si plusieurs compo- ss sont prsents, ils se trouvent entrans des vitesses diffrentes, provoquant leur spara- tion. Ce procd hydrodynamique a donn naissance une mthode analytique instrumen- tale qui a un trs grand domaine dapplicabilit et par suite se trouve trs rpandue. Aucun laboratoire analysant des composs molculaires ne peut ignorer la chromatographie. 1.1 GNRALITS SUR LA CHROMATOGRAPHIE ANALYTIQUE La chromatographie est un procd physico-chimique de sparation, au mme titre que la distillation, la cristallisation ou lextraction fractionne, des constituants dun mlange ho- mogne liquide ou gazeux. Les applications de ce procd sont donc potentiellement trs nombreuses, dautant plus que beaucoup de mlanges htrognes ou sous forme solide peuvent tre mis en solution par emploi dun solvant (celui-ci apparaissant comme un com- pos supplmentaire). Lexprience de base en chromatographie peut tre dcrite comme suit (g. 1.1) : 1. On immobilise dans une colonne un solide nement divis appel phase stationnaire. 2. On place au sommet de cette colonne un petit volume de lchantillon sparer. 3. On force cet chantillon traverser la colonne de haut en bas au moyen de la phase mobile an dentraner ses divers constituants. Si les composs prsents migrent des vitesses diffrentes, ils pourront tre recueillis sparment, chacun en solution dans la phase mobile. En dehors de cette exploitation de la chromatographie qui perdure depuis son origine, ce procd est devenu en soi une mthode danalyse lorsquon eut lide de mesurer les temps de migration des composs dans la colonne pour les identier. Pour cela il devenait indis- pensable de matriser certains paramtres (dbits, temprature...) et il fallait placer en sortie de colonne un dtecteur pour reprer les changements de composition de la phase mobile. 25. 8 Partie 1 Mthodes sparatives Cette application de la chromatographie, dont le but nest plus de rcuprer les composs spars mais de mesurer leurs temps de passage dans la colonne sest dveloppe lentement. Ech. Ech. Ech. PM PM PM PM C a b c d PS PS b b a a c c 1 2 3... PS Figure 1.1 Lexprience de base en chromatographie. a) Les ingrdients ncessaires C, colonne, PS, phase stationnaire, PM, phase mobile et E, chantillon ; b), le dpt de lchantillon ; c) le dbut de llution ; d) la rcupration des produits aprs sparation. Lidentication dun compos par chromatographie correspond une mthode compara- tive. Pour identier un compos, dont on ne sait sil sagit de A ou de B, par la mthode chromatographique, on compare son temps de migration ceux des deux composs de rf- rence A et B, ceci, sans changer dappareillage et en se plaant dans les mmes conditions exprimentales. Dans une telle exprience de chromatographie analytique, on na pas effectu des spara- tions (il sagit de produits purs) mais simplement repr des temps de migration. Cependant il apparat trois points faibles cette mthode : le procd est assez long de mise en uvre, lidentication nest pas absolue, et le contact physique entre lchantillon et la phase sta- tionnaire peut modier ses proprits demeure, en particulier les temps de rtention. Ce procd particulier de fractionnement est n, sous sa forme moderne, au dbut du sicle dernier des travaux du botaniste Michal Tswett qui on attribue galement linven- tion des termes de chromatographie et de chromatogramme. La technique sest considrablement amliore depuis ses dbuts. On dispose actuelle- ment de chromatographes pilots par des logiciels qui rassemblent autour dune colonne performante et miniaturise pour pouvoir sparer des micro-quantits dchantillon tout un ensemble daccessoires destins assurer la rptabilit des expriences successives par la matrise parfaite des diffrents paramtres de sparation. Pour des analyses successives dun mme chantillon, ralises dans des conditions identiques plusieurs heures dinter- valle, les temps de rtention sont reproductibles la seconde prs (g. 1.2). Chaque sparation effectue donne lieu un enregistrement particulier appel chromato- gramme, qui correspond au trac des variations de composition de la phase lue au cours du temps. Pour obtenir ce document particulier, il faut placer lextrmit aval de la colonne un capteur dont il existe un grand nombre de variantes. 26. 1 Chromatographie, aspects gnraux 9 a alimentation en phase mobile temps chromatogramme dtecteur b ou 0 1 1 2 2 3 3 Figure 1.2 Principe de lanalyse par chromatographie. Le chromatogramme, passage oblig de toute analyse chromatographique, est obtenu partir des variations en fonction du temps dun signal lectrique envoy par le dtec- teur. Il est soit prsent en temps rel soit en diffr partir des valeurs instantanes mises en mmoire dans un micro-ordinateur. Les logiciels de chromatographie recal- culent ces valeurs pour tre mises au format dsir (a, imprimante). Pendant longtemps il a t obtenu avec un simple enregistreur graphique ou un enregistreur-intgrateur (b). Chromatogramme illustrant la sparation dun mlange de 3 constituants princi- paux. Noter lordre dapparition des pics en correspondance avec la position de chaque constituant dans la colonne. Lidentication dun compos molculaire, partir du chromatogramme, est quelque- fois alatoire. Une manire plus sre consiste associer deux techniques complmentaires. On runit, par exemple, un chromatographe et un second appareil en ligne , tel un spec- tromtre de masse ou un spectromtre infrarouge. Ces mthodes couples, du second ordre (ou bidimensionnelles) permettent de rcuprer deux types dinformations indpendantes (temps de migration et spectre ). On peut alors dterminer avec certitude la composition de mlanges complexes ou la concentration de certains composs partir de quantits de lordre du nanogramme (analyses de conrmation). 1.2 LE CHROMATOGRAMME Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps dun para- mtre reli la concentration instantane du solut en sortie de colonne (g. 1.3). Le temps (ou trs rarement le volume dlution) est port en abscisse et lintensit du signal de d- tection en ordonne. La ligne de base correspond au trac obtenu en labsence de compos lu. La sparation est complte quand le chromatogramme prsente autant de pics chroma- tographiques revenant la ligne de base quil y a de composs dans le mlange analyser. Un constituant est caractris par son temps de rtention tR, qui reprsente le temps coul entre linstant de linjection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maxi- mum du pic qui lui est li. Dans le cas idal tR est indpendant de la quantit injecte. Un constituant non retenu sort de la colonne au temps tM, appel temps mort (1) (dsign galement par t0). (1) Les symboles utiliss suivent les recommandations de lIUPAC Pure & Appl. Chem, 65(4), 819, (1993). DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 27. 10 Partie 1 Mthodes sparatives La diffrence entre le temps de rtention et le temps mort est dsigne par le temps de rtention rduit du compos tR. En analyse quantitative on se contente le plus souvent de bien sparer du mlange le ou les constituants doser. Si le signal envoy par le capteur varie linairement avec la concentration dun compos, il en sera de mme de laire du pic correspondant sur le chro- matogramme. min t'R tM (ou t )0 tR0 temps a) b) c) d) 0,4 0,399 0,242 0,199 0 10 20 30 courbe de Gauss avec 20 et = 1 l'aire comprise entre -2 et +2 vaut 95,4% de l'aire totale comprise entre la courbe et l'axe des x temps de rtention 0,054 = 2,35 = 4 = 1,7 I I -2 0 1 +2 100% 60,6% 50% 13,5% caractristiques du pic idal comparaison entre un chromatogramme rel et des courbes gaussiennes x courbe gaussienne O Figure 1.3 Pics chromatographiques. a) Notion de temps de rtention ; b) exemple de trac de la fonction 1.2 ; c) signication des trois paramtres classiques et rsum des caractristiques dune courbe de Gauss ; d) un exemple de chromatogramme rel qui montre que llution des composs peut conduire des pics qui ressemblent vraiment des courbes gaussiennes. 28. 1 Chromatographie, aspects gnraux 11 1.3 PICS DLUTION GAUSSIENS Un pic dlution idal, sur un chromatogramme, a le mme aspect que la reprsentation graphique de la loi Normale de distribution des erreurs alatoires (courbe de Gauss 1.2, cf. 22.3). En conservant les notations classiques, m correspond ici au temps de rtention et s lcart-type du pic dlution (dont le carr symbolise la variance). y reprsente le signal, en fonction du temps x, du dtecteur situ en sortie de colonne (g. 1.3). Cest pourquoi, an de modliser le signal dun pic dlution parfait dun constituant, on se sert de la fonction densit de probabilit (1.2). y = 1 s 2p exp (x m)2 2 s2 (1.1) y = 1 2p exp x2 2 (1.2) Cette fonction caractrise une courbe paire (maximum pour x = 0, y = 0,399) qui possde deux points dinexion pour x = 1 (g. 1.3), dont lordonne est de 0,242 (soit 60,6 % de la valeur du maximum) et dont la largeur aux points dinexion est gale 2s, (s = 1). En chromatographie, d dsigne la largeur mi-hauteur (d = 2,35 s) et s2 la variance du pic. La largeur la base du pic, appele v est mesure 13,5 % de la hauteur, point o, la courbe tant gaussienne, on a v = 4s par dnition. Les chromatogrammes rels sont quelquefois loin de prsenter des pics daspect gaussien. Il y a plusieurs raisons cela. En particulier il se produit une irrgularit de concentration dans la zone de dpt de la substance en tte de colonne. De plus, la vitesse de la phase mobile est nulle au niveau de la paroi et maximum au centre de la colonne. Lasymtrie observe dun pic est traduite par deux paramtres appels facteur dasymtrie (Fa) et facteur de trane (Ft ), mesurs 10 % de sa hauteur (pour la signication de a et b, voir gure 1.4) : Fa = b a (1.3) Ft = a + b 2a (1.4) 1.4 MODLE DES PLATEAUX Depuis un demi-sicle, diffrentes thories visant modliser la chromatographie ont t et continuent tre proposes. Les plus connues sont les approches statistiques (thorie stochastique), le modle des plateaux, et lapproche par la dynamique molculaire. Pour expliquer le mcanisme de migration et de sparation des composs dans la colonne, le modle le plus ancien, ou modle des plateaux de Craig, est une approche statique, juge obsolte, mais qui permet de dcrire de manire simple les sparations. DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 29. 12 Partie 1 Mthodes sparatives temps temps temps CM CM CM isotherme concaveisotherme convexeisotherme linaire CS CS CS a b c 100 10 0 a b F > 1t F = 1t F < 1t F > 1a F = 1a F < 1a Figure 1.4 Isothermes de distribution. a) Situation idale correspondant linvariance de lisotherme de concentration ; b) si- tuation dans laquelle la phase stationnaire est sature de ce fait la monte du pic est plus rapide que la descente (facteur de trane plus grand que 1) ; c) situation inverse : le constituant est trop retenu dans la phase stationnaire, le temps de rtention est allong et la monte du pic est plus lente que la descente, qui apparat normale. Pour chaque type de colonne, les fabriquants indiquent quelle est leur capacit limite expri- me en ng/compos, avant dformation du pic. Les situations a, b et c sont illustres avec des chromatogrammes rels en CLHP. Bien que la chromatographie soit un phnomne continu, on considre dans le modle statique de Craig, que chaque solut se dplace progressivement en une suite dtapes dis- tinctes. Le processus lmentaire est reprsent par un cycle dadsorption/dsorption. Len- chanement de ces tapes reproduit la migration des uides dans la colonne, de mme quun lm de dessins anims donne lillusion du mouvement par un suite dimages xes. Chaque tape correspond un nouvel tat dquilibre de toute la colonne. Ces quilibres successifs sont la base de la notion de plateau thorique selon lequel la colonne de longueur L est dcoupe en N petits disques ctifs de mme hauteur H, numrots de 1 n. Pour chacun deux, la concentration du solut dans la phase mobile est en quilibre avec la concentration dans la phase stationnaire de ce solut. chaque nouvel quilibre le solut a progress dun petit disque supplmentaire dans la colonne, appel plateau thorique. La hauteur quivalente un plateau thorique (HEPT ou H) vaut donc (1.5) : H = L N (1.5) Cette approche fait appel aux rgles de dveloppement des polynmes pour calculer, au niveau de chaque plateau, les masses rparties entre les deux phases en prsence. 30. 1 Chromatographie, aspects gnraux 13 plateau J-1 plateau J instant I-1 (I-1, J) (I-1, J-1) instant I (I, J) (I, J-1) plateau J+1 ... Si on se place linstant I, le plateau J contient une masse totale de solut mT qui se compose de la quantit mM de ce solut qui vient darriver de la phase mobile du plateau J 1, en quilibre linstant I 1, laquelle sajoute la quantit mS dj pr- sente dans la phase stationnaire du plateau J linstant I 1. mT (I, J) = mM(I 1, J 1) + mS(I 1, J) En posant que pour chaque plateau mS = KmM et mT = mM + mS, on peut, par une formule de rcurrence, calculer mT (ainsi que mM et mS). tant donn que, pour chaque plateau, le solut est en quilibre de concentration entre les deux phases, la masse totale de solut en solution dans le volume de phase mobile VM de la colonne demeure constante, tant que le solut na pas atteint son extrmit. Quant au chromatogramme, il correspond la masse transitant par la phase mobile au (N + 1)e plateau (g. 1.5) au cours des quilibres successifs. Cette thorie a pour dfaut de ne pas tenir compte de la dispersion due la diffusion des composs dans la colonne. compos A compos B 1 100 concentrations(g/mL) 1 5 10 15 20 25 fractions d'lution Figure 1.5 Modle des plateaux. Simulation laide dun tableur de llution de deux composs A et B, chromatogra- phis sur une colonne de 30 plateaux (KA= 0,6 ; KB=1,6 ; MA=300 mg ; MB=300 mg). Composition du mlange en sortie de colonne pour les 100 premiers quilibres. Lappli- cation de ce modle montre lvidence une forme de pic non symtrique. Cependant, compte tenu de la diffusion, et comme le nombre dquilibres est trs grand, la courbe prend de plus en plus nettement laspect dune courbe de Gauss. Le terme de plateau thorique vient dune approche ancienne dcrivant la chromatogra- phie en prenant pour modle la distillation par Martin et Synge (prix Nobel de chimie en 1952). Ce terme ancr pour des raisons historiques na pas la signication physique de son homonyme servant mesurer les performances dune colonne distiller. Il aurait peut-tre t prfrable de le baptiser par exemple du nom de Tswett ! DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 31. 14 Partie 1 Mthodes sparatives Le temps total tR de migration du solut dans la colonne peut tre spar en deux termes : le temps tM pendant lequel il est dissous dans la phase mobile et o il progresse la mme vitesse que celle-ci, et le temps tS pendant lequel il est x la phase stationnaire et o il est donc immobile. Entre deux transferts successifs dune phase lautre, on admet que les concentrations ont le temps de se rquilibrer. La chromatographie fait intervenir au moins trois quilibres : solut/phase mobile, so- lut/phase stationnaire et phase mobile/phase stationnaire. Dans une thorie rcente de la chromatographie, on ne parle plus de molcules immobilises par la phase stationnaire mais simplement ralenties lorsquelles passent proximit. 1.5 COEFFICIENT (OU CONSTANTE) DE DISTRIBUTION DE NERNST (K) Cest le paramtre physico-chimique de base en chromatographie qui quantie le rapport de concentration de chaque compos entre les deux phases en prsence. K = CS CM = concentration du solut dans la phase stationnaire concentration du solut dans la phase mobile (1.6) Les valeurs de K sont trs variables. Elles sont grandes (1 000, par exemple) lorsque la phase mobile est un gaz, et petites (2, par ex.) lorsque les deux phases sont ltat condens. Chaque compos noccupant quun espace limit de la colonne et de plus avec une concen- tration variable, les valeurs vraies de CM et de CS ne sont pas accessibles mais leur rapport est constant. Chromatographie et thermodynamique. Les relations de la thermodynamique sap- pliquent aux quilibres de distribution ci-dessus. K, (CS/CM ), constante dquilibre rela- tive aux concentrations C du compos en prsence des deux phases mobile (M) et station- naire (S), est calculable partir dexpriences de chromatographie. On peut donc accder, connaissant la temprature de lexprience, la variation dnergie libre standard DG0 de cette transformation : CM CS DG0 = RT ln K Si, en chromatographie en phase gazeuse, par exemple, on dtermine K deux tempra- tures, il est possible de calculer (en admettant que lenthalpie et lentropie nont pas chang), les variations denthalpie standard DH0 et dentropie DS0 : DG0 = DH0 T DS0 Les valeurs de ces trois paramtres sont ngatives, en accord avec la spontanit de cette transformation. Il est galement logique que lentropie diminue quand le compos quitte la phase mobile pour se xer sur la phase stationnaire. De mme lquation de van t Hoff per- met, entre autres, une approche plus rigoureuse de leffet de la temprature sur les temps de rtention dun compos. On comprend donc que dans toute tude complte de la chromato- graphie, on fasse appel la thermodynamique classique. d ln K dT = DH RT 2 32. 1 Chromatographie, aspects gnraux 15 1.6 EFFICACIT DUNE COLONNE 1.6.1 Efcacit thorique (nombre de plateaux thoriques) mesure que le solut migre dans la colonne, il occupe une zone allant slargissant (g. 1.6). Cette dispersion linaire sl, repre par la variance s2 l crot avec la distance parcourue. Lorsque cette distance vaut L, longueur de la colonne, on pose : s2 L = H L (1.7) En rappel du modle de la thorie des plateaux, cette approche conduit la valeur de la hauteur quivalente un plateau thorique H et au nombre N de plateaux thoriques (N = L/H). Donc, pour tout chromatogramme, partir dun pic dlution dun compos, dont on pourra mesurer la variance temporelle s2 , on pourra calculer pour le compos en question lefcacit thorique N (1.8) et en dduire la valeur de H sachant que H = L/N. N = L2 s2 L ou N = t2 R s2 (1.8) Ces deux paramtres sont accessibles de manire indirecte partir du pic dlution du compos. On mesure tR et s dont le rapport mme valeur que celui de L et de sL (1.8). chromatogramme luant dtecteur signal tR0 0 temps t conc. dans colonne L Figure 1.6 Dispersion dun solut dans une colonne et traduction sur le chromatogramme. La courbe de gauche correspond une image isochrone de la concentration du com- pos lu linstant considr, et le chromatogramme de droite, la variation de la concentration en sortie de colonne en fonction du temps. tR et s sont dans le mme rapport que L et sL. Lefcacit N peut tre calcule partir du chromatogramme en uti- lisant un double dcimtre. Sur le graphe ci-dessus on trouverait environ 100 plateaux thoriques. Sur le chromatogramme, s reprsente la demi-largeur du pic 60,6 % de sa hauteur et tR le temps de rtention du compos. tR et s doivent tre mesurs dans la mme unit (temps, distances ou volumes couls, si le dbit est constant). Si on exprime s en units de volume (en faisant intervenir le dbit), 4s correspond au volume du pic soit 95 % du compos inject. Par suite des proprits de la courbe de Gauss (v = 4s), il en rsulte la formule 1.9. Les pics tant assez souvent dforms la base, cette dernire est rarement employe : on utilise de prfrence la formule quivalente 1.10. N est un paramtre relatif, puisquil dpend la fois du solut et des conditions op- ratoires suivies. On choisit gnralement un constituant qui apparat en n ce chromato- DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 33. 16 Partie 1 Mthodes sparatives gramme pour avoir une valeur repre, dfaut de savoir si la colonne permet de russir une sparation donne. N = 16 t2 R v2 (1.9) N = 5,54 t2 R d2 (1.10) 1.6.2 Efcacit relle (nombre de plateaux thoriques effectifs) An de comparer les performances de colonnes de conceptions diffrentes, vis--vis dun mme compos, ctait notamment le cas en CPG lorsquon voulait comparer les perfor- mances dune colonne capillaire et dune colonne remplie on remplace le temps total tR qui gure dans les expressions 1.8 1.10 par le temps de rtention rduit tR qui ne tient pas compte du temps mort tM pass par le compos dans la phase mobile. Les trois prcdentes expressions deviennent : Neff = t 2 R s2 (1.11) Neff = 16 t 2 R v2 (1.12) Neff = 5,54 t 2 R d2 (1.13) On considre actuellement que ces trois dernires relations ne sont plus de grande utilit. 1.6.3 Hauteur de plateau La hauteur quivalent un plateau thorique H a dj t dnie (formule 1.5). Ce para- mtre est calcul pour des composs de rfrence car il permet de comparer des colonnes de longueurs diffrentes, bien quil ne sagisse en aucune faon dune constante. Sa valeur dpend du compos choisi et des conditions de lexprience. En chromatographie gazeuse, on a longtemps utilis une valeur corrige appele hauteur de plateau effectif Heff faisant intervenir lefcacit relle la place de lefcacit thorique. Le calcul de Heff partir de lefcacit relle utilise lexpression 1.14 : Heff = L Neff (1.14) Hauteur de plateau rduite. En chromatographie dont la phase mobile est un liquide et pour les colonnes dont le remplissage est form de particules sphriques, on rencontre assez souvent la hauteur de plateau rduite, h, qui tient compte du diamtre moyen dm des particules. On limine en quelque sorte leffet de la taille des particules. Des colonnes pr- sentant le mme rapport (longueur de la colonne)/(diamtre des particules) conduisent des performances semblables. h = H dm = L N dm (1.15) 34. 1 Chromatographie, aspects gnraux 17 1.7 GRANDEURS DE RTENTION 1.7.1 Temps de rtention La dnition du temps de rtention a t prcdemment donne dans le paragraphe 1.2. 1.7.2 Volume dlution ou volume de rtention VR Le volume dlution (de rtention) VR de chaque solut reprsente le volume de phase mobile ncessaire pour le faire migrer dune extrmit lautre de la colonne. Il correspond sur le chromatogramme au volume de la phase mobile qui sest coul entre linstant de linjection et celui correspondant au maximum du pic. Si le dbit D est stationnaire, VR = tR D (1.16) Volume dun pic, Vpic. Il correspond au volume de phase mobile dans lequel le compos est dilu en sortie de colonne. Il vaut par dnition : Vpic = vD (1.17) 1.7.3 Volume de la phase mobile dans la colonne (volume mort VM) Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appel volume mort) VM corres- pond au volume interstitiel accessible. Il peut tre calcul daprs le chromatogramme, condition dintroduire un solut non retenu par la phase stationnaire. On peut lexprimer en fonction de tM et du dbit D : VM = tM D (1.18) 1.7.4 Volume de la phase stationnaire Ce volume dsign par VS napparat pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples on le calcule en retranchant du volume total interne de la colonne vide le volume de la phase mobile. 1.7.5 Facteur de rtention k (ou de capacit) Quand un compos de masse totale mT est introduit dans la colonne, il se rpartit en deux quantits : mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire. Si on ne change pas les conditions opratoires, ces deux quantits demeurent constantes au cours de sa migration dans la colonne. Leur rapport, appel facteur de rtention, est indpendant de mT : k = mS mM = CS VS CM VM = K VS VM (1.19) Le facteur de rtention, encore appel facteur de capacit k, est un paramtre trs impor- tant de la chromatographie. Il est dni en rgime isocratique. Ce nest pas une constante, bien quil ne varie pas avec le dbit ou la longueur de la colonne, car il dpend des condi- tions opratoires. Pour cette raison il est quelque fois dsign par k au lieu de k. Ce paramtre rend compte de la facult plus ou moins grande de la colonne retenir chaque compos (capacit). Dans la mise au point des sparations on fait en sorte que k ne dpasse pas 10, an de ne pas trop allonger le temps de passage des composs. DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 35. 18 Partie 1 Mthodes sparatives Approche exprimentale du facteur de rtention k En sappuyant sur le modle de Craig, on imagine que chaque molcule dun compos passe alternativement de la phase mobile (o elle progresse la vitesse de celle-ci), la phase stationnaire (o elle est alors immobile). Sa vitesse moyenne de progression dans la colonne est donc dautant plus lente que le cumul des temps passs dans la phase stationnaire est plus grand. Si on extrapole maintenant au cas de n molcules semblables de ce compos (lchan- tillon de masse mT ), on admettra qu chaque instant, le rapport du nombre des nS mo- lcules xes sur la phase stationnaire (masse mS) et des nM molcules prsentes dans la phase mobile (masse mM), est le mme que celui des temps passs dans chaque phase pour une molcule isole. Les trois rapports suivants ont donc mme valeur : nS nM = mS mM = tS tM = k Prenons le cas dune molcule qui passe les 3/4 de son temps dans la phase stationnaire. Sa vitesse moyenne sera 4 fois plus lente que si elle restait en permanence dans la phase mobile. Par consquent si 4 mg de compos ont t introduits dans la colonne, il y aura en moyenne et en permanence 1 mg dans la phase mobile et 3 mg dans la phase stationnaire. Sachant que le temps de rtention dun compos tR est tel que tR = tM + tS , la valeur de k est donc accessible partir du chromatogramme (tS = tR) (voir gure 1.7) : k = tR tM = tR tM tM (1.20) Cette relation importante est galement souvent rencontre sous la forme : tR = tM(1 + k) (1.21) Compte tenu des relations 1.16 et 1.18, le volume de rtention VR dun solut pourra scrire : VR = VM(1 + k) (1.22) ou : VR = VM + K VS (1.23) Cette dernire expression qui relie les paramtres exprimentaux au coefcient thermo- dynamique de distribution K est valable pour une chromatographie idale. 1.8 FACTEUR DE SPARATION (OU SLECTIVIT) ENTRE DEUX SOLUTS Le facteur de sparation a (1.24) permet de prciser les positions relatives de deux pics adjacents 1 et 2 sur un chromatogramme (g. 1.7). Il est dni par les relations suivantes (1.24 et 1.25). Il ne peut, par dnition, tre infrieur 1 : a = tR(2) tR(1) (1.24) 36. 1 Chromatographie, aspects gnraux 19 ou a = k2 k1 = K2 K1 (1.25) tM (ou t )0 tR1 tR20 temps ici, on a : = = 1,3 t'R2 t'R1 k =1 t'R1 tM k = 42 k = 3,081 k =2 t'R2 tM 1 2t'R2 t'R1 tM Figure 1.7 Facteurs de rtention et de sparation entre deux composs adjacents. Chaque compos a un facteur de rtention qui lui est propre. a lui seul, ne permet pas de savoir si la sparation est rellement possible. Sur cette gure, le facteur de sparation est denviron 1,3. Pour des pics non adjacents, on dnit le facteur de rtention relative r, qui, calcul comme a, ne peut tre infrieur 1. 1.9 FACTEUR DE RSOLUTION ENTRE DEUX PICS Pour traduire numriquement la plus ou moins bonne sparation entre deux composs, on utilise le facteur de rsolution R qui est calcul partir du chromatogramme (g. 1.8) : R = 2 tR(2) tR(1) v1 + v2 (1.26) Il existe, pour exprimer la rsolution, dautres relations drives des prcdentes, tablies en vue de remplacer un paramtre par un autre, ou admettant des hypothses simplicatrices. Ainsi les deux expressions 1.27 et 1.28 sont-elles trs souvent employes. La relation 1.28 montre linuence, sur la rsolution, de lefcacit, du facteur de capacit et de la slectivit. La gure 1.9 en est une vrication exprimentale. R = 1,177 tR(2) tR(1) d1 + d2 (1.27) R = 1 4 N2 a 1 a k2 1 + k2 (1.28) R = N 2 k2 k1 k1 + k2 + 2 (1.29) DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 37. 20 Partie 1 Mthodes sparatives 0,27 0,02 0,65 R = 0,75 R = 1 R = 1,5 1 1 1 Figure 1.8 Facteur de rsolution. Simulation de pics chromatographiques par juxtaposition plus ou moins rapproche de 2 courbes gaussiennes identiques. Aspect visuel correspondant aux valeurs de R indiques sur les diagrammes. partir de R = 1,5 on considre que les pics sont rsolus, la valle entre les pics tant denviron 2 %. R = 4,15 0 5 10 15 20 min 15,3 min 7,5 min R = 2,91 3,7 min R = 2,05 15 m 30 m 60 m Figure 1.9 Effet de la longueur de la colonne sur la rsolution. Expriences faites en chromatographie en phase gazeuse en modiant seulement la lon- gueur de la colonne capillaire On illustre ainsi quen doublant la longueur de la colonne la rsolution est multiplie par 1,41 (adapt dun document de la socit Waters). 1.10 INFLUENCE DE LA VITESSE DE LA PHASE MOBILE Dans tout ce qui prcde, en particulier dans les diffrentes expressions caractrisant les sparations, la vitesse de la phase mobile dans la colonne nest pas prise en compte. Or, de toute vidence, cette vitesse doit avoir une incidence sur la progression des analytes dans la colonne, donc sur leur dispersion, en bref sur la qualit de lanalyse en cours. Linuence de la vitesse de la phase mobile a t mise en vidence par Van Deemter qui a propos la premire quation cintique, dans le cas des colonnes remplies en chromato- graphie en phase gazeuse. 38. 1 Chromatographie, aspects gnraux 21 1.10.1 quation de Van Deemter La forme simplie, propose par cet auteur en 1956, est trs connue en chromatographie en phase gazeuse, pour les colonnes remplies (1.30). Elle relie H (HEPT) la vitesse linaire moyenne dcoulement de la phase mobile u dans la colonne (g. 1.10) : H = A + B u + C u (1.30) Cette quation montre quil existe un dbit optimal pour chaque colonne, correspondant au minimum de H, tel que le prvoit la courbe reprsentant lquation 1.30. La diminution de lefcacit, quand le dbit crot, correspond un rsultat que chacun a pu dcouvrir ses dpens en voulant acclrer une sparation chromatographique par augmentation du dbit de la phase mobile. Ce qui est moins intuitif par contre, est la perte defcacit due un dbit trop lent. Pour expliquer ce phnomne, il faut revenir sur lorigine des termes A, B et C dont chacun a un domaine dinuence qui peut tre repr sur le graphe (g. 1.10). Les trois coefcients numriques exprimentaux A, B et C sont relis divers paramtres physico-chimiques, la colonne et aux conditions opratoires. Si on choisit dexprimer H en cm, A sera en cm, B en cm2 /s et C en s (la vitesse tant en cm/s). La courbe reprsentative de cette fonction est une branche dhyperbole qui passe par un minimum (Hmin) pour : uopt. = B C (1.31) A, terme de remplissage A = 2 llldp Le terme A est en relation avec le prol dcoulement de la phase mobile travers la phase stationnaire. La taille des particules (de diamtre dp), leur rpartition dimensionnelle et la rgularit du remplissage (paramtre l) sont lorigine de chemins prfrentiels qui peuvent conduire des changes imparfaits entre les deux phases. Cest le facteur de diffu- sion dEddy, ou diffusion turbulente, considr comme peu important en chromatographie liquide et absent par nature pour les colonnes capillaires WCOT en CPG (quation de Golay sans terme A, cf. 1.10.2). B, terme de diffusion dans la phase mobile B = 2ggg DG Le second terme B, qui peut tre exprim partir de DG, coefcient de diffusion de lana- lyte dans la phase mobile et g, facteur de tortuosit, est considrer surtout si la phase mobile est un gaz. La diffusion longitudinale dans la colonne est, en effet, rapide. Cest une consquence de lentropie qui nous rappelle quun systme volue spontanment vers un plus grand dsordre, telle la goutte dencre qui diffuse dans le verre deau o elle vient de tomber. En consquence, si le dbit est trop faible, les produits en cours de sparation se mlangent nouveau plus vite quils ne migrent. On retiendra ce propos quon ne doit jamais interrompre provisoirement une chromatographie en cours, au risque de perdre toute efcacit. C, terme de transfert de masse C = CG + CL Le terme C, d la rsistance au transfert de masse du solut entre les deux phases, de- vient prpondrant lorsque le passage est trop rapide pour que lquilibre soit atteint. Des DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 39. 22 Partie 1 Mthodes sparatives turbulences locales au sein de la phase mobile et des gradients de concentration ont pour consquence de retarder la mise en quilibre (CS CM). La diffusion entre les deux phases nest pas instantane, si bien que le solut sera entran hors quilibre. Il nexiste pas de for- mule simple rendant compte des diffrents facteurs intgrs dans le paramtre C. Le terme CG dpend du coefcient de diffusion du solut dans la phase mobile gazeuse, alors que le paramtre CL dpend du coefcient de diffusion dans la phase stationnaire liquide. A, terme de remplissage B longitudinale, terme de diffusion C, terme de transfert de masse 0 20 40 60 80 100 cm/s. Hmin. H (HEPT) m H = A + Cu 0 2 4 6 8 10 12 14 colonne uopt. u moyenne C A B HA H = H + H + HA B C HB HC phase mobile B C Figure 1.10 Courbe de Van Deemter en chromatographie gazeuse avec indication des domaines propres A, B et C. Il existe galement une quation semblable celle de Van Deemter qui fait intervenir cette fois la temprature : H = A + B/T + CT. Dans la pratique on accde aux valeurs des coefcients A, B, C, en faisant plusieurs me- sures defcacit pour un mme compos chromatographi des dbits diffrents, puisque dbit et vitesse linaire moyenne sont relis. On calcule ensuite lquation de lhyperbole qui satisfait au mieux les valeurs exprimentales, de prfrence par la mthode de rgres- sion linaire multiple. 1.10.2 quation de Golay En 1958, Golay a propos une quation comparable rserve aux seules colonnes capillaires de la chromatographie en phase gazeuse. H = B u + CL u + CG u (1.32) La relation 1.32 permet dtablir une HEPT minimum pour toute colonne de rayon r si lon connat le facteur de rtention du compos test. On peut calculer alors lefcacit dimprgnation (coating efciency) de la colonne qui est gale au produit par 100 du rapport de la valeur ainsi trouve et de celle qui est dduite de lefcacit (H = L/N) obtenue partir du chromatogramme. Hmin. tho. = r 1 + 6 k + 11 k2 3(1 + k)2 (1.33) 40. 1 Chromatographie, aspects gnraux 23 1.10.3 quation de Knox Une autre quation connue sous le nom dquation de Knox plus rcente (1977), est ap- plicable aux divers types de chromatographie liquide. Elle fait intervenir la hauteur rduite : h = A u1/3 + B u + C u (1.34) 1.11 OPTIMISATION DUNE ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE La chromatographie analytique est essentiellement utilise en analyse quantitative. cette n, il faut pouvoir dterminer les aires des pics des espces doser, donc les sparer. Pour y parvenir on fait de plus en plus souvent appel des logiciels doptimisation bass sur la connaissance du processus chromatographique. Cest ltape de loptimisation de lanalyse qui met prot les connaissances de lanalyste et les ressources de lappareil pour simuler les rsultats attendre des modications de la composition de la phase mobile et dautres paramtres physico-chimiques tels la temprature ou le pH dans le cas de substances ioni- sables. En chromatographie en phase gazeuse, les sparations peuvent tre si complexes quon ne peut dterminer par avance sil est prfrable de baisser ou dlever la temprature. Le choix de la colonne, de sa longueur, de son diamtre, de la phase stationnaire, du rapport de phase ainsi que des paramtres de sparation (temprature et dbit), sont autant de facteurs qui interagissent les uns sur les autres. La rsolution et le temps dlution sont les deux variables dpendantes les plus impor- tantes considrer. Dans toute optimisation, le but est de russir une sparation sufsante du ou des composs intressants en un minimum de temps. Dans certains cas, il ne faut tou- tefois pas oublier le temps ncessaire la colonne pour revenir aux conditions initiales avant deffectuer lanalyse suivante. La chromatographie correspond en effet un type danalyse lente. Si la rsolution est trs bonne, loptimisation aura encore sa raison dtre pour gagner du temps en utilisant une colonne plus courte sachant que la rsolution est affecte dun facteur faisant intervenir la racine carre de la longueur de la colonne (cf. le paramtre N de la formule 1.28 et la gure 1.9). Quand on modie le dbit dans une sparation avec gradient on observe des change- ments importants sur le chromatogramme. La slectivit entre pics est perturbe, comme le sont bien sr les temps de rtention. La gure 1.11 illustre par un exemple loptimisation dune sparation, en chromatographie liquide, dun mlange dhydrocarbures aromatiques par modication de la composition de la phase mobile. On remarquera que cette optimi- sation saccompagne dune augmentation importante du temps danalyse pour boucler le cycle . Si on ne sintresse qu certains des composs prsents, on peut faire appel un dtec- teur slectif qui ne verra, la limite, queux seuls. Dans dautres cas, par contre, on sattache sparer le plus grand nombre possible de composs du mlange initial. Suivant les types de chromatographie, loptimisation est plus ou moins rapide. En chro- matographie en phase gazeuse elle est plus facile quen chromatographie liquide o inter- vient la composition de la phase mobile : des logiciels ont t spcialement crs pour aider DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 41. 24 Partie 1 Mthodes sparatives 910 2 3 4 5 6 7 8 2 6410 53 8 100 2 1612 144 6min 0 41 2 3 min a b c d Figure 1.11 Chromatogrammes dune sparation. La phase mobile est un mlange binaire eau/actonitrile : a) 50/50 ; b) 55/45 ; c) 60/40 ; d) 6/35. La che indique le temps mort tM (min), (selon J.W. Dolan, LC-GC Int, 1994, 7(6), 333). au meilleur choix de la composition de la phase mobile. Moyennant certaines hypothses (pics gaussiens ou non), on peut calculer avec assez de prcision les aires des pics mal rsolus. Le chromatographiste est toujours prisonnier dun triangle dont les sommets corres- pondent la rsolution, la vitesse et la capacit, trois paramtres qui sopposent (g. 1.12). Une chromatographie analytique optimise utilise plein le potentiel du para- mtre le plus efcace : la slectivit. Dans ce triangle elle se situe donc prs du sommet rsolution. rsolution capacit vitesse 1 2 3 Figure 1.12 Le triangle des chromatographistes. La zone ombre indique le domaine qui correspond la chromatographie analytique. Celle-ci tire prot des 5 paramtres : K, N, k, a et R. 1.12 LES DIVERSES TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES Les techniques chromatographiques peuvent tre rparties suivant plusieurs critres : en fonction de la nature des deux phases en prsence, ou du procd utilis, ou du phnomne physico-chimique responsable du coefcient de distribution K vu prcdemment (g. 1.6). Le classement suivi ci-aprs est tabli partir de la nature physique des phases (g. 1.13). 42. 1 Chromatographie, aspects gnraux 25 hydrosoluble ionique CEI CLHP appariement d'ions CLHP phase normale CLHP phase normale CLHP phase normale CLHP phase inverse CLHP phase inverse CLHP phase inverse CLHP phase inverse non ionique polaire M 2000 organosoluble E C H A N T I L L O N CES filtration sur gel CES permation de gel Figure 1.13 Guide de slection se rapportant aux diffrentes techniques chromatographiques utilisant une phase mobile liquide. On choisira en fonction de la sparation effectuer, la technique la mieux adapte. 1.12.1 Chromatographie en phase liquide (CPL) Ici la phase mobile est un liquide. Cest ce type de chromatographie auquel appartient la forme la plus anciennement connue en tant que mthode prparative de sparation. Cette catgorie trs rpandue peut tre subdivise daprs le phnomne mis en jeu : Chromatographie liquide/solide (ou dadsorption). La phase stationnaire est un milieu solide permable sur lequel les molcules adhrent par un double effet de physisorption et de chimisorption. Le paramtre physico-chimique concern est le coefcient dadsorption. Les phases stationnaires ont fait beaucoup de progrs depuis Tswett, qui utilisait le carbonate de calcium ou linuline (un polymre en poudre trs ne du sucre ordinaire). DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 43. 26 Partie 1 Mthodes sparatives Chromatographie ionique. La phase stationnaire solide comporte en surface des sites io- niques et la phase mobile est une solution-tampon aqueuse. La sparation met en jeu des changes entre les ions de lchantillon avec ceux de la phase stationnaire. La sparation repose sur les coefcients de distribution ionique . Chromatographie dexclusion. La phase stationnaire est un matriau comportant des pores dont les dimensions sont choisies en rapport avec la taille des espces sparer. On ralise ainsi une sorte de permation slective lchelle molculaire. Selon la nature, aqueuse ou organique de la phase mobile, cette technique est dsigne par ltration sur gel ou permation de gel. Le coefcient de distribution prend le nom de coefcient de diffusion. Chromatographie liquide/liquide ou de partage (CLL). La phase stationnaire est un li- quide immobilis sur un matriau inerte et poreux qui na quun rle de support. Limpr- gnation, le procd le plus ancien pour immobiliser un liquide, est une voie maintenant abandonne, par suite dun risque important de lessivage de la colonne. Chromatographie liquide/phase greffe. Pour immobiliser la phase stationnaire (il sagit gnralement dun polymre de type liquide), on xe de manire dnitive les espces qui la composent par des liaisons covalentes : cest la technique du greffage. La sparation repose sur le coefcient de partage K du solut entre les deux phases, un phnomne comparable lextraction dune phase aqueuse avec un solvant dans une ampoule dcanter. 1.12.2 Chromatographie en phase gazeuse (CPG) La phase mobile est un gaz inerte et, comme prcdemment, ce type de chromatographie peut tre subdivis selon le phnomne mis en uvre : Chromatographie gaz/liquide (CGL). La phase mobile est un gaz et la phase stationnaire est un liquide immobilis soit par imprgnation, soit par greffage sur un support inerte lequel peut tre tout simplement la paroi de la colonne. dfaut dtre un gaz, lchantillon doit donc tre port ltat de vapeur. Ce sont Martin et Synge qui ont suggr le remplacement de la phase mobile liquide par un gaz an damliorer les sparations. Cest partir de cette poque quon assista au vritable dmarrage de la chromatographie analytique. Ici encore cest le coefcient de partage K qui est concern. Chromatographie gaz/solide (CGS). La phase stationnaire est un solide poreux (carbone graphite ou gel de silice ou alumine) et la phase mobile est un gaz. Ce type de CPG est trs performant pour les analyses de mlanges de gaz ou de composs bas point dbullition. Le paramtre concern est le coefcient dadsorption. 1.12.3 Chromatographie en phase supercritique La phase mobile est un uide ltat supercritique, tel le dioxyde de carbone vers 50 C et 150 bars (15 MPa). La phase stationnaire peut tre un liquide ou un solide. On runit ainsi les avantages propres aux techniques prcdentes (gaz/phase greffe ou liquide/phase greffe). 44. 1 Chromatographie, aspects gnraux 27 ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE Le dveloppement considrable pris par la chromatographie en analyse quantitative est d essentiellement sa abilit et sa prcision. La relation entre la masse injecte de lana- lyte dans la colonne et laire du pic correspondant sur le chromatogramme conduit une mthode comparative, utilise dans beaucoup de protocoles normaliss de dosages. La re- productibilit des sparations allie des logiciels de traitement de donnes permet dauto- matiser les tches de calcul associes ces analyses. Les dosages de traces et dultratraces par chromatographie sont reconnus en particulier dans les mthodes EPA de lenvironne- ment, bien que leur prix de revient soit assez lev. Les trois mthodes les plus utilises sont dcrites ci-aprs dans leur conguration la plus simple. 1.13 PRINCIPE ET RELATION DE BASE Pour calculer la concentration massique dun compos responsable dun pic sur le chroma- togramme il faut runir deux conditions : disposer dun chantillon authentique du compos que lon veut doser, usage de rfrence, pour dterminer la sensibilit du dtecteur son gard, et disposer dun moyen logiciel ou autre pour connatre soit les hauteurs soit les aires des diffrents pics dlution dintrt. Toutes les mthodes de quantication en chromato- graphie sont donc des mthodes comparatives et non pas absolues. Pour un rglage donn de lappareil, on admet quil existe pour chaque pic du chroma- togramme une relation linaire entre son aire (ou sa hauteur) et la quantit du compos responsable de ce pic dans lchantillon inject. Cette relation est valable pour une plage de concentrations qui dpend du dtecteur employ. On traduit cette hypothse par : mi = Ki Ai (1.35) mi masse du compos i injecte dans la colonne Ki coefcient de rponse absolu du compos i Ai aire du pic dlution du compos i Le coefcient absolu Ki ( ne pas confondre avec le coefcient de partition), dpend du rglage du chromatographe. Ce nest pas un paramtre intrinsque du compos. Pour calculer le coefcient Ki dun compos i, il faut, daprs cette relation, connatre laire Ai et la masse mi traversant la colonne. Or cette masse est difcile dterminer avec prcision, car elle dpend la fois de la seringue et de linjecteur (en CPG) ou de la boucle dinjection (en CPL). Cest pourquoi les mthodes utilises en analyse quantitative, prpro- grammes dans les enregistreurs-intgrateurs ou logiciels divers, vitent de faire intervenir les coefcients de rponse absolus Ki . 1.14 AIRES DES PICS ET LOGICIELS DE CHROMATOGRAPHIE Pour dterminer les aires des pics, on utilise les fonctions spcialement prvues des logiciels de chromatographie, qui assurent non seulement le pilotage du chromatographe, mais qui DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 45. 28 Partie 1 Mthodes sparatives peuvent, en plus de lacquisition des chromatogrammes, analyser les donnes, quantier et fournir le rapport danalyse correspondant lune des mthodes danalyse quantitative prprogrammes (g. 1.14). Le signal analogique rcupr au niveau du dtecteur est chantillonn par un circuit ADC, au rythme dune centaine de fois par seconde an de pouvoir reproduire correctement les pics les plus ns des chromatogrammes obtenus notamment en CPG avec les colonnes capillaires. Tous les logiciels permettent deffectuer des corrections de ligne de base, de prendre en compte les pics ngatifs et de choisir une mthode dintgration pour les pics. La mthode manuelle de calcul de la surface dun pic par triangulation nest plus em- ploye. Il est utile cependant de savoir que pour un pic gaussien, le produit de sa largeur mi-hauteur par sa hauteur, correspond environ 94 % de la surface totale du pic. De mme lusage dun enregistreur-intgrateur pour mesurer laire des pics nest plus gure employ. Figure 1.14 Un logiciel danalyse quantitative en chromatographie. Le signal du dtecteur ntant pas numris la sortie du chromatographe, sa conver- sion analogique/numrique est assure lentre du micro-ordinateur. Le chromato- gramme, mmoris sous forme de nombres sert de base lexploitation par le logiciel. Diffrentes fentres de travail afchent aires, droite dtalonnage, type de mthode etc. (Logiciel Chem-station de la socit Agilent Technologies). 1.15 MTHODE DE LTALONNAGE EXTERNE Cette mthode permet de calculer la teneur (en termes de concentration ou de pourcen- tage massique) dun ou plusieurs constituants apparaissant spars sur le chromatogramme, 46. 1 Chromatographie, aspects gnraux 29 mme en prsence dautres composs donnant des pics non rsolus. Facile de mise en uvre, elle correspond lapplication dun principe commun beaucoup de dosages. Le procd repose sur la comparaison de deux chromatogrammes obtenus successive- ment sans changer les conditions de rglage de lappareil (g. 1.15). Le premier est un chromatogramme de rfrence acquis partir dune solution de rfrence (conc. Crf) dans un solvant, du compos qui fait lobjet du dosage. On injecte un volume V de cette solu- tion et on repre sur le chromatogramme laire Arf du pic correspondant. Le second rsulte de linjection dun volume identique V de lchantillon en solution, contenant le compos doser (conc. Cch). Soit Ach laire du pic correspondant. Puisque les volumes injects sont gaux, il y a proportionnalit entre les aires, qui dpendent des masses injectes, et les concentrations correspondantes (mi = Ci V ). La relation 1.35 applique aux deux chroma- togrammes conduit la relation 1.36 caractristique de cette mthode : mrf = Crf V = K Arf et mch = Cch V = K Ach soit : Cch = Crf Ach Arf (1.36) chromatogramme d'talonnage (C )rf. picsolvant picsolvant Ach.Arf. chromatogramme de la solution doser (C )ch. 0 0 Figure 1.15 Mthode de dosage par talonnage externe. La prcision de cette mthode est amliore lorsquon utilise plusieurs solutions an de tracer la droite dtalonnage. Pour lanalyse de traces, il est parfois conseill, en chromatographie liquide, de remplacer les aires des pics par leurs hauteurs qui sont moins sensibles aux variations de dbit de la phase mobile. Ltalonnage est possible, comme ici sur la gure 1.15, avec un seul point de mesure (la droite dtalonnage passe donc par lorigine). La prcision sera meilleure si les concen- trations des solutions de rfrence et de lchantillon sont du mme ordre de grandeur. Il sentend que les rglages de lappareil ne doivent pas tre modis entre les injections. Cette mthode, faisant appel aux coefcients de rponse absolus , donne des rsultats trs ables avec les chromatographes performants actuels qui sont quips dun auto- chantillonneur : ce dernier constitu de la runion dun carrousel porte-chantillons et dun injecteur automatique permet denchaner plusieurs dosages sans intervention hu- maine. Une seule solution de rfrence permet de compenser une ventuelle drive de linstrument par des r-injections programmes de contrle. La prcision du dosage est videmment amliore en calculant la moyenne des aires obtenues partir de plusieurs injections identiques, mais, quitte faire plusieurs mesures, il est alors prfrable de procder un talonnage multipoints (multilevel calibration). Pour DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 47. 30 Partie 1 Mthodes sparatives cela on injecte des volumes gaux dune srie de solutions talons. Les rsultats danalyse sont directement obtenus partir de la courbe dtalonnage A = f (C). Cette mthode, la seule qui soit adapte aux chantillons de gaz, a galement pour avan- tage quon najoute aucun compos la solution chantillon, la diffrence de celle qui fait lobjet du paragraphe suivant. 1.16 MTHODE DE LTALONNAGE INTERNE (TALON INTERNE) Cette deuxime mthode repose sur lutilisation du coefcient de rponse relatif de chaque compos doser vis--vis dun marqueur introduit comme rfrence. Cela permet de saf- franchir de limprcision concernant les volumes injects, un handicap de la prcdente mthode. La mthode ncessite, ici encore, deux chromatogrammes, lun pour calculer les coef- cients de rponse relatifs et lautre pour lanalyse de lchantillon. Les aires des pics des produits quantier sont donc compares avec celle dun compos de rfrence, appel talon interne, introduit une concentration connue dans lchantillon. 1.16.1 Calcul des coefcients de rponse relatifs Supposons que lchantillon contienne deux composs doser 1 et 2, et que le compos E dsigne un compos supplmentaire usage dtalon interne (g. 1.16). picsolvant picsolvant Crf. Cch.Arf. Ach. chromatogramme de la solution doserchromatogramme d'talonnage A1 A'1C1 C'1? AE A'ECE C'E A2 A'2C2 C'2?1 1 E E 2 2 00 Figure 1.16 Mthode danalyse par talonnage interne. Dans une premire tape, on commence par prparer une solution de concentration C1 en 1, C2 en 2 et CE en E. Appelons A1, A2 et AE les aires des pics dlution reprs sur le chromatogramme obtenu partir dune prise dessai de cette solution. Si m1, m2 et mE sont les quantits rellement introduites dans la colonne, on peut crire les trois relations du type 1.35 suivantes : m1 = K1 A1 m2 = K2 A2 mE = KE AE soit : m1 mE = K1 A1 KE AE et m2 mE = K2 A2 KE AE 48. 1 Chromatographie, aspects gnraux 31 Ces rapports permettent de calculer les coefcients de rponse relatifs de 1 et de 2 vis-- vis de E choisi comme talon, et dsigns par K1/E et K2/E : K1/E = K1 K2 = m1 AE mE A1 et K2/E = K2 KE = m2 AE mE A2 Comme les masses mi rellement injectes sont proportionnelles aux concentrations mas- siques correspondantes Ci , (mi = Ci V )., on en dduit les deux expressions suivantes : K1/E = C1 AE CE A1 et K2/E = C2 AE CE A2 1.16.2 Chromatographie de lchantillon Calcul des concentrations La seconde tape de lanalyse consiste chromatographier un volume quelconque dune solution faite avec lchantillon tudier et dans laquelle a t ajoute une quantit connue du compos E. Soient A1, A2 et AE , les aires du nouveau chromatogramme obtenu dans les mmes conditions opratoires. Si m1, m2 et mE dsignent les masses de 1, 2 et E rellement introduites dans la colonne, on aura : m1 mE = K1/E A1 AE et m2 mE = K2/E A2 AE partir des coefcients relatifs calculs dans la premire exprience ainsi que de la concentration de ltalon interne dans lchantillon, CE , connue, on accde : C1 = CE K1/E A1 AE et C2 = CE K2/E A2 AE En gnralisant n constituants, on peut calculer la concentration massique du solut i au moyen de lexpression 1.37 : Ci = CE Ki/E Ai AE (1.37) et en dduire sa teneur dans lchantillon, exprime en %, (expression 1.38) : xi % = Ci Masse dchantillon prleve 100 (1.38) Cette mthode est encore plus prcise si on fait plusieurs injections de ltalon ou de lchantillon doser. En conclusion cette mthode gnrale et reproductible exige nan- moins un bon choix de ltalon interne dont les caractristiques peuvent se rsumer ainsi : il doit tre pur et ne pas se trouver initialement dans lchantillon ; son pic dlution doit tre bien rsolu par rapport tous ceux qui forment le chromato- gramme de lchantillon ; son temps de rtention doit tre proche de celui (ou de ceux) du (ou des) solut(s) doser ; sa concentration doit tre proche ou suprieure celle des autres soluts pour tre dans les conditions dune rponse linaire du dtecteur ; il doit tre inerte vis--vis des composs de lchantillon. DunodLaphotocopienonautoriseestundlit 49. 32 Partie 1 Mthodes sparatives 1.17 MTHODE PAR NORMALISATION INTERNE Cette mthode, galement appele 100 % normalise , est rserve aux mlanges dont on a identi tous les constituants par autant de pics dlution spars sur le chromatogramme, an de pouvoir faire le bilan complet de lchantillon concern. Supposons quil sagisse de trouver les concentrations massiques dun mlange de trois composs 1 ,2, 3 (g. 1.17). On va procder ici encore en deux tapes. chromatogramme d'talonnage chromatogramme de la solution doser 1 1 2 2 3 3 Crf. Cch.Arf. Ach. A1 A'1 C1 C'1? A3 A'3C3 C'3? A2 A'2 C2 C'2? picsolvant picsolvant 0 0 Figure 1.17 Mthode danalyse par normalisation interne. 1.17.1 Calcul des coefcients de rponse relatifs On prpare une solution dtalonnage contenant les trois composs 1, 2, et 3 dont les concentrations massiques sont respectivement C1, C2, C3. Le chromatogramme correspon- dant linjection dun volume V , prsente trois pics daires A1, A2 et A3. Ces aires seront relies aux masses injectes m1, m2 et m3 par trois expressions du type 1.35. On choisit lun des composs comme substance de normalisation interne, le compos 3 par exemple, an de dterminer les coefcients de rponse relatifs K1/3 et K2/3 des com- poss 1 et 2 par rapport 3. On trouve comme prcdemment : K1/3 = K1 K3 = m1 A3 m3 A1 et K2/3 = K2 K3 = m2 A3 m3 A2 tant donn que mi = Ci V , on aboutit, pour K1/3 et K2/3, aux expressions suivantes : K1/3 = C1 A3 C3 A1 et K2/3 = C2 A3 C3 A2 1.17.2 Chromatographie de lchantillon Calcul des concentrations On procde ensuite linjection dun prise dessai du mlange doser contenant les consti- tuants 1, 2 et 3. En dsignant les surfaces des pics dlution par A1, A2 et A3, on aura accs directement la composition centsimale massique du mlange reprsente par x1, x2 et x3 en crivant trois expressions de la forme : xi % = Ki/3 Ai K1/3 A1 + K2/3 A2 + A3 100 (avec i = 1,2, 3) la condition de normalisation tant que x1 + x2 + x3 = 100 50. 1 Chromatographie, aspects gnraux 33 En extrapolant n soluts normaliss par rapport un solut j, lexpression gnrale des facteurs de rponse est la suivante (pour un compos choisi i) : Ki/ j = Ci Aj Cj Ai (1.39) Il est galement possible de dterminer des Ki/ j moyens par trac du graphe concentration- rponse pour chaque solut. Pour lchantillon contenant n soluts, si Ai dsigne laire du pic dlution du compos i, le compos servant de rfrence interne tant j, la teneur en compos i obira la relation : xi % = Ki/ j Ai n i=1 Ki/ j Ai 100 (1.40) EXERCICES Solutions en n douvrage Exercice 1.1 On mlange dans un erlenmeyer 6 mL de gel de silice et 40 mL dun solvant contenant en solution 100 mg dun compos considr comme non volatil. Aprs avoir bien agit ce mlange, on laisse dcanter et on recueille 10 mL du solvant que lon vapore. Le rsidu pse 12 mg. Calculer le coefcient dadsorption K = CS/CM de ce compos dans cette exprience. Exercice 1.2 Calculer le facteur de sparation entre 2 composs 1 et 2 dont les volumes de rtention sont respectivement gaux 6 et 7 mL. Le volume mort de la colonne utilise est de 1 mL. Montrer que ce facteur est gal au rapport des coefcients de distribution K2/K1