007 Caractérisation des cellules Natural Killer humaines après migration transendothéliale

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    01-Jan-2017

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    2007 SPLF. dit par Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs 1191

    006 Dveloppement dune chimiokine dorigine eucaryote PARC : production, purification, validation

    B. Legendre, G. Kervoaze, H. Vorng, A. Tsicopoulos, P. Lassalle

    Introduction : Laugmentation de la prvalence des maladiesallergiques constitue un vritable problme de sant publique.Aujourdhui, 1 franais sur 5 est atteint dallergie, dont la moititouche le systme respiratoire.Parmi les mdiateurs de linflammation, les chimiokines jouent unrle important dans de nombreuses pathologies. Parmi ces chimio-kines, le PARC est secrt en rponse des cytokines Th2 non seu-lement ds lintrusion de lallergne, mais aussi beaucoup plustardivement, ce qui pourrait linclure dans le processus prennisantla rponse allergique.Le PARC a t dcouvert chez lhumain, et ne connat pasaujourdhui dhomologue chez dautre espce, son rcepteur tanttoujours inconnu. En outre, il a t montr que le PARC est prf-rentiellement exprim au niveau pulmonaire, et est largement aug-ment dans les LBA de patients allergiques. Il a t dcrit que lePARC est capable dattirer des cellules T naves, Th2, basophiles.Afin dtudier au plus prs les comportements de la chimiokinenaturelle, nous avons dvelopp une chimiokine produite dans unsystme eucaryote, permettant la comparaison des fonctions biolo-giques de notre protine avec celle commerciale (procaryote).Mthodes : Le PARC est produit par une ligne transfecte deCHO-DG44. La protine pure est obtenue par une purificationsquentielle sur HiTrap SP, suivi dune Gel Filtration sur unecolonne de Sphacryl S-100. Le dosage du PARC est ralis parELISA sandwich (R&D). La puret est vrifie par SDS-PAGE18%, suivi dune rvlation au nitrate dargent. Les celluleT CD4+CD45+ (naves) sont obtenues par purification de PBMCsur colonne MACS. Les tests de chimiotaxie sont mens en cham-bre de Boyden.Rsultats/Conclusion : Nous avons obtenu une chimiokinedorigine eucaryote pure (pas de bande parasite avec le SDS-PAGE). Les premiers rsultats des tests de fonctionnalit compara-tifs tendent montrer que notre chimiokine dorigine eucaryotepossde une activit biologique in vitro similaire celle dorigineprocaryote. Toutefois, nous notons une tendance dans la concen-tration defficacit maximale qui serait 10 fois infrieure celledorigine procaryote. En effet, nous observons un maximum demigration 10-8 mol.L-1, pour la chimiokine procaryote, contre10-9 pour notre PARC sur les T nafs. Toutefois, il est encorencessaire deffectuer dautres tests de fonctionnalit afin de confir-mer ces rsultats, et de pouvoir comparer ces comportementsin vitro ceux dcrits dans la littrature.

    007 Caractrisation des cellules Natural Killer humaines aprs migration transendothliale

    M. Barrier, L. Amniai, C. Ple, P. Marquillies, P. Lassalle, C. Duez

    Introduction : Dcrites lorigine comme des cellules impliquesdans la rponse immunitaire inne anti-tumorale et anti-bact-rienne, les cellules Natural Killer (NK) sont galement capables derguler limmunit acquise, notamment en produisant des cytoki-nes. Le rle des cellules NK dans lasthme allergique demeuremconnu. Cependant, chez les patients asthmatiques allergiques, lenombre de cellules NK2 circulantes produisant de lIL-4 est aug-ment en comparaison des individus non allergiques. Les cellulesNK sont capables de migrer du sang vers les sites inflammatoires(poumons) ou les organes lymphodes secondaires.Notre objectif tait dvaluer : (1) la capacit des cellules NK, puri-fies de donneurs allergiques ou non allergiques, migrer au traversde lendothlium vasculaire ; et (2) de comparer les changementsphnotypiques induits par la migration.Mthodes : Un modle de migration transendothliale de cellulesNK a t mis au point (conditions de culture, dactivation, concen-trations de chmoattractant, etc.). Les cellules endothliales ont tpurifies partir de veine de cordon ombilical (HUVEC) et culti-ves en monocouche sur Transwell. Les cellules NK ont t puri-fies du sang de patients allergiques ou non allergiques laide debilles magntiques. Le phnotype des cellules NK aprs migration at analys par cytomtrie en flux.Rsultats : Dans un premier temps, nous avons montr que leffi-cacit de migration trans-endothliale des cellules NK, purifies desujets non allergiques, est maximale quand les cellules endothlialessont practives avec du TNF- et que la chimiokine SDF-1 estutilise. De plus, la migration transendothliale des cellules NK estLFA-1 dpendante. Lanalyse phnotypique des cellules NK montreune augmentation de lexpression du CD69 ainsi que du CD86,suggrant une activation des NK, tandis que lexpression duCD107a membranaire, du CD16 et du CD54 demeure inchange.Des analyses similaires sur des cellules purifies de patients allergi-ques sont actuellement en cours.Conclusion : Ce travail permettra de comparer la capacit demigration et lactivation des cellules NK de donneurs allergiques ounon allergiques au travers dun endothlium activ.

    INSERM U774, Institut Pasteur, Lille, France.

    Legendreben@hotmail.fr

    Inserm U774, Biomolcules et Inflammation Pulmonaire, IFR 142, Institut Pasteur de Lille, France.

    mathieu.barrier@pasteur-lille.fr

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