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1 ère S, SVT, 05-06 1/2 TP 11 TP 11 L’amylase pancréatique : un catalyseur biologique 1. situation dans le cours et but du TP Le début du cours « du génotype au phénotype » a permis de constater qu’un phénotype était observable à plusieurs échelles. Tous ces phénotypes dépendent du phénotype moléculaire, lui-même correspondant à la présence d’une protéine particulière. Le TP a pour but d’étudier, au cours du temps, la teneur en amidon d’une solution d’empois d’amidon (5 g / L) dans diverses conditions expérimentales : - en présence d’amylase native (4 g / L) à 35°C ou à 4°C - en présence d’amylase bouillie puis refroidie - en présence d’acide chlorhydrique (1 N) [expérience menée par le professeur] - en absence de tout catalyseur 2. rappels et notions indispensables à la compréhension du TP L’amylase pancréatique est une protéine, fabriquée par le pancréas des Mammifères, et qui intervient dans la digestion des aliments dans l’intestin grêle. Ses propriétés (voir résultat du TP) en font un catalyseur biologique, c'est-à-dire une enzyme. L’amidon est un glucide complexe, présent chez les végétaux et les champignons, où il sert de molécule de réserve. Il s’agit d’un polymère de glucose, c'est-à-dire d’une très longue répétition de molécules de glucose : ou l’amidon : un polymère de glucose le glucose, un sucre à 6 carbones : C 6 H 12 O 6 un dimère de glucose : le maltose C 12 H 22 O 11 L’hydrolyse de l’amidon est la réaction permettant de dépolymériser l’amidon, c'est-à-dire de le « casser » en molécules de maltose : (C 6 H 10 0 5 ) n + H 2 0 (C 6 H 10 0 5 ) n-2 + C 12 H 22 O 11 pour le retrait d’un seul maltose de l’amidon (C 6 H 10 0 5 ) n + H 2 0 (C 6 H 10 0 5 ) p + (C 6 H 10 0 5 ) q pour une coupure n’importe où dans l’amidon (p+q=n) (C 6 H 10 0 5 ) n + nH 2 0 n C 6 H 12 O 6 pour l’hydrolyse complète de l’amidon en glucose (C 6 H 10 0 5 ) n + n/2 H 2 0 n/2 C 12 H 22 O 11 pour l’hydrolyse complète de l’amidon en maltose ces formules sont simplifiées, donc imparfaitement équilibrées ! Les glucides peuvent être mis en évidence par des tests au lugol (eau iodée) ou à la liqueur de Fehling : LUGOL : on ajoute une goutte de lugol au matériel à tester. Une coloration bleue est caractéristique de la présence d’amidon ; une coloration rouge caractérise des polymères de glucose de plus faible poids moléculaire : les dextrines ; le lugol ne change pas de couleur lorsqu’il est en présence de dimères de glucose, ou de glucose. TEST A LA LIQUEUR DE FEHLING : après neutralisation à la soude, on ajoute quelques gouttes de liqueur de Fehling, puis on chauffe (voir protocole plus loin). L’apparition d’un précipité rouge brique indique la présence de sucres aux propriétés réductrices : il s’agit du maltose (dimère de glucose) ou de glucose. Les polymères de taille plus importante ne sont pas réducteurs. 3. matériel disponible Bain thermostaté Feutre, plaque de faïence, pince en bois, chiffon 12 tubes à essais, verre à pied Pissette d’eau distillée 11 pipettes de 2 mL, 3 pipettes de 10 mL, et propipettes Une pipette en verre (pour la soude NaOH) et une poire 100 mL d’empois d’amidon (5 g / L)

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1ère S, SVT, 05-06 1/2

TP 11

TTPP 1111 LL’’aammyyllaassee ppaannccrrééaattiiqquuee :: uunn ccaattaallyysseeuurr bbiioollooggiiqquuee

1. situation dans le cours et but du TP

Le début du cours « du génotype au phénotype » a permis de constater qu’un phénotype était observable à plusieurs échelles. Tous ces phénotypes dépendent du phénotype moléculaire, lui-même correspondant à la présence d’une protéine particulière. Le TP a pour but d’étudier, au cours du temps, la teneur en amidon d’une solution d’empois d’amidon (5 g / L) dans diverses conditions expérimentales :

- en présence d’amylase native (4 g / L) à 35°C ou à 4°C - en présence d’amylase bouillie puis refroidie - en présence d’acide chlorhydrique (1 N) [expérience menée par le professeur] - en absence de tout catalyseur

2. rappels et notions indispensables à la compréhension du TP

L’amylase pancréatique est une protéine, fabriquée par le pancréas des Mammifères, et qui intervient dans la digestion des aliments dans l’intestin grêle. Ses propriétés (voir résultat du TP) en font un catalyseur biologique, c'est-à-dire une enzyme. L’amidon est un glucide complexe, présent chez les végétaux et les champignons, où il sert de molécule de réserve. Il s’agit d’un polymère de glucose, c'est-à-dire d’une très longue répétition de molécules de glucose :

ou l’amidon : un polymère de glucose

le glucose, un sucre à 6 carbones : C6H12O6

un dimère de glucose : le maltose C12H22O11

L’hydrolyse de l’amidon est la réaction permettant de dépolymériser l’amidon, c'est-à-dire de le « casser » en molécules de maltose :

(C6H1005)n + H20 (C6H1005)n-2 + C12H22O11 pour le retrait d’un seul maltose de l’amidon (C6H1005)n + H20 (C6H1005)p + (C6H1005)q pour une coupure n’importe où dans l’amidon (p+q=n) (C6H1005)n + nH20 n C6H12O6 pour l’hydrolyse complète de l’amidon en glucose (C6H1005)n + n/2 H20 n/2 C12H22O11 pour l’hydrolyse complète de l’amidon en maltose

ces formules sont simplifiées, donc imparfaitement équilibrées ! Les glucides peuvent être mis en évidence par des tests au lugol (eau iodée) ou à la liqueur de Fehling : LUGOL : on ajoute une goutte de lugol au matériel à tester. Une coloration bleue est caractéristique de la présence d’amidon ; une coloration rouge caractérise des polymères de glucose de plus faible poids moléculaire : les dextrines ; le lugol ne change pas de couleur lorsqu’il est en présence de dimères de glucose, ou de glucose. TEST A LA LIQUEUR DE FEHLING : après neutralisation à la soude, on ajoute quelques gouttes de liqueur de Fehling, puis on chauffe (voir protocole plus loin). L’apparition d’un précipité rouge brique indique la présence de sucres aux propriétés réductrices : il s’agit du maltose (dimère de glucose) ou de glucose. Les polymères de taille plus importante ne sont pas réducteurs.

3. matériel disponible Bain thermostaté Feutre, plaque de faïence, pince en bois, chiffon 12 tubes à essais, verre à pied Pissette d’eau distillée 11 pipettes de 2 mL, 3 pipettes de 10 mL, et propipettes Une pipette en verre (pour la soude NaOH) et une poire 100 mL d’empois d’amidon (5 g / L)

1ère S, SVT, 05-06 2/2 4. préparation du matériel

Allumer et régler le bain thermostaté sur 35°C Placer quelques glaçons et de l’eau dans le verre à pied Emplir un tube à essai, noté A (amylase), avec environ 15 mL d’amylase (4 g / L) (au bureau) Numéroter 8 tubes de la manière suivante : 1, 2, 3, 4, 5, TE (témoin eau), TB (témoin bouilli) et G (glace)

o Dans chaque tube, placer 10 mL d’empois d’amidon o Placer les tubes 1 à 5, TE et TB dans le bain thermostaté o Placer le tube G dans l’eau + glace

Prélever dans un tube à essai, noté AB (amylase bouillie), quelques mL de la solution d’amylase portée à 100°C (bureau), et faire refroidir

Préparer les plaques de faïence : o Numéroter 8 puits dans l’ordre suivant : TE, TB, 1, 2, G, 3, 4, 5 o Dans un tube à essai, préparer environ 5 mL de lugol dilué 5 fois à l’eau distillée. Placer une goutte de

lugol dilué dans chaque puits

5. déroulement de l’expérience élève à To = 0 min, ajouter : 2 mL d’amylase dans le tube 1. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube 2 mL d’eau dans le tube TE. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube 2 mL d’amylase bouillie refroidie dans le tube TB. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube à T = 5 min, ajouter : 2 mL d’amylase dans le tube 2. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube. 2 mL d’amylase dans le tube G. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube. à T = 10 min, ajouter : 2 mL d’amylase dans le tube 3. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube. à T = 15 min, ajouter : 2 mL d’amylase dans le tube 4. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube. à T = 20 min, ajouter : 2 mL d’amylase dans le tube 5. Homogénéiser. Laisser la pipette dans le tube. à T = 25 min : - prélever une goutte de chaque tube (utiliser la pipette propre à chaque tube) - placer cette goutte dans le puits de la plaque de faïence correspondant Attention à ne pas vous embrouiller dans les pipettes, les tubes et les noms des puits !!!

Noter les nuances de coloration entre tous les puits. à T = 40 min (environ), réaliser un test à la liqueur de Fehling sur les tubes 1 et TE : - vider de moitié le contenu des tubes 1 et TE - ajouter 2 à 3 mL (environ) de NaOH (à la pipette en verre !). Homogénéiser. Ajouter quelques gouttes de liqueur de Fehling - placer deux minutes dans le bain thermostaté à 90°C (bureau) Si il vous reste du temps pour prolonger la manipulation : à T = 45 min (environ), ajouter de nouveau de l’empois d’amidon dans le tube 2 (vider un peu du contenu du tube si nécessaire) et suivre à nouveau l’évolution de coloration par le test au lugol (dans de nouveaux puits de la plaque de faïence) en réalisant un prélèvement toutes les 5 minutes.

6. expérience réalisée au bureau Deux tubes à essai, contenant 10 mL d’empois d’amidon, sont placés à 90°C. Deux autres sont placés à température ambiante. à To, 5 mL d’eau ou 5 mL d’HCl (1 N) sont ajoutés dans les tubes. Le test au lugol est effectué toutes les 15 minutes.

7. Bilan et compte-rendu

Quels sont les arguments expérimentaux qui vous permettent de démontrer que l’agent testé (l’amylase) est un catalyseur biologique de l’hydrolyse de l’amidon ?

Rédiger un compte-rendu, intégrant :

- Une introduction, rappelant en particulier le problème à résoudre - Les différentes conditions expérimentales réalisées (sous forme d’un tableau récapitulatif) - Les résultats obtenus (sous forme d’un tableau, avec en particulier : temps, test lugol, test liqueur de Fehling). Ne

pas oublier d’intégrer les résultats de l’expérience faite au bureau ! - L’interprétation des résultats obtenus - Une conclusion, réalisant une synthèse de ces interprétations, et la réponse à la question posée

Avant de partir : nettoyer la plaque de faïence, ramener les tubes et pipettes sales dans le seau prévu à cet effet, vider les Becher et verre à pied. Vérifier que vous laisser une paillasse propre pour le groupe suivant ou la classe suivante !

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