Analyse Bacteriologique Des Aliments en Milieu Rural Au Laos

8/12/2019 Analyse Bacteriologique Des Aliments en Milieu Rural Au Laos

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Universit de Lige

Facult de Mdecine

Analyse bactriologique des aliments en

milieu rural au Laos

Mlanie Csar

Dpartement des sciences biomdicales et prcliniquesUnit de Microbiologie mdicale

Professeur P. De Mol

Mmoire prsent en vue de lobtention du grade de licenci en Sciences Biomdicales,ralis en collaboration avec la facult de Mdecine de lUniversit Nationale du Laos

(UNL)

Anne acadmique 2005-2006


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Remerciements

Ce mmoire naurait pas pu tre ralis sans la contribution de nombreuses

personnes et organisations que je tiens remercier par ces quelques lignes.

Tout dabord mon promoteur, Monsieur Patrick De Mol, pour lopportunit

quil ma offerte de partir dans un pays magnifique et daccomplir un merveilleux

projet. Je le remercie galement pour sa patience, ses conseils et son soutien dans

les difficults que jai pu rencontrer en ralisant ce travail.

Je tiens remercier la facult de mdecine de luniversit nationale du Laos

(UNL) pour laccueil et pour les locaux quelle nous a prts ainsi que toutes les

personnes qui nous ont aides sur place.

Je remercie particulirement Madame Pethsamone Mathouchanh qui nous areues et aides lors de notre travail sur le terrain.

Je remercie Monsieur Khamphanh Prabouasane pour ses conseils et son aide

sur le terrain.

Monsieur Kampheui Phommachan, gestionnaire du projet, pour son accueil et

son aide lors de la rsolution de problmes administratifs.

Jadresse mes sincres remerciements Vinciane DAlpaos avec qui jai partag

deux mois magnifiques.

Un tout grand merci Madame Franoise Daoud pour le temps prcieux quelle

ma accord, pour son aide et nos agrables conversations.

Jadresse ma profonde reconnaissance toutes les personnes travaillant dans

le laboratoire de bactriologie du CHU de Lige qui mont donn des conseils et

mont aid rsoudre certains problmes.

Le voyage ralis dans le cadre du prsent travail a t rendu possible grce

lintervention financire du Conseil interuniversitaire de la Communaut franaise

de Belgique - Commission universitaire pour le Dveloppement et le Centre de

Coopration au Dveloppement (CECODEL).

Jaimerais galement remercier Monsieur Georges Daube et Madame Sophie

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Van Belle pour leur patience et leurs explications.

Ce mmoire naurait pas t possible sans le soutien quotidien et les encoura-

gements de ma famille et de mes proches.

Jassocie ces remerciements mon papa, Patrick et Bernadette pour leur re-

lecture attentive.

Enfin, je naurais jamais pu arriver au bout de ce mmoire sans Nico qui a su

me supporter durant ce travail. Je le remercie pour ses relectures, ses conseils, son

aide, sa patience et tous les bons moments passs ensemble durant cette priode.

Je ddie ce travail ma maman qui, je pense, aurait apprci de le lire.

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Rsum

Les maladies diarrhiques occasionnent de nombreuses victimes travers le monde

en particulier dans les pays en voie de dveloppement comme le Laos. Afin de trouver

des solutions pour diminuer lincidence de ces maladies, il convient dabord de dfinir les

caractristiques locales de la maladie. Une des causes possibles rside dans lalimenta-

tion et le manque dhygine lors de la prparation de la nourriture et ce particulirement

dans les milieux ruraux. Cest dans ce contexte que sinscrit ce travail qui a pour but

danalyser la qualit bactriologique des aliments les plus courants (padek) dans le mi-

lieu rural au Laos. Aprs une premire phase de rcolte des chantillons dans les villages

du district de Pakkading, nous avons procd lensemencement de ces chantillons par

culture sur boites de Ptri et en bouillons. Ceci nous a permis de dnombrer les co-

liformes, les coliformes fcaux et les entrobactries totales ainsi que de rechercher la

prsence ventuelle de germes pathognes tels que Salmonella, Shigella et Escherichia

Coli. Par la suite, notre retour en Belgique, nous avons identifi chaque souche bact-

rienne isole prcisment par galerie Api 20E et nous avons procd un antibiogramme.

Le dnombrement des coliformes, des coliformes fcaux et des entrobactries a rvl un

nombre trop important de ceux-ci dans les chantillons par rapport aux normes alimen-

taires tablies par le CNERNA mettant ainsi en vidence la mauvaise qualit du padek.

Les souches bactriennes identifies sont assez diversifies mais na permis de mettre en

vidence aucune Salmonellaet Shigella. Lanalyse de la sensibilit aux antibiotiques na

montr aucune rsistance particulire, les souches prsentant seulement des rsistances

naturelles certains antibiotiques. Nous avons dmontr quaucune corrlation ntait

tablie entre le dnombrement des coliformes, coliformes fcaux et entrobactries et

certains paramtres tels que la dure de conservation du padek et le niveau de vie des

foyers, de mme entre les souches prsentes et ces mmes paramtres. Cependant, les

conditions de travail ayant empch le traitement dun nombre lev dchantillons, une

analyse recherche plus longue permettrait dobtenir plus des rsultats et augmenterait

la fiabilit de ceux-ci.

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Table des matires

But et plan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

I INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1 Le Laos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Mode de vie alimentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2.1 Consommation des aliments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 Rcolte et analyse des chantillons, travail au laboratoire . . . . . . . . . 5

1.3.1 Prlvement des chantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3.2 Description du padek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.3.3 Description du laboratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.4 La qualit de lalimentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.4.1 Technique danalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.4.2 Entrobactries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.4.3 Coliformes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4.4 Coliformes fcaux ou thermotolrants . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4.5 Salmonella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4.6 Shigella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.5 Normes et critres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.6 Les antibiotiques et les rsistances aux antibiotiques . . . . . . . . . . . 15

1.6.1 Dfinition et origine des antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.6.2 Mcanismes daction des antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . 15

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1.6.3 Classes des antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.6.4 Rsistances aux antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.6.5 Antibiotiques utiliss dans cette tude . . . . . . . . . . . . . . . 18

II MATRIELS ET MTHODES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1 LAOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1.1 Prlvement des chantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1.2 Prparation des chantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.1.3 Dilutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.1.4 Numration des entrobactries totales . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.1.5 Colimtrie et recherche dEscherichia Coli . . . . . . . . . . . . . 22

2.1.6 Recherche des germes pathognes (Salmonella et Shigella) . . . . 24

2.1.7 TESTS DE CONFIRMATION DIDENTIFICATION . . . . . . . 25

2.2 Belgique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.2.1 Analyse des chantillons ramens du Laos par nos soins . . . . . . 27

2.2.2 Analyse des chantillons ramens du Laos un mois aprs le retour 30

III RSULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.1 Analyse des chantillons de catgorie I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.1.1 Quantification des coliformes totaux, des coliformes fcaux et des

entrobactries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.1.2 Identification des souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2 Analyse des chantillons de Catgorie II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3 Corrlations selon les diffrents paramtres . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

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3.3.1 Prsentation des villages et des diffrents paramtres. . . . . . . . 36

3.3.2 Corrlation entre le dnombrement en coliformes, coliformes f-

caux, entrobactries et certains paramtres . . . . . . . . . . . . 37

3.3.3 Types de bactrie en fonction des diffrents paramtres. . . . . . . 40

3.4 Recherche des rsistances des diffrentes souches identifies . . . . . . . . 42

IV DISCUSSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

V PERSPECTIVES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Bibliographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Liste des abrviations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

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But et plan

Durant la dernire dcennie, le taux de mortalit d aux maladies diarrhiques

dans le monde na eu de cesse de diminuer. Cette diminution est le fruit de nom-

breuses campagnes de sensibilisation qui encouragent de meilleures conditions sa-

nitaires et hyginiques, principalement dans le milieu rural. Malheureusement, lecombat est encore loin dtre gagn et ces maladies occasionnent encore de nom-

breuses victimes travers le monde et ce majoritairement dans les pays en voie de

dveloppement. Le Laos entre dans cette catgorie. Ce pays trs pauvre est par-

ticulirement touch par ces maladies. Celles-ci sont dautant plus mal connues

dans ce pays puisquelles nont pas fait lobjet de nombreuses tudes scientifiques

et leurs causes sont donc mal dfinies (Yamashiro et al., 1998). Une des causes

possibles rside bien sur dans lalimentation et le manque dhygine lors de la

prparation de la nourriture et ce particulirement dans les milieux ruraux. Cest

dans ce contexte que sinscrit ce mmoire qui a pour but danalyser la qualit

bactriologique des aliments les plus courants dans le milieu rural au Laos. Plus

spcifiquement, nous avons cibl notre tude en vue dobtenir des renseignements

utiles sur la contamination des aliments, tant dun point de vue qualitatif que

quantitatif, ainsi que sur la source de ces contaminations, animale ou humaine.

Aprs une premire phase de rcolte et danalyses des chantillons ralise sur

place, nous avons galement procd des analyses complmentaires en Belgique,

en particulier, lidentification prcise des souches bactriennes rcoltes et ltude

des rsistances des souches identifies diffrents antibiotiques.

Ce mmoire est structur comme suit :

Auchapitre I, nous introduisons ce mmoire par une description du Laos,

des conditions de travail sur place, de la qualit de lalimentation et des

antibiotiques.

Auchapitre II, nous dcrivons notre mode opratoire.

Auchapitre III, nous fournissons nos rsultats.

Auchapitre IV et V, nous discutons nos rsultats et envisageons les pers-

pectives.

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Chapitre I

INTRODUCTION

Dans ce chapitre nous fournissons une brve prsentation du Laos ainsi que

du mode de vie alimentaire de ce pays. Nous explicitons ensuite la manire dont

nous avons rcolt nos chantillons et nos conditions de travail. Finalement, nous

abordons les bactries les plus couramment rencontres dans lalimentation, les

normes alimentaires et les antibiotiques que nous allons tester.

Cette tude est ralise en parallle avec celle de Vinciane DAlpaos qui analyse

la qualit bactriologique de leau de consommation en milieu rural au Laos.

1.1 Le Laos

Le Laos ou lantique pays du " Million dlphants et du parasol blanc " est

un pays enclav, sans accs la mer, bord sur toute sa partie occidentale par

le Mkong, frontire naturelle avec la Thalande, montagneux au nord et lest.

Il possde des frontires terrestres avec la Chine, le Myanmar, la Thalande, le

Vietnam et le Cambodge (figure 1). Ce pays, pour une superficie quivalente

celle de la Grande Bretagne, ne possde quune population de 6 millions dhabi-

tants. Cest le pays le moins densment peupl de toute lAsie du sud-est. Le Laos

est un pays qui a subi de nombreuses occupations et qui na donc gure connu

de rpit jusqu la fin de la guerre du Vietnam, qui se droula en grande partie

sur son sol, lui valant le cruel privilge davoir t ce jour le pays le plus bom-

bard dans lhistoire de lhumanit. Incorpor lIndochine franaise pendant la

priode coloniale, le Laos y faisait figure de parent pauvre. Faute de perspectives

conomiques prometteuses, il passait en dernier dans les budgets, au point dtre

lune des rares colonies franaises navoir pas hrit dun chemin de fer ni dun

rseau routier digne de ce nom. Le pays hrita cependant, bien malgr lui, de la

guerre dIndochine, puis aprs son indpendance en 1954, de celle du Vietnam. Il

se retrouve aujourdhui avec - rsidus des bombardements - des milliers dengins de

guerre non exploss qui rgulirement, dans les campagnes, continuent de tuer ou

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Fig. 1: Carte du Laos

de handicaper enfants et adultes. En 1975, comme au Vietnam et au Cambodge, la

guerre sarrte, consacrant la victoire communiste, et le royaume du Laos se mue

en rpublique dmocratique populaire Lao. Aprs une longue priode disolement

sur le plan international et de quasi-autarcie conomique, le pays sest progressi-

vement ouvert, et il est dsormais partie prenante de la construction rgionale de

lAsean (Association des Nations de LAsie du Sud-Est). La population est trs

jeune et trs majoritairement rurale (80 % en 2000 selon les statistiques de luni-

versit de Sherbrooke : World Perspectives). Prs de la moiti vit dans les plaines

du Mkong o sont situes toutes les grandes villes (Luang Prabang, Vientiane,

Savannakhet, Paks). Lautre moiti, principalement diverses minorits ethniques,

est rpartie dans les rgions montagneuses du Nord et de lEst. Il y a plus de 70

ethnies au Laos et on distingue 3 grands groupes : Lao Loum, Lao Theung et Lao

Soung (suivants des diffrences linguistiques, conomiques et socio-culturelles).

Si lon suit les indicateurs internationaux, conomiques et sociaux, le pays

figure parmi les moins dvelopps du monde (le PIB en 2002 tait de 1,72 milliards

de dollars, soit 330 dollars par habitant, ce qui place le pays au 132e rang sur les

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162 nations du monde1). Il est en effet trs peu dvelopp conomiquement ainsi

quen matire dducation ou de sant (lesprance de vie est de 53 ans contre 79

en Belgique). Ainsi, le secteur de la sant nest financ qu raison de 2,9 % du

PIB du pays (secteur priv et publique). Il y a plus ou moins 0,25 mdecins pour

1000 habitants (1996), ce qui est trs peu quand on compare avec la Belgique :

5 pour 1000 habitants (2000) (Universit Sherbrooke, World Perspectives 2003).

Les maladies diarrhiques font partie des principales maladies mortelles dans ce

pays, essentiellement chez les jeunes enfants, comme cest le cas dans la plupart

des autres pays en voie de dveloppement dans les zones tropicales (Yamashiro et

al., 1998).

Le Laos, mlange de sourire, dauthenticit et de naturel, est aussi un pays

rempli dune culture et de paysages encore largement intacts qui attirent de plus

en plus de touristes depuis son ouverture conomique il y a 10 ans. Ce pays est

caractris par une grande diversit gographique, culturelle et linguistique dont

les riches traditions ont survcu. Malgr son dnuement, qui touche spcialement

les minorits ethniques, mais pas elles seules, le Laos est un pays de diversit,

de grce, de dignit. Les Lao assumant leurs difficults, ont dvelopps un art

de vivre, une joie quotidienne, des crmonies, des traditions, une spiritualit qui

retiennent ceux qui savent les comprendre.

1.2 Mode de vie alimentaire

La population lao se nourrit essentiellement de riz (80 % de la consommation

journalire). Le reste de lalimentation est principalement compose de poisson,

des fruits de fort, des petits animaux, champignons, et lgumes. Les villageois

se nourrissent principalement de leur propre production agricole, de la pche,

de la chasse et de la cueillette. Etant donn la quasi absence dlectricit et la

pauvret des habitants, la conservation de ces denres repose sur des mthodes

ancestrales de conservation telles que le fumage, le schage au soleil de la viande et

du poisson et lutilisation de saumure. Les aliments en saumure sont conservs dans

des grandes jarres simplement fermes par un tissu. Leur dure de stockage dans ces

1En comparaison : la Belgique a un PIB denviron 300 milliards de dollars (Universit deSherbrooke, World Perspectives, 2003).

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conditions peut tre trs importantes (1 2 ans) et il est donc intressant dtudier

lefficacit de cette conservation et la qualit des aliments dans ces conditions

(nombre de bactries prsentes dans ces aliments).

1.2.1 Consommation des aliments

Les lao manipulent beaucoup la nourriture avec leurs mains. Tout dabord

travers la prparation de celle-ci (dcoupage, assaisonnement) mais galement

pour sa consommation puisque lusage de couverts est peu rpandu dans les cam-

pagnes. Ce contact est un puissant vecteur de contamination des aliments, dautant

plus important que la majorit de la population ne se lave pas correctement les

mains avant de manipuler de la nourriture. En effet, une enqute ralise dans le

cadre du centre de dveloppement rural dans le district de Pakkading auprs de

481 personnes vivant dans 6 villages cibles de ce district a rvl que seulement

26 % des 481 personnes interroges se lavaient les mains avec du savon avant de

manger. Cette tude met galement en vidence de nombreux facteurs favorisant

la contamination des aliments tels quune mauvaise cuisson de ceux-ci, des mau-

vaises habitudes dhygine alimentaire, ou encore une mauvaise conservation des

aliments. Grce cette tude, on peut voir que beaucoup de facteurs entrent en

jeu dans lincidence de la diarrhe. Il est donc intressant de se pencher sur la pr-

valence de lapparition de certaines bactries dans les aliments les plus courants

et de faire des relations avec les conditions de vie et les pratiques de conservation,

de prparation et de consommation de la nourriture.

1.3 Rcolte et analyse des chantillons, travail

au laboratoire

1.3.1 Prlvement des chantillons

Un centre multidisciplinaire de dveloppement rural, chapeaut par la CIUF

(Conseil Interuniversitaire de la Communaut franaise de Belgique, a t mis en

place dans le district de Pakkading (figure 2) et cest dans ce cadre que nous

avons pu effectuer nos recherches et prlvements. Ce district se situe se situe

le long du Mkong 180 Km lest de la capitale (Vientiane) dans la province

de Bolikhamsai (Bolikhan) et est compos de 12 villages. Nous avons prlev nos

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Fig. 3: Figure de gauche : Femmes prparant le padek (Le padek est conserv dans une grandejarre recouverte par un tissu). Figure de droite : Padek dans un rcipient de plastique

1.3.3 Description du laboratoire

Pour raliser nos analyses, nous avons bnfici dun laboratoire danalyse mi-

crobiologique, prt par la facult de mdecine de luniversit de Vientiane, capitale

du Laos. Notre premire tche en arrivant au Laos, fut damener celui-ci un tat

acceptable pour la ralisation de nos analyses. En effet, quoique dot dimportants

matriels tels que une hotte PSM II, un autoclave, un four, un incubateur, des

microscopes, un bain marie, un vortexer,... - dons de la CIUF en Belgique -, le

laboratoire manquait cruellement de moyens de base tels que leau courante, une

systme lectrique fonctionnel, un frigo, un broyeur (automatique), des milieux de

culture ou de simples erlenmeyers.

Nous avons du ainsi consacrer une vingtaine de jours de nos 2 mois de voyage

lachat de matriel (verrerie, boites de ptri, milieux de culture, mixeur, un

frigo,...) et lamnagement du laboratoire (mise en place dune pompe eau, par

exemple).

1.4 La qualit de lalimentation

La prolifration non contrle de micro-organismes dans un aliment peut poser

des problmes au niveau sanitaire. Des bactries pathognes peuvent tre prsentes

et ventuellement se dvelopper. Des micro-organismes banaux sont susceptibles

de provoquer galement des troubles en fonction des circonstances. Les risques en-

courus varient en fonction de nombreux paramtres : nature du micro-organisme,

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niveau de contamination (dose infectante), nature de laliment, tat physiologique

du consommateur... Dans le cas des germes pathognes, pour quun aliment soit

dangereux, il faut soit quil contienne au dpart le micro-organisme, soit quil soit

contamin par lui. La contamination se fait par lenvironnement, le consommateur

ou parfois un vecteur (insecte). Les maladies microbiennes dorigine alimentaire

sont frquentes, surtout lors dun manque dhygine et sont favorises par la col-

lectivit des repas, la mauvaise cuisson de la nourriture, la prparation lavance

des repas, ou encore la mauvaise conservation de ceux-ci (Guiraud, 2003) .

Toutes sortes de micro-organismes peuvent contaminer les produits dalimen-

tation : bactries, levures et moisissures, protistes, parasites et virus. Nous allons

nous concentrer sur la microbiologie (bactriologie) des poissons et produits aqua-

tiques, puisque nos chantillons de padek font partie de cette catgorie.

Leau des rivires contient une flore importante susceptible de contaminer les

produits de la pche. Ces eaux peuvent tre extrmement pollues par les rejets

humains et animaux et contenir donc des germes pathognes (Salmonella, Shi-

gella, Vibrio, Clostridium perfringens, Proteus, Coliformes, etc). Normalement la

chair des poissons est strile, les rgions contamines sont les branchies, le mu-

cus qui recouvre la peau et le tube digestif. La flore de surface des poissons est

constitue des bactries appartenant aux genresPseudomonas, Aeromonas, Serra-

tia, Proteus, Vibrio, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, etc. Cette flore est trs

variable au point de vue quantitatif. La flore intestinale est constitue de bactries

appartenant aux genres Achromobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Escheri-

chia, Clostridium, Vibrio, etc (Guiraud, 2003). Tous ces micro-organismes peuvent

dgrader les produits et peuvent se multiplier et rendre le poisson impropre la

consommation. Les dgradations microbiennes proviennent de la flore de surface

et de la flore intestinale. Il est donc par exemple prfrable dviscrer rapidement

le poisson pour viter toute multiplication des germes de la flore intestinale. Le

padek est constitu de poissons entiers parfois non viscrs et constitue ainsi un

danger de contamination. Le padek est un produit en saumure, ferment. Les al-

trations microbiennes et le risque sanitaire li la consommation de ce produit

dpend de plusieurs facteurs : pH (< 4, 5 limite le danger), taux de salinit, qua-

lit des aliments de base de la prparation et cuisson (qui dtruit la plupart des

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germes pathognes mais slectionne des thermorsistants).

1.4.1 Technique danalyse

Pour les produits en saumure comme le padek, on effectue lanalyse sur un

broyat, un prlvement de surface ou un chantillon de saumure (Guiraud, 2003) :

dnombrement des coliformes, des coliformes thermotolrants ou dEcherichia

Coli,

dnombrement des staphylocoques

dnombrement de la flore " totale " msophile et psychrophile

dnombrement des Vibrio banaux (bien que le sel de saumure inhibe la

croissance des vibrio),

recherche de Salmonella, dautres germes pathognes et de toxines

Les staphylocoques ne seront pas dnombrs dans cette tude car laliment ne de-

vient toxique que sil est contamin par des souches productrices dentrotoxines

(peu frquent) et si des conditions favorables une multiplication bactrienne im-

portante et la toxinognse se trouvent runies. Autrement dit, la recherche de

staphylocoques dans les aliments prsente moins dintrt que la recherche den-

trotoxines et donc nest pas intressante titre prventif. Dautre part, il faut

aussi remarquer que la toute grande majorit des infections alimentaires par le

staphylocoque ne sont pas dangereuses (Frevey et al, 2000).

Les vibrio banaux ne seront pas non plus dnombrs car le sel de saumure inhibe

leur croissance. Ainsi pour des raisons de matriels et de temps nous nanalyserons

que la flore globale gram - (entrobactries totales), coliformes totaux et thermo-

tolrants et une recherche de quelques germes pathognes (E. Coli, Salmonella,

Shigella).

1.4.2 Entrobactries

La famille des Entrobactries regroupe de nombreuses espces dont la plupartsont des htes normaux (commensaux) de lintestin de lhomme et des animaux.

Dans lintestin terminal, ces bactries reprsentent plus de 10 % de la flore totale

et la majorit de la flore intestinale aro-anarobie. Chez lhomme, lentrobactrie

intestinale dominante estEscherichia Coli. Les Entrobactries sont trs rpandues

dans la nature en raison de la contamination de lenvironnement par lintermdiaire

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des matires fcales animales et humaines et des eaux dgout (Avril et al., 2000).

Ce sont des contaminants alimentaires trs frquents (contamination fcale directe

et indirecte) et cest pour cette raison que nous nous intresserons particulirement

ces bactries. Celles-ci sont capables de dveloppements abondants dans un

produit alimentaire et donc de dgradations importantes.

Les Entrobactries sont des bacilles Gram -, oxydase -, catalase + (sauf pour

Shigella dysenteriaeserovar 1), asporuls. Ils rduisent les nitrates en nitrites et

fermentent le glucose ; ils sont anarobies facultatifs. Les Entrobactries se mul-

tiplient facilement sur glose ordinaire pH neutre, une temprature de 37 C.

Elles donnent des colonies apigmentes lisses ou rugueuses de 1 3 mm de dia-

mtre. Certaines espces sont mobiles, dautres pas (Avril et al., 2000 ; Fervey et

al., 2000).

Les principales entrobactries rencontres dans lalimentation sont nombreuses

mais nous nallons nous intresser qu certaines de ces bactries qui sont prsen-

tes dans les sous-sections suivantes.

1.4.3 Coliformes

En microbiologie alimentaire, on appelle " coliformes " les Entrobactries fer-

mentant le lactose avec production de gaz 30 C. Il sagit dun groupe disparate

issu de plusieurs tribus qui comprend les genre lesEscherichia, Citrobacter, Ente-

robacteretKlebsiella. Sauf quelques biotypes dEscherichia Coli, il sagit despces

peu dangereuses sur le plan sanitaire et qui ne sont jamais entro-pathognes. Ce-

pendant, lorsquils sont en nombre trs lev, les coliformes peuvent provoquer des

intoxications alimentaires. Les coliformes sont donc des marqueurs de qualit hy-

ginique gnrale et cest pour cette raison que leur dnombrement est intressant

(Guiraud, 2003).

1.4.4 Coliformes fcaux ou thermotolrants

Les coliformes fcaux sont des coliformes capables de se dvelopper 44 C.

Cette catgorie inclut essentiellement Escherichia Coli, ce qui se traduit parfois

par lappellation "E.Coliprsomptifs ". Cette flore est spcifique de la flore fcale

et est donc recherche pour valuer la contamination fcale des aliments. Les coli-

formes fcaux ne survivent pas longtemps lextrieur du corps, leur prsence dans

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les aliments est donc un signe de contamination relativement rcente. Pour distin-

guer les coliformes des coliformes fcaux, lincubation 2 tempratures diffrentes

(37 C et 44 C respectivement) est ncessaire (Guiraud, 2003).

1.4.4.1 Escherichia Coli

Il sagit dune Entrobactrie lactose +, gazogne, ralisant une fermentation

mixte ; elle produit de lindole (Varnam & Evans, 1996). Cest un hte normal

de lintestin de lhomme et des animaux qui est trs abondant dans les matires

fcales (106 107 par gramme chez lhomme : 80 % de la flore arobie)(Avril et

al., 2000). Cest lun des rsidents les plus communs du tractus intestinal et cest

probablement lorganisme le mieux connu en microbiologie. Comme les autres

coliformes, cette espce peut tre responsable dintoxications cause dun dve-

loppement abondant. En outre, certains srotypes peuvent tre considrs comme

pathognes et provoquent des troubles digestifs spcifiques. Ces E.Colipathognes

possdent selon le cas, une ou plusieurs toxines. La prsence dE.Colidans leau

ou les aliments est un indice de contamination fcale. Bien que ce microorganisme

ne soit pas habituellement un agent pathogne, il cause parfois des infections des

voies urinaires, des diarrhes, gastro-entrites, mningites, septicmie et provoque

de trs graves maladies dorigine alimentaire (Guiraud, 2003). E.Coliest lune des

principales bactries responsables de diarrhe dans les pays en voie de dveloppe-

ment o elle gnre des pidmies de collectivit. La transmission des infections

parE.Coliest fco-orale. Les diffrents syndromes cliniques sont dus des E.Coli

diffrents. On reconnat au moins 5 types de souches responsables de diarrhes

(Avril et al., 2000) :

E.Coli entro-pathognes (ECEP) : Ces souches sont responsables des

gastroentrites svres surtout chez les enfants de moins dun an. Elles pos-

sdent parfois des toxines de type Shiga-like.

E.Colientro-toxignes (ECET): Elles provoquent des syndromes cho-

lriformes. Ces souches sont capables dexcrter des toxines (thermostables

et thermolabiles). Cest lagent responsable de la diarrhe du voyageur.

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E.Colientro-invasifs (ECEI): Ces souches infectieuses sont trs rares.

Elles provoquent des diarrhes aigus avec fivre, il sagit de syndromes dys-

entriformes : la souche se fixe la muqueuse et linfecte. La prsence de

leucocytes dans les selles est le tmoignage du processus invasif.

E.Coli entro-hmorragiques (ECEH): Ces souches sont responsables

de diarrhes banales ou hmorragiques. Elles provoquent une diarrhe san-

glante et ventuellemnt un syndrome durmie hmolytique li la prsence

dune vrotoxine (type Shiga-like SLT). La souche la plus dangereuse est

responsable dpisodes pidmiques avec des cas mortels. Un produit ali-

mentaire contamin peut tre lorigine des pidmies (surtout la viande).

E.Colientro-agrgatifs (EAggEC) : Ces souches provoquent des diar-

rhes chroniques persistantes.

1.4.5 Salmonella

LesSalmonellasont des Entrobactries, bacilles mobiles, produisant du gaz en

glucose, lactose - et ONPG -, possdant une LDC et une ODC, utilisant le citrate

de Simmons comme seule source de carbone, ne possdant ni urase, ni TDA, ni

glatinase, ne fermentant pas le saccharose, le raffinose et la salicine et dont la

raction de Voges-Proskauer (VP) est ngative. (Varnam & Evans, 1996). Leur

classification est complexe car il existe plus de 2500 srotypes. Presque toutes les

espces du genre Salmonellasont potentiellement pathognes et peuvent causer

une varit de symptmes pouvant aller de la simple gastro-entrite des manifes-

tations plus svres pouvant parfois entraner la mort. On trouve frquemment ces

bactries dans le tractus intestinal de nombreux animaux. La contamination des

produits peut tre originelle (animaux malades) ou provenir de manipulateurs ma-

lades ou porteurs sains de germes. Lorsque les conditions dhygine sont mdiocres,

il y a un risque de contamination des aliments et, par consquent, des humains. La

contamination se fait par voie orale. La frquence des infections Salmonellaest

en augmentation. Elle est favorise par le dveloppement des repas pris en collec-

tivit o les aliments sont prpars bien avant dtre consomms et dans lesquels

les bactries peuvent se multiplier (Guiraud, 2003). Toutes les varits daliment

sont susceptibles dtre contamin par quelques germes de Salmonellamais on les

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retrouve surtout dans les produits dorigine animale (oeufs, lait, viande, volaille,

poissons,...), leau pollue et les produits consomms crus. Tout dfaut dans la

conservation des aliments permet la multiplication des quelques germes ventuel-

lement prsents. Plusieurs srotypes parmi lesquels Typhi et Paratyphi provoquent

des maladies infectieuses graves appeles respectivement fivres typhode et pa-

ratyphode. Dautres srotypes plus frquemment impliqus provoquent des infec-

tions bnignes appeles salmonelloses. Lingestion de 105 bactries entrane une

toxi-infection alimentaire. Les toxi-infections Salmonellase manifestent par des

diarrhes, de la fivre et des vomissements ; les premiers signes surviennent 8 10

heures aprs lingestion de laliment contamin. Lvolution de ces gastro-entrites

est souvent favorable en quelques jours mais elle constitue un rel danger chez

les jeunes enfants. La plus simple prvention contre une infection Salmonella

est lhygine. Les Salmonellatant des bactries dangereuses, responsables dun

grand nombre de troubles dorigine alimentaire, elles ne doivent pas tre prsentes

dans un aliment. Les cas mortels ne sont pas exceptionnels, en particulier chez les

jeunes enfants et les personnes ges (Avril et al., 2000 ; Guiraud, 2003).

1.4.6 Shigella

Les Shigella sont des entrobactries Gram ngatif, lactose -, immobiles,

fermentant le glucose sans gaz, ne produisant jamais deH2Set ne prsentant pas

de culture sur milieu citrate de Simmons ni de LDC ou de tryptophane-dsaminase

(Varnam & Evans, 1996). Elles sont toujours pathognes et leur principal rservoir

est le tube digestif de lhomme. Ces bactries ne font pas partie de la flore normale

du tube digestif. Elles sont prsentes dans les matires fcales des malades. Les

diffrents srotypes sont lis la possession dantignes O et K. Ils sont rpartis

en 4 groupes correspondant des espces (Avril et al., 2000) :

Groupe A (10 srotypes) : S. dysenteriae

Groupe B (6 srotypes) :S. flexnerii

Groupe C (15 srotypes) : S. boydii

Groupe D (1 srotype) : S. sonnei

La forme la plus grave de shigellose est la dysenterie bacillaire due S. dysente-

riae. Cette souche provoque des diarrhes sanglantes avec des troubles associs

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(douleurs, cphales). Les autres shigelloses sont plus frquentes : elles se mani-

festent comme des gastro-entrites avec un caractre entro-invasif. La shigellose

est la plus transmissible des maladies bactriennes intestinales, dix germes vivants

peuvent provoquer la maladie chez un adulte sain. La dissmination de la maladie

se fait par des aliments, de leau de boisson contamins par des matires fcales,

par des mouches ou de personne personne. Les shigelloses surviennent l o les

conditions dhygine sont dfectueuses. Le lavage des mains et lamlioration de

lapprovisionnement en eau sont des mesures qui rduisent la transmission fco-

orale (Guiraud, 2003). Ces bactries sont responsables de la dysenterie bacillaire

et de diarrhes qui constituent un problme majeur de sant publique dans les

pays en voie de dveloppement. En effet ces pays prsentent un taux de morbidit

par les shigelloses lev (Avril et al., 2000). Les enfants de 1 5 ans sont particu-

lirement atteints. Dans certains pays, la mortalit est leve. On compte plus ou

moins 600 000 morts par an.

1.5 Normes et critres

Pour obtenir une qualit dalimentation optimale, des normes ont t tablies

qui dterminent le nombre seuil de micro-organismes ne pas dpasser en vue

dviter tout danger pour la population. Ces normes dfinissent un niveau de

risque acceptable pour une population donne. Chaque pays a ses propres normes

en matire dalimentation mais la plupart des pays adoptent celles conseilles

par lOrganisation Mondiale de la Sant (OMS). Le Laos se base aussi sur les

normes lOMS (Codex alimentarius) mais ces normes ne sont bien videmment

pas contrles dans lalimentation des campagnes. Nous ne tiendrons en compte

que les normes alimentaires pour les poissons sals ou marins (ce qui correspond

au poisson en saumure comme le padek) pour les bactries qui nous concernent :

Le CNERNA (Centre national dtudes et de recommandations sur la nutrition

et lalimentation) propose :

absence deSalmonelladans 25 g

absence dautres germes pathognes et toxines (Shigella)

Entrobactries< 103/g,

Coliformes< 103/g,

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Coliformes thermotolrants < 10/g ouEscherichia Coli< 10/g

Ces normes sont valables pour tous les pays membres de la commission du codex

alimentarius (FAO/OMS).

1.6 Les antibiotiques et les rsistances aux

antibiotiques

1.6.1 Dfinition et origine des antibiotiques

Antibiotique = toute substance, naturelle ou synthtique capable dinhiber in

vivo le dveloppement des bactries. Selon quils sont actifs contre beaucoup ou

peu de germes, on les divise en antibiotiques large spectre ou spectre troit.2

Un antibiotique se caractrise donc par une action spcifique sur les germes

viss sans perturber le fonctionnement des cellules eucaryotes (hte). Il devra donc

idalement affecter une voie mtabolique absente ou peu active chez les eucaryotes

mais essentielle aux procaryotes, ou atteindre une cible spcifique aux procaryotes.

1.6.2 Mcanismes daction des antibiotiques

Les antibiotiques bloquent de manire spcifique les processus mtaboliques

vitaux des bactries sensibles et arrtent ainsi leur dveloppement, le plus souvent

seulement temporairement (effet bactriostatique) mais parfois dfinitivement (ef-

fet bactricide). Cette inhibition ne se manifeste qu partir dune certaine concen-tration, la concentration minimale inhibitrice (CMI). En dessous de cette concen-

tration, la croissance bactrienne reprend.

1.6.2.1 Cibles bactriennes des antibiotiques (mcanismes daction)

Les bactries, qui sont des cellules procaryotes, se composent de structures dont

la prsence est essentielle leur croissance et leur survie : la paroi cellulaire, la

membrane plasmique, le cytoplasme, les ribosomes et lADN du chromosome, les

enzymes intervenant dans le mtabolisme cellulaire. Par consquent, attaquer une

des structures cellulaires ou dnaturer les enzymes, cest viser lintgrit de la

cellule microbienne et provoquer sa mort.

2Dfinition de Jacques Quevauvilliers et Abe Fingerhut (coord. par), Dictionnaire Mdical(5me dition), Paris, Ed. Masson, 1997, 1999, 2001.

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Il existe diffrents types dantibiotiques capables dagir sur les bactries (Sand-

ford et al., 2005) :

a. Antibiotiques actifs sur la paroi bactrienne

Les cellules eucaryotes animales ne possdent pas de paroi. Les bactries

par contre sont entoures dune coque en peptidoglycan, polymre de sucres

rticul par des ponts de nature peptidique. Plusieurs classes dantibiotiques

prennent pour cibles des enzymes intervenant dans la synthse de cette paroi.

(Exemples : beta-lactames, glycopeptides)

b. Antibiotiques actifs sur la membrane plasmique

Ce sont des antibiotiques qui altrent la permabilit de la membrane. La

membrane plasmique des microorganismes, situe juste sous la paroi cellu-

laire, est la cible de nombreux agents antimicrobiens. Cette membrane joue

un rle actif dans la rgulation de lentre des nutriments dans la cellule et

de llimination des dchets hors de la cellule. La dtrioration des lipides ou

des protines de la membrane plasmique par un agent antimicrobien entrane

la rupture de la membrane et lcoulement du contenu de la cellule dans le

milieu environnant, ce qui fait obstacle la croissance de la cellule.

c. Antibiotiques actifs sur la synthse protique

Les ribosomes procaryotes ne sont pas constitus des mmes protines que

les ribosomes eucaryotes, et ont dailleurs des coefficients de sdimentation

diffrents :

70S pour les ribosomes procaryotes (50S pour la sous-unit lourde et 30S

pour la sous-unit lgre)

80S pour les ribosomes eucaryotes (60S pour la sous-unit lourde et 40S

pour la sous-unit lgre)

Il existe des inhibiteurs de la sous-unit 50S et de la sous-unit 30S.

d. Antibiotiques actifs sur le mtabolisme des acides nucliques et deleurs prcurseurs

On distingue les antibiotiques actifs dune part sur la synthse des ARN et

dautre part sur la synthse des ADN ou de leurs prcurseurs.

e. Antibiotiques inhibiteurs des voies mtaboliques

Chez les procaryotes, le mtabolisme procde de voies trs varies car ils ont

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acquis une capacit dadaptation la vie dans des milieux nutritifs et des

conditions de survie trs diffrents des eucaryotes. Malgr ce fait, le nombre

de molcules agissant ce niveau et utilisables en clinique est trs rduit.

1.6.3 Classes des antibiotiques

Il est trs difficile de classer les antibiotiques. On peut les classer par familles

selon la composition chimique. Il existe 17 familles dantibiotiques et plusieurs

sous-familles classes en fonction des groupements chimiques. Les plus courantes

sont (Rpertoire Comment des Mdicaments, 2006) :

a. Beta-lactames comprenant les Pnicillines, les Cphalosporines,... ayant un

spectre dactvit assez large.

b. Macrolides qui ont un spectre dactivit troit.

c. Tetracyclines

d. Aminoglycosides ou aminosides, antibiotiques daction rapide et puissante.

e. Quinolones, antibiotiques large spectre.

f. Sulfamides antibactriens.

1.6.4 Rsistances aux antibiotiques

La rsistance aux antibiotiques peut se manifester de deux manires distinctes :

Rsistance naturelle : On peut parler de rsistance naturelle si toutes les

souches dune mme espce sont rsistantes un antibiotique. Cest lexpres-

sion dune proprit inne refltant lempchement daccder la cible ou

labsence de la cible.

Rsistance acquise : La rsistance acquise advient lorsque quelques souches

dune mme espce normalement sensibles deviennent rsistantes. Cette r-

sistance peut tre acquise par mutagense : cest une rsistance chromoso-

mique. La mutation est spontane avec une frquence dapparition de 106

107. Cest un vnement assez rare.

Autres types de rsistances : Les bactries sont capables de transfrer

des informations gntiques telles que des mcanismes de rsistance.

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1.6.5 Antibiotiques utiliss dans cette tude

Les antibiotiques utiliss dans cette tude, leurs classes et leurs mcanismes

daction sont repris au tableau 1.

Antibiotique Abrviation Famille Mcanisme daction

Doxicycline D Ttracycline Action sur la synthse protique et inhibi-tion de nombreux systmes enzymatiques

Acide Nalidixique NA Quinolones Inhibition de la rplication de lADNGram ngatifs

Pipracilline ta-zobactam

TZP Beta-lactames (p-nicilline)

Inhibition de la synthse de la paroi etinactivation denzymes entrant dans lac-tivit de la membrane + inhibition desbeta-lactamases (tazobactam sodique)

Ampicilline AM Beta-lactames (p-nicilline)

Action sur la synthse protique et inhibi-tion denzymes actifs dans la membrane

Ciprofloxacine CIP Quinolones (fluoro-quinolones)

Inhibition de la rplication de lADN bac-trien

Sulfamthazole+ Trimthoprime

SXT Sulfamids Inhibition de bases dADN (purines)

Gentamycine GM Aminoglycosides Inhibition de la synthse de certaines pro-

tines bactriennesCeftazidime CAZ Beta-lactames (c-

phalosporines)Inhibition de la synthse de la paroi

Cefotaxime CTX Beta-lactames (c-phalosporines)

Inhibition de la synthse de la paroi

Amoxicilline -Acide clavula-nique (augmen-tin)

AMC Beta-lactames (p-nicilline)

Inhibition de la synthse de la paroi etinactivation denzymes entrant dans lac-tivit de la membrane + inhibition desbeta-lactamases (acide clavulanique)

Tab. 1: Classification et caractristiques des antibiotiques utiliss dans cette tude

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Chapitre II

MATRIELS ET MTHODES

Dans cette partie, nous allons dcrire toutes les tapes de notre mode opratoire

au Laos puis en Belgique. La pratique sest droule comme suit :

1. Laos : rcolte et premires analyses des chantillons (culture sur boites

(dnombrement des coliformes et coliformes fcaux et des entrobactries),

recherche des germes pathognes, tests complmentaires comme test cyto-

chrome oxydase, test-glu, test de coloration Gram)

2. Belgique: 2 tapes :

a. Identification et antibiogramme des souches ramenes du Laos

b. Analyse et identification des chantillons de padek rcolts ultrieure-

ment notre retour en Belgique.

2.1 LAOS

Comme nous lavons expliqu plus haut, nous avons pu raliser nos analyses

dans le laboratoire de microbiologie de la facult de mdecine de luniversit na-

tionale de Vientiane. Ltat du laboratoire et le manque de matriel a dtermin le

nombre danalyses par semaine et nous a donc amen analyser un nombre rduit

dchantillons. Avant lchantillonnage, une prparation pralable des milieux de

culture suivant le mode opratoire conseill par le fabricant est ncessaire. Ces

milieux de culture sont ensuite soit couls en boite de Ptri, soit rpartis en tubes,

puis sont conservs au rfrigrateur (4 C) jusqu leur utilisation. . Cette section

est principalement base sur louvrage Microbiologie alimentaire (Guiraud J-P.,

Paris, 2003) auquel nous renvoyons le lecteur pour de plus amples informations.

2.1.1 Prlvement des chantillons

Ltape suivante de notre protocole danalyse est la rcolte des chantillons

puis lanalyse de ceux-ci au laboratoire. Le prlvement des chantillons se fait

dans 6 villages du district de Pakkading dans la province de Bolikhamsa. Un

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chantillon de padek est prlev par foyer, slectionn alatoirement. Entre 10 et 20

chantillons sont prlevs par village, cette quantit dpendant de la disponibilit

en padek des villageois (figure 4).

Fig. 4: Prlvement de padek solide ( gauche) et liquide ( droite). Le padek est conservdans une grande jarre recouverte par un tissu

A chacun deux, nous avons adjoint diffrentes informations telles que le nombre

de personnes vivant dans la maison, le nombre denfants par habitation, la dure

de conservation du padek, et une estimation personnelle du niveau de vie du foyer

suivants diffrents critres comme la prsence dlectricit, de sanitaires, la pos-

session dun frigo,... (sur une chelle croissante de 1 (niveau de vie pauvre, faible)

10 (niveau de vie lev)).

Les chantillons prlevs sont des chantillons de 10 g recueillis laide dunecuiller strile puis dposs soit dans un petit sac en plastique ligatur, soit dans

un tube de 20 mL strile (cas pour les chantillons liquides). Ceux-ci sont ensuite

disposs dans un box frigo et transports ainsi jusquau laboratoire. Etant donn

la pauvret des villageois, il ntait pas possible et il ne nous semblait pas opportun

de leur prendre une grande quantit de nourriture malgr la gnrosit que ceux-ci

montraient envers nous.

2.1.2 Prparation des chantillons

Les chantillons solides sont broys via un mixer. Puis 8 g des chantillons

solides et liquides sont homogniss et mlangs laide dune solution revivifiante

deau peptone tampone (16ml) (solution denrichissement) [OXOID]. Ensuite

la suspension est laisse 15 45 minutes la temprature du laboratoire (20 C)

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avant deffectuer les dilutions et densemencer les milieux. Les 2 g restant des

chantillons liquides et solides seront utiliss par la suite pour la recherche de

germes pathognes (voir point 2.1.6)

2.1.3 Dilutions

Les dilutions des chantillons sont effectues laide de solution de revivifi-

cation : eau peptone tampone [Merck]. Les dilutions sont effectues selon des

sries logarithmiques dont les termes sont en progression gomtriques savoir :

0,1 (101), 0,01 (102), 0,001 (103), 0,0001 (104). Les dilutions sont effectues

dans des conditions aseptiques. Nous prparons autant de tubes quil y a de dilu-

tions raliser en prenant des tubes striles dans lesquels on pipette aseptiquement

9 ml de liquide diluant. Le liquide diluant utilis est de leau peptone tampone

qui est un milieu denrichissement pour les entrobactries. Ensuite on prlve 1

ml de la suspension de lchantillon (= suspension de dpart ou suspension mre)

laide dune pipette de 1 ml et on le porte dans le premier tube de dilution

(101). Avec une nouvelle pipette de 1 ml, on homognise par aspirations et souf-

flages le contenu de ce tube 101 et on ensemence le tube 102 et ainsi de suite en

changeant chaque fois de pipette pour ne pas perturber les dilutions (+ tubes

tmoins).

2.1.4 Numration des entrobactries totales

Les Entrobactries totales sont dnombres car elles sont un bon marqueur de

la qualit hyginique. Le dnombrement et lisolement des Entrobactries totales

seffectuent sur un milieu glucos inhibant la croissance des bactries Gram + et

de la plupart des autres bactries Gram -. Le milieu le plus courant pour lana-

lyse alimentaire est la glose glucose bilie au cristal violet et au rouge neutre

(VRBG) [facult de vtrinaire, ULg]. La bile et les colorants sont des agents s-

lectifs et le glucose permet la croissance de toutes les Entrobactries. Diffrentstypes densemencement existent. Ici nous utiliserons linoculation dans la masse.

Cette technique densemencement consiste ajouter 1 ml de chaque dilution dans

des boites de Ptri vides striles en utilisant un pipette propre. Ensuite 10 15 ml

de milieu glos en surfusion (40 45 C) sont couls dans la boite et mlangs uni-

formment avec linoculum par un mouvement circulaire horizontal. Aprs 5 min,

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une nouvelle couche de milieu vierge est coule sur la couche prcdente solidifie.

Ce procd favorise les conditions anarobies (numration en double couche) : les

germes anarobies sont favoriss au dtriment des arobies stricts. Aprs 24 heures

dincubation 37 C, les colonies se dvelopperont en profondeur. Le comptage

des colonies rouges, dau moins 0,5 mm de diamtre, donne le nombre dEntro-

bactries (UFC = unit formant colonie). Pour des raisons de manque de matriel,

nous nensemenceront que 2 boites de Ptri 2 dilutions diffrents : 101 et 102.

2.1.5 Colimtrie et recherche dEscherichia Coli

La colimtrie peut constituer un bon indice de qualit hyginique mais le d-

nombrement des Entrobactries totales est plus intressant. Les Entrobactries

et Escherichia Coliont une thermorsistance identique celle des germes patho-

gnes non sporuls : leur recherche permet donc de juger si laliment a t cuit

de faon efficace tuer les germes ou non. Escherichia Coliest considr comme

un bon indicateur de contamination fcale (et donc de prsomption de bactries

pathognes) pour les produits crus ; dans les autres cas, il sagit dun indicateur

dhygine gnrale.

2.1.5.1 Colimtrie en milieu liquide

La colimtrie en milieu liquide permet la caractrisation et dnombrement des

coliformes. Il ne sagit bien souvent que dun test prsomptif qui demande confir-mation et qui ncessite lemploi dun milieu solide de diffrenciation et disolement.

La colimtrie en milieu liquide consiste en une numration par la mthode NPP

(voir plus bas). Le milieu utilis est le milieu BLBVB (= bouillon lactos bili au

vert brillant) avec cloche (Milieu pour le dnombrement des coliformes) [OXOID].

Lassociation bile-vert brillant inhibe la plupart des germes non-Entrobactries.

La culture se fait dans des tubes avec cloche de Durham. Les milieux sont incu-

bs 24 48 heures une temprature de 37 C. Le milieu devient trouble et vertjauntre lors de la pousse bactrienne ; si elle saccompagne dune importante pro-

duction de gaz, ceci est une prsomption de la prsence de coliformes. Le caractre

positif se traduit par un dgagement de gaz de 1/10e au moins du volume de la

cloche.

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2.1.5.2 Numration par la mthode NPP (Nombre le Plus Probable)

Cette mthode est base sur le fait quaprs ensemencement dun milieu liquide,

toute croissance microbienne indique la prsence dau moins un germe (UFT :

Unit Formant Trouble). Le dveloppement peut tre apprci visuellement par

dgagement gazeux dans une cloche de Durham.

Une srie de dilutions est effectue partir de la suspension dnombrer (voirplus haut au point 2.1.3). Une petite quantit (6 mL) de ces dilutions est place

dans des tubes contenant du bouillon BLBVB (6 mL). La dilution 101 nest pas

ensemence en raison du manque de matriel. Il tait en effet prfrable de sin-

tresser aux tubes plus dilus tant donn les grandes concentrations de germes

trouvs dans les tests dexpriences. Aprs culture, on procde la lecture des

rsultats. Sont compts positifs les tubes qui prsentent une croissance (dgage-

ment de gaz) et ngatifs les autres. Lorsquun seul tube est ensemenc par dilution

(comme cest le cas ici vu le manque de matriel), on peut faire une estimation de

la concentration de coliformes dans notre chantillon. Ainsi, si le tube 103 est po-

sitif (et les dilutions plus faibles) et le 104 est ngatif (et les dilutions plus fortes),

on dira quil y avait au moins une cellule dans la dilution ayant ensemenc le tube

103 et au plus 9 car sil y en avait eu 10, le tube 104 aurait t positif. On dira

alors que la flore contient entre 103 et 9.103 germes/mL. Lorsque plusieurs tubes

sont ensemencs, la dtermination est plus prcise mais il na pas t possible de

le faire faute de moyens (matriel) et de temps. Un test de confirmation peut tre

ralis pour vrifier la prsence des coliformes en incubant une petite quantit de

la culture des tubes positifs sur un milieu slectif tel que le milieu losine et au

bleu de mthylne de Teague-Levine (EMB) [Biomrieux] 37 C.

Les coliformes thermotolrants, parfois appels " coliformes fcaux " ou

" Escherichia Coliprsomptifs ", peuvent tre recherchs et dnombrs dans les

mmes conditions mais lincubation se fait 44 C. Sil y a dgagement de gaz, une

confirmation par culture en milieu solide est ncessaire (milieu EMB). Dautres

Entrobactries (Citrobacter, Klebsiella,...) peuvent donner une raction positive,

il conviendra donc de raliser une identification plus prcise via un isolement sur

milieu EMB puis pour confirmation plus prcise de raliser une galerie Api 20 E

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(voir section 2.2.1.2).

Pour la recherche dE.Coli, un isolement sur milieu EMB ralis partir

des derniers tubes positifs de la colimtrie permet de confirmer la prsence de

E.Coli dans notre chantillon. Lensemencement de la glose EMB se fait par

transfert lese et tal directement sous formes de stries dpuisement la

surface de la glose. Lincubation dure 24 heures 44 C. Le milieu EMB contient

deux colorants, losine et le bleu de mthylne qui inhibent la majeure partie

de la flore Gram+ (sauf Streptocoques D). Bien que les Entrobactries lactose -

puissent sy dvelopper, la culture des Entrobactries lactose + y est favorise.

Le lactose est un critre de diffrenciation du milieu : lutilisation du lactose se

traduit par un centre fonc daspect mtallique des colonies (lactose +), dans le cas

contraire les colonies sont incolores (lactose -). Les Escherichia Coliapparaissent

comme des colonies isoles, de 2 3 mm de diamtre, ayant tendance confluer

et prsentant un reflet mtallique verdtre en lumire rflchie et un centre noir

pourpre en lumire transmise.

2.1.6 Recherche des germes pathognes (Salmonella et Shigella)

La recherche de ces germes est souvent complique par leur faible concentration

dans lchantillon analyser. Une des solutions est dutiliser des milieux denrichis-

sement liquides qui permettent la multiplication des germes avant leur isolementet leur identification. Cette technique ne permet pas une numration mais une

simple mise en vidence.

La mthode est la mme pour les Salmonellaet lesShigella: 1 g dchantillon

est mlang 9 ml de bouillon slnite selon Leifson (milieu denrichissement

pour Salmonellaet Shigella) [BD]. Le slnite de sodium inhibe la croissance des

bactries coliformes et des entrocoques ainsi que celle de nombreuses bactries

Gram positif. Mais il peut y avoir dveloppement de quelques entrobactries

non pathognes (Klebsiella, Proteus) et dautres bactries Gram- (Pseudomonas).

Aprs enrichissement, les milieux servent ensemencer des milieux solides disole-

ment comme la glose SS (Salmonella-Shigella) que nous utilisons ici. Cette glose

contient 4 inhibiteurs qui empchent la croissance des germes Gram positif et

rendent difficile la croissance des germes Gram ngatif autres que Salmonellaet

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Shigella. Ce milieu contient galement du lactose dont la fermentation est mise

en vidence par le rouge neutre et du citrate ferrique qui permet de mettre en

vidence la production dH2S. Lincubation dure 24 heures 37 C.

Ensuite des tests de caractres sont effectus :

Milieu TSI [BD] : milieu pour la diffrenciation des entrobactries par la

fermentation de trois sucres et la production dH2S.

Milieu Citrate de Simmons [BD] : Milieu glos pour lidentification des

entrobactries par lutilisation du citrate comme seule source de carbone.

Milieu Lysine[BD] : Milieu de diagnostic des Salmonella, la glose lysine-

fer est un milieu diffrentiel qui dtecte les salmonelles par leur activit lysine

dcarboxylase et la production dH2S.

Milieu SIM [BD] : Milieu pour la diffrenciation des entrobactries base

sur la production dH2S, la production dindole et la mobilit des germes.

Suivant la couleur prise par ces milieux et le dgagement ventuel de gaz, une

prsomption didentification peut tre ralise.

2.1.7 TESTS DE CONFIRMATION DIDENTIFICATION

Des tests de confirmation didentification peuvent tre raliss pour toutes les

souches obtenues en vue de confirmer notre prsomption didentification.

1. Caractrisation denzymes : Test -glu

Ce test est utilis pour diagnostiquer lesEscherichia Coli. La-glucuronidase

(-glu) hydrolyse lacide paranitrophnyl -glucopyranoside uronique. Ce

compos donne du paranitrophnol de couleur jaune. Cette enzyme est pr-

sente chezE.Coliet est donc intressante pour son diagnostic car la plupart

des autres Entrobactries sont ngatives pour cette enzyme.

2. Mise en vidence denzymes respiratoires: Test cytochrome oxydase

Les oxydases interviennent la fin des tapes de dshydrognation et des

chanes de cytochromes. Il en existe plusieurs types. Elles sont mises en vi-

dence par leur proprit de catalyser la raction doxydation dun substrat

organique par loxygne de lair. Le substrat utilis est le N-dimthyl para-

phnylne diamine, qui est incolore sous forme rduite et rouge-violet sous

forme oxyde ou le chlorohydrate de ttramthyl paraphnylne diamine qui

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donne une coloration pourpre. Le caractre oxydase + signifie que la souche

possde une enzyme capable doxyder le substrat employ et ne signifie pas

la prsence dune oxydase particulire. Le test est ralis sur papier filtre

" OX ", imprgns de ractif. La colonie est prleve et dpose sur le pa-

pier filtre. Une coloration bleue est considre comme positive. Toutes les

entrobactries sont cytochrome oxydase ngative.

3. Coloration Gram

La coloration diffrentielle la plus connue est celle de Gram, qui permet de

diviser les bactries en deux grands groupes : Gram + et Gram -. Cette

mthode de coloration est base sur la diffrence de structure de paroi chez

les 2 groupes : les bactries Gram + contiennent une forte proportion de

lipides (20%) et retiennent le violet de gentiane (premier colorant) aprs

lavage lalcool ; les bactries Gram - contiennent une faible proportion de

lipides, sont dcolores lalcool et prennent ensuite la couleur du second

colorant.

Fig. 5:Reprsentation de la paroi des bactries Gram - et Gram +. La coloration Gram permet dediffrencier ces bactries. Le traitement par lalcool extrait les lipides chez les Gram - entrainantune dcoloration des organismes au premier colorant qui vont alors prendre la coloration dusecond colorant(rouge). Les parois Gram + au contraire sont dshydrates par lalcool : leurpermabilit diminue, le premier colorant ne peut tre extrait et elles gardent donc la colorationdu premier colorant (bleu). Extrait de (genebio, 2006)

Aprs avoir prsumer lidentification de nos diffrentes souches bactriennes, les

souches intressantes sont inocules sur un milieu PCA (plate count agar, milieu

pour le transport) et sont conserves au frigo (4 C). Les souches sont ramenes

en Belgique pour tre analyses dans le laboratoire de bactriologie du CHU.

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2.2 Belgique

2.2.1 Analyse des chantillons ramens du Laos par nos soins

Les souches vont subir une identification plus prcise via des galeries Api 20E,

un antibiogramme et le vitek (qui combine identification et antibiogramme).

2.2.1.1 Antibiogramme

Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant tester la sensibi-

lit dune souche bactrienne vis--vis dun ou plusieurs antibiotiques. Le principe

consiste placer la culture de bactries en prsence du ou des antibiotiques

tester et observer les consquences sur le dveloppement et la survie de celle-ci.

On place alors plusieurs pastilles dantibiotiques sur une souche bactrienne tale

dans une boite de Mueller-Hinton 2 [Biomrieux] laide dun couvillon. Ce mi-

lieu est une glose riche pour tester laction des diffrents antibiotiques. Il existe

3 types dinterprtation selon le diamtre du cercle qui entoure le disque danti-

biotique : souche sensible, intermdiaire ou rsistante. Ce diamtre reprsente la

zone dinhibition de lantibiotique sur la souche donne. Il reprsente la concen-

tration minimale inhibitrice (CMI) de lantibiotique sur cette souche (figure 6,

gauche). Les limites dinterprtation des antibiotiques que nous utilisons sont

Fig. 6: Suspension bactrienne dans une boite de Ptri. Figure de gauche : On constateclairement leffet inhibiteur de 4 des 5 antibiotiques. Le diamtre de la zone dinhibition delantibiotique correspond au CMI ou concentration minimale inhibitrice. Figure de droite:-lactamase spectre largi : Le bouchon de champagne (flche) entre le disque AMC et le disqueCTX montre une synergie entre le CTX et lacide clavulanique ; il sagit dune souche possdantune BLSE.

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fournies autableau 2.

Antibiotique Sensible Intermdiaire Rsistant

D > 16 13 - 15 < 12

NA > 19 14 - 18 < 13

TZP > 21 18 - 20 < 17

AM > 17 14 - 16 < 13

CIP > 21 16 - 20 < 15

SXT > 16 11 - 15 < 10

CAZ > 18 15 - 17 < 14

GM > 15 13 - 14 < 12

CTX > 23 15 - 22 < 14

AMC > 18 14 - 17 < 13

Tab. 2: Seuils de sensibilit - rsistance des diffrents antibiotiques tests. Le diamtre estexprim en mm. D= doxicycline ; NA = acide nalidixique; TZP= pipracilline tazobactam ;AM = aminopnicilline ; CIP = ciprofloxacine ; SXT = trimthoprime ; GM = gentamycine;CAZ= ceftazidime ; CTX = cefotaxime ; AMC = amoxicilline - acide clavulanique.

Nous recherchons via lantibiogramme les rsistances ces antibiotiques ainsi

que la prsence de -lactamase spectre tendu (BLSE). Ce terme dsigne les

enzymes -lactamases produites surtout parKlebsiella sp. etE. Coli, codant pour

la rsistance aux -lactamines large spectre, qui sont habituellement actives

contre les bacilles Gram ngatif. Parmi ces antibiotiques figurent la cfotaxime,

la ceftriaxone, la ceftazidime, laztronam et la cefpodoxime. Ces enzymes nont

aucune activit vis--vis des cphamycines et sont inhibes par lacide clavulanique

(figure 6, droite).

2.2.1.2 Galerie Api 20E [Biomrieux]

Galerie de 20 microtubes prts lemploi permettant de raliser 23 tests bio-

chimiques afin didentifier des bacilles Gram - appartenant la famille des EN-

TEROBACTERIACEAE.

Prparation de linoculum : Nous isolons une colonie bien isole ou nous

prlevons une souche pure et nous lintroduisons dans 5 ml deau distille

(Suspension dopacit de 0,5 sur lchelle de Mac Farland).

Ensemencement de la galerie : Nous introduisons la suspension bactrienne

dans chaque tube laide dune pipette Pasteur strile, pointe appuye

lintrieur et sur le ct pour viter la formation de bulles. Pour certains

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Fig. 7: Galerie Api 20E. La suspension bactrienne est introduite dans chaque tube laidedune pipette Pasteur strile. Lincubation dure 24 heures et la lecture permet didentifier lasouche.

caractres, il faut remplir le tube et la cupule (CIT, VP, GEL). Pour dautres

caractres, il faut remplir le tube et recouvrir dhuile de paraffine (ADH,

LDC, ODC, H2S, URE)(conditions anarobies)(figure 7).

Lecture de la galerie : La lecture se fait aprs 24 heures dincubation. Nous

ajoutons les ractifs adquats avant la lecture de la galerie (TDA, IND,

VP). La lecture se fait par linterprtation des couleurs (virage ou non) et

lattribution dun chiffre correspondant cette couleur. On obtient alors un

code qui nous permet de se rfrer au catalogue pour identifier la souche.

2.2.1.3 Vitek (Automate pour lidentification et lantibiogramme) [Biom-rieux]

Vitek automatise toutes les tapes ncessaires la ralisation des tests diden-

tification et dantibiogramme avec les cartes VITEK. Il est compos dun prpa-

rateur, dun incubateur/lecteur, dun ordinateur et dune imprimante. Le prpa-

rateur permet lensemencement des cartes VITEK. Lincubateur/lecteur assure

simultanment lincubation et la lecture des cartes. Lordinateur quip des logi-

ciels VITEK effectue un contrle permanent des oprations en cours, mmorise lesvaleurs, traite et interprte les rsultats. Chaque carte didentification comporte 30

puits qui contiennent des substrats biochimiques sous forme dshydrate. Aucun

ractif nest ajouter, ce qui vite tout risque doubli, derreur ou de contamina-

tion. Lidentification VITEK couvre plus de 300 espces.

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2.2.2 Analyse des chantillons ramens du Laos un mois aprs le retour

Les chantillons ramens ultrieurement du Laos vont tre ensemencs et iden-

tifis au laboratoire de microbiologie mdicale du CHU de Lige. Les chantillons

sont premirement broys manuellement grce des billes de verre striles de

0,5 mm de diamtre. Dans chaque chantillon sont ajoutes des billes de verre,

puis lchantillon est mlang avec un vortexer pour homogniser lchantillon etdtacher chaque bactrie potentielle. Ensuite les ensemencements des milieux de

culture sont effectus.

2.2.2.1 Ensemencements

Diffrents milieux de culture sont ensemencs en vue de rechercher la prsence

dEscherichia Coli, de Salmonellaet de Shigella.

a. Recherche dEscherichia ColiUn milieu Coli ID [Biomrieux] est dabord ensemenc pour rechercher la

prsence dEscherichia Colidans nos chantillons. Ce milieu de culture est

un milieu slectif chromogne permettant :

le dnombrement 44 C des E.Coli-glucuronidase positive.

la dtection et le dnombrement simultan des E.Coliet des autres coli-

formes 37 C, partir des produits alimentaires.

Linoculum est dpos dans la boite de Ptri, puis 10 15 mL du milieu glos

en surfusion (45 C) est ajout et mlang avec linoculum via un mouvement

circulaire horizontal. Lincubation dure 24 heures 44 C.

Colonie rose Bleue Incolore

-glucuronidase + - --galactosidase + + -

E.Coli Autres coliformes Autres gram -

Tab. 3: Coloration des souches bactriennes lensemencement du milieu ID Coli. Ce milieupermet une raction colore spcifique vis--vis des E.Coliet des autres coliformes possdantles enzymes -glucuronidase et -galactosidase.

Un milieu Drigalski agar [Merck] est aussi ensemenc pour la dtection d

E.Colidans nos chantillons. Ce milieu est slectif pour lisolement et la

diffrenciation des Entrobactries bas sur la capacit fermenter le lactose.

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b. Recherche de Salmonellaet Shigella

Le protocole est peu prs le mme que celui effectu au Laos. Un bouillon

slnite (milieu denrichissement)[OXOID] est ensemenc avec 1 mL de notre

chantillon et incub 24 heures 37 C. Puis un ensemencement dun milieu

XLD [BD] est effectu par transfert lose et des stries dpuisement sont

ralises sur ce milieu. Ce milieu Xylose Lysine Dsoxycholate est un milieu

disolement et didentification prsomptive la fois des Salmonellaet des

Shigella, bas sur la fermentation du xylose, la dcarboxylation de la lysine et

la production dhydrogne sulfur pour diffrencier lesSalmonellaetShigella

des bactries non-pathognes.

Ensuite, une identification par galerie Api 20E et Vitek 2 ainsi quin antibiogramme

sont raliss suivant les mmes protocoles que vu prcdemment.

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Chapitre III

RSULTATS

Dans ce chapitre, nous prsenterons les rsultats obtenus travers lanalyse

de nos chantillons au Laos et en Belgique. Nous commencerons par exposer les

rsultats des dnombrements des coliformes et des coliformes fcaux. Puis nous

prsenterons les identifications de toutes souches trouves. Ensuite nous mettrons

en relation nos rsultats avec les informations recueillies sur le terrain. Notre tude

est base sur les 60 chantillons rcolts et analyss par nos soins au Laos (Cat-

gorie I). A ceux-ci nous adjoindrons et comparerons les 55 chantillons rcolts

ultrieurement sur place et ensemencs en Belgique (Catgorie II). Nous ter-

minerons par prsenter les diffrentes rsistances aux antibiotiques de toutes nos

souches trouves.

3.1 Analyse des chantillons de catgorie I

3.1.1 Quantification des coliformes totaux, des coliformes fcaux etdes entrobactries

3.1.1.1 Coliformes totaux

Nous avons effectu le dnombrement des coliformes totaux dans 46 chan-

tillons de Catgorie I par la mthode du Nombre le Plus Probable (NPP) explique

dans la section Matriels et mthodes. Nous avons ralis les dilutions selon des

sries logarithmiques dcimales dont les termes sont en progression gomtriques

savoir : 0,1 (101), 0,01 (102), 0,001 (103), 0,0001 (104), 0,00001 (105). Aprs

ensemencement des tubes nous avons quantifi les coliformes dont les rsultats

sont illustrs lafigure 8. 48 % des chantillons prsentent un taux de coliformes

infrieur la limite recommande par le CNERNA cest--dire 103 germes/mL

dchantillon. A contrario, 52% des chantillons prsentent un taux de coliformes

suprieur aux recommandations. Ainsi, par exemple, une concentration suprieure

9.105 germes/mL est observe dans 15% des chantillons.

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Fig. 8: Rpartition des concentrations en coliformes dans les diffrents chantillons. Le seuillimite impos par le CNERNA est reprsent par la droite rouge.

3.1.1.2 Coliformes fcaux

Les coliformes fcaux ont t dnombrs suivant la mme mthode. Contrai-

rement aux coliformes totaux, nos rsultats prsentent une diminution de type

exponentielle du pourcentage dchantillons en fonction de la concentration en co-

liformes fcaux (figure 9). 52% des chantillons prsentent un taux de coliformes

Fig. 9: Rpartition des concentrations en coliformes fcaux dans les diffrents chantillons.

fcaux compris entre 0 et 90 germes par mL, 24% un taux compris entre 100 et

900 germes/mL et seulement 2% des chantillons possdent un taux de coliformes

fcaux suprieur 900 000 germes/mL.

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3.1.1.3 Entrobactries totales

Nous avons effectu un dnombrement des Entrobactries totales dans 48

chantillons par ensemencement dans la masse dun milieu VRBG de la dilution

101. Lors de la lecture des botes nous avons constat que 52% des chantillons

prsentaient une concentration dEntrobactries totales si leve que la quantifi-

cation tait impossible (tableau 4).UFC (Dilution 101) Nombre dEntrobactries/mL Pourcentage

0 0 20,83%

1 10 4,16%

2 20 6,25%

4 40 2,08%

5 50 2,08%

8 80 2,08%

10 100 2,08%

25 250 2,08%

40 400 2,08%83 830 2,08%

165 1650 2,08%

Indnombrable Indnombrable 52,08%

Tab. 4: Distribution de la concentration en entrobactries totales parmi les chantillons. Lenombre denterobactries par mL dchantillon est simplement dduit partir du nombre degermes prsents dans la dilution 101 de lchantillon considr. (UFC=Unit formant Colonie).

Etant donn la concentration limite recommande par le CNERNA de moins

de 103 germes/mL dchantillon, 54% de nos chantillons prsentent un taux dEn-

trobactries trop lev.

3.1.2 Identification des souches

Sur nos 60 chantillons, nous avons mis en vidence la prsence de 77 souches

bactriennes. Celles-ci ntaient pas rparties de manire homogne entre les diff-

rents chantillons. En effet, dans 6 chantillons, nous navons pas isol de bactries

tandis que de nombreux chantillons prsentaient deux trois souches bactriennesdiffrentes. Notre tude portait initialement sur la recherche de trois types de bac-

tries, savoirEscherichia Coli,SalmonellaetShigella. Nous navons trouvE.Coli

quen faible quantit etSalmonellaetShigellataient inexistantes. Ainsi seulement

10% des souches identifies taient E.Colitandis quaucune souche de Salmonella

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ou deShigellana pu tre mise en vidence par nos tests. Parmi les souches identi-

fies, 41% taient de lespce desEnterobacter Cloacae, 18% de lespce Klebsiella

pneumoniae, 15 % de Proteus mirabilis et 7 % de Providencia stuartii. Le reste

de souches se rpartissaient en diffrentes souches minoritaires. Les pourcentages

dtaills sont prsents la figure 10. Comme attendu, la majorit des souches

identifies appartenaient la famille des Enterobactries, les milieux de culture

utiliss tant conus pour assurer la croissance de celles-ci.

Fig. 10: : Distribution des diffrentes types de souches bactriennes prsentes dans nos chan-tillons de catgorie I .

3.2 Analyse des chantillons de Catgorie II

Sur les 55 chantillons de la catgorie II, seuls 13 chantillons prsentaient des

rsultats positifs lensemencement. Dix-sept souches bactriennes ont pu tre

identifies partir de ceux-ci. Les souches prsentes se diffrencient fortement de

celles de la Catgorie I. En effet, Enterobacter Cloacae, majoritaire dans notre ana-

lyse des chantillons de catgorie I, ne reprsente ici que 17% des souches, lespce

dominante tant ici Providencia(29%). Nous avons galement mis en vidence la

prsence dePseudomonas aeruginosa, celui-ci constituant un quart des souches (4

chantillons). Cinq autres souches ont pu tre mises en vidences savoir Pantoa,

Pasteurella pneumo., Flavi. Oryzhabitans, Stnotrophomonas maltophiliaetKleb-

siella pneumo. (figure 11). Notre analyse na cependant pas permis de dtecter

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Fig. 11: : Distribution des diffrentes souches bactriennes prsentes dans nos chantillons decatgorie II.

la prsence dE.Coli, de Salmonella ou de Shigella parmi les chantillons de lacatgorie II.

3.3 Corrlations selon les diffrents paramtres

Nous venons de mentionner les taux bactriens prsents dans nos chantillons

ainsi que les diffrentes souches qui ont pu tre identifies. Comme nous lavons

dj indiqu, la rcolte des chantillons tait adjointe la prise en compte de dif-

frents renseignements tels que le niveau de vie du foyer, le nombre de personneset denfants composant celui-ci ou encore la dure de conservation du padek pr-

lev. Dans cette section nous tudions les ventuelles corrlations entre certains

paramtres et nos rsultats.

3.3.1 Prsentation des villages et des diffrents paramtres.

Nous avons rcolts nos chantillons dans 6 villages du district de Pakkading.

Nous fournissons ici une vue densemble de quelques caractristiques de ces vil-

lages et de leur population. Ainsi, ces villages taient diffrents tant au point de

vue de la religion pratique par ses membres quau point de vue du niveau de

vie gnral. Nous mentionnons au tableau 5 les caractristiques des villages vi-

sits. A la religion pratique, nous avons adjoint une apprciation personnelle du

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niveau de pauvret du village base sur laccs leau, les matriaux de construc-

tion des maisons, la richesse du chef de village, le nombre de vhicules motoriss,...

Village Niveau de pauvret Religion

SOMSANOOK trs pauvre culte des esprits

BAN NA KHUA NOK pauvre bouddhisme

HOUAYXAI trs pauvre culte des esprits

PHONHOM ais catholique

KENGSADOK ais catholique

PAKSA pauvre bouddhisme

Tab. 5: Niveau de pauvret des diffrents villages et religion pratique dans ceux-ci.

La population de ces villages est telle que plus de 80 % des foyers observs sont

composs de 4 7 personnes. Approximativement 10% des foyers sont composs de

plus de 8 personnes. Nous avons attribu chacun des foyers un indice relatif au

niveau de vie de ceux-ci. Celui-ci tait tabli selon notre apprciation personnelle

du niveau de vie partir de diffrents critres tels que la prsence dlectricit, de

sanitaires, la possession dun frigo,... (sur une chelle croissante de 1 (niveau de

vie pauvre, faible) 10 (niveau de vie lev)). Approximativement 75% des foyersvisits possdent un indice infrieur 6, la plus grande partie des foyers (30%)

possdant un indice de valeur 3, ce qui traduit la forte pauvret de ceux-ci.

3.3.2 Corrlation entre le dnombrement en coliformes, coliformesfcaux, entrobactries et certains paramtres

Nous avons recherch des ventuelles corrlations entre certains paramtres (ni-

veau de vie et la dure de conservation du padek) et la concentration de coliformes

totaux, coliformes fcaux et entrobactries totales.

3.3.2.1 Niveau de vie

Nous avons tudi une hypothtique relation entre le niveau de vie et la concen-

tration de coliformes totaux, coliformes fcaux ou entrobactries totales. Nous

avons spar nos chantillons en 2 classes :

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les chantillons comportant une concentration de germes infrieure au seuil

limite tabli par le CNERNA.

les chantillons comportant une concentration de germes suprieure ce

seuil.

De plus, pour mettre vidence une ventuelle corrlation et faciliter les tests sta-

tistiques, les indices de niveau de vie ont t rassembls en deux catgories :

niveau de vie compris entre 2 et 4

niveau de vie compris entre 5 et 7.

Les rsultats sont prsents au tableau 6. Celui-ci illustre la rpartition des chan-

Infrieur au seuil Suprieur au seuil Total p-value

Entrobactries

niveau de vie 2 4 16 (33) 15 (31) 31 (64,5) 0,277niveau de vie 5 7 6 (13) 11 (23) 17 (35,5) 0,277

Total 22 (46) 26 (54) 48 (100)

Coliformes

niveau de vie 2 4 16 (35) 15 (33) 31 (67) 0,46niveau de vie 5 7 6 (13) 9 (19) 15 (33) 0,46

Total 22 (48) 24 (52) 46 (100)

Coliformes fcaux

niveau de vie 2 4 18 (38) 13 (28) 31 (66) 0,18niveau de vie 5 7 6 (13) 10 (21) 16 (34) 0,18

Total 24 (51) 23 (49) 47 (100)

Tab. 6: Rpartition des chantillons selons les diffrentes classes et catgories tablies. Lepourcentage est indiqu entre parenthses. Le niveau dincertitude est de 5%. La p-valueobtenue pour le test chi-carr est indique

tillons selons les diffrentes classes et catgories tablies. Le pourcentage est in-

diqu entre parenthses. Le test statistique du chi-carr a t ralis et aucune

association significative entre le taux de germes et le niveau de vie na pu tredmontre tant donn que la p-value obtenue est suprieure au seuil conven-

tionnel de 5% ( = 0, 05). Nous nobservons pas de rpartition prfrentielle des

chantillons possdant une concentration problmatique de germes dans les foyers

de niveau de vie plus faible. De la mme manire, les chantillons sains ne se

retrouvent pas majoritairement vers les foyers de classe leve.

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3.3.2.2 Dure de conservation du padek

Nous avons galement cherch une ventuelle dpendance entre le taux bact-

rien et la dure de conservation du padek. Nos chantillons ont t rpartis en 4

catgories (0-3 mois, 4-6 mois, 7-9 mois, > 9 mois).

La figure 12 illustre la rpartion, pour une dure de conservation de padek

donne, des chantillons dont le dnombrement des coliformes est infrieur (envert) et suprieur (en rouge) au critre CNERNA (seuil : < 103 germes/mL).

Fig. 12: Rpartition des chantillons de concentration de coliformes totaux suprieure (rouge)et infrieure (vert) au seuil CNERNA

Documents

Analyse Bacteriologique Des Aliments en Milieu Rural Au Laos