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Approfondissement des
connaissances en biologie
moléculaire
Master IADE – Année 2013-2014
Plan du cours
• Rappels de biologie moléculaire et de biologie cellulaire
– Les molécules du vivant
– Le support de l’information génétique et son décodage
– L’organisation de la cellule animale
• Les outils et les approches expérimentales utilisées par les chercheurs
• Les mécanismes qui permettent aux cellules de communiquer entre elles
– Les récepteurs membranaires : les exemples du récepteur ß2-adrénergique et du récepteur de la leptine
– Les récepteurs nucléaires: l’exemple du récepteur des glucocorticoïdes
Rappel sur le support de l’information
génétique et son décodage (1)
• Le code génétique établit une
correspondance entre un
triplet de nucléotides, appelé
codon, et un acide aminé qui
est incorporé dans la protéine.
Il se résume à un tableau
associant chacun des 64
codons possibles avec un des
20 acides aminés présents
dans les protéines
• La transmission de
l’information de l’ADN à la
protéine s’effectue par
l’intermédiaire d’un ARN
messager
• Transcription
– Processus permettant la synthèse d’un
ARN messager à partir de l'ADN
– S’effectue dans le noyau cellulaire
• Traduction
– Processus permettant la synthèse de protéine à partir d’une ARN messager
– S’effectue dans le noyau cellulaire
– Fait intervenir des ribosomes qui assemblent les protéines en réalisant la
lecture séquentielle des codons sur l'ARN messager
– Fait intervenir des ARN de transfert qui jouent le rôle d’adaptateurs en
interagissant (1) avec le codon auquel ils s'apparient via un triplet de
nucléotides complémentaires, l'anticodon, et (2) l'acide aminé
correspondant attaché par une liaison ester à leur extrémité 3'-hydroxyle.
Rappel sur le support de l’information
génétique et son décodage (2)
Rappel sur le support de l’information
génétique et son décodage (3)
L’organisation de la cellule
eucaryote
Le noyau cellulaire
ADN et protéines associées
(chromatine)
Nucléole
Centrosome
Microtubules
Lamina nucléaire
Réticulum
endoplasmique
Filaments
intermédiaires
Pore nucléaire
Membrane nucléaire
Hétérochromatine
euchromatine
La chromatine
hétérochromatine
euchromatine
• Forme sous laquelle se présente l'ADN
dans le noyau
• Constituée d’ADN, d'ARN et de
protéines (histones et protéines non-
histones)
• Peut se présenter sous deux formes
– L’euchromatine : structure décondensée
permettant l'expression génique
– L'hétérochromatine: Structure
condensée qui est consistué d’ADN non
transcrits
Le nucléosome
• Complexe d’ADN et de
protéines qui constitue l’unité
de base de la chromatine
• La particule de cœur du
nucléosome est formée d’un
cœur protéique de huit
protéines histones (deux
exemplaires de chacune des
histones H2A, H2B, H3 et H4)
autour duquel s’enroulent
environ 146 paires de bases
d’ADN sur un tour trois quarts
• Le nucléosome forme un
cylindre de 11 nm de diamètre
sur 5,5 nm de haut et un poids
moléculaire de 205 kDa
Les autres protéines qui se lient à l’ADN
L’enchaînement des nucléosomes forme un nucléo-filament, aussi appelé fibre de chromatine de 11 nm ou « collier de perles ».
L’empilement des nucléosomes
adjacents
Deuxième niveau de compaction de l’ADN
dense
(chromosome métaphasique)
relâché
(chromosome inter-
phasique)
ADN
nucléosomes
armature
La condensation de la chromatine
boucles
Enveloppe nucléaire
• Double bicouche lipidique séparant le nucléoplasme et le cytoplasme
– Bicouche externe en continuité avec les membranes du réticulum
endoplasmique
– Bicouche interne tapissée à l'intérieur du nucléoplasme par la lamina
• Se désagrège au moment de la mitose
• Percée de trous de 120 nm de diamètre appelées pores nucléaires qui
permettent les échanges entre le cytoplasme et le nucléoplasme
– Diffusion passive pour les les ARN messagers et les protéines de moins
de 30 kDa
– Diffusion active pour les protéines de poids moléculaire > 30 kDa
L’enveloppe nucléaire et ses pores
Le nucléole
• Sous-compartiment cellulaire du
noyau et est le lieu où se produit
la transcription des ARN
ribosomiques (ARNr), qui
constituent avec des protéines,
les deux sous-unités des
ribosomes.
Le rôle du nucléole dans la production des
ribosomes
noyau nucléole
cytoplasme
protéines
ribosomales
fabriquées
dans le
cytoplasme
Le système endo-membranaire
Le réticulum endoplasmique
Réticulum endoplasmique lisse
Réticulum endoplasmique rugueux
Ribosomes
Noyau
Enveloppe nucléaire
Réticulum endoplasmique
• Sous-compartiment composé d'une membrane et d'une lumière
• En continuité avec l'enveloppe nucléaire et en relation avec les autres
compartiments, notamment les vésicules de l'appareil de Golgi
• Existe sous deux formes: le réticulum endoplasmique rugueux (RER), ou
granuleux (REG),et le réticulum endoplasmique lisse (REL)
• le réticulum endoplasmique rugueux est couvert de ribosomes. Sa
principale fonction est d’assembler et de transporter les protéines
destinées à s’associer aux membranes ou à être sécrétées
• le réticulum endoplasmique lisse n’est pas associé à des ribosomes. IL
participe à la synthèse des lipides (phospholipides membranaires, acides
gras, stéroïdes...) et joue un rôle dans la glycosylation des protéines, la
détoxification des cellules et le stockage du calcium
Les rôles du réticulum endoplasmique
• Réticulum endoplasmique granuleux
– Synthèse de protéines membranaires ou destinées à être
sécrétées
• Réticulum endoplasmique lisse
– Modification post-traductionnelle des protéines : N-
glycosylation des protéines, repliement,...
– Synthèse des phospholipides membranaires
– Détoxification des substances liposolubles
– Stockage des ions calcium
Le rôle du réticulum endoplasmique dans la
synthèse des protéines destinées à s’associer
aux membranes ou à être sécrétées
Le rôle du système endo-membranaire
dans la synthèse protéique
Réticulum
Endoplasmique
pulse : 1 min
[3H]-leucinechasse : 3 min chasse : 20 min chasse : 90 min
Appareil de GolgiVésicules de
Sécrétion
La membrane plasmique
La membrane plasmique
• Délimite la cellule et sépare le cytoplasme du milieu extérieur
• Constituée d’une bicouche de lipides, essentiellement des phospholipides et
du cholestérol
• Associée à des protéines
– Transmembranaires : insérées dans la double couche phospholipidique
– Intracellulaires ou extracellulaires, ancrées par des lipides ou associées à
des protéines transmembranaires
• Fonctions principales
– Protection du fait de son association avec le glycocalyx
– Echanges entre les milieux intracellulaire et extracellulaire : canaux
ioniques, transporteurs,…
– Signalisation cellulaire : récepteurs des cytokines, des facteurs de
croissance, des hormones…
Les différents types de protéines
membranaires
Protéines
ancrées
par des
lipides
Protéines
associées à
des protéines
membranaires
Protéines
transmembranaires
Le glycocalyx
• Composé d'une couche de polyholosides liée de manière covalente aux
lipides et aux protéines de la membrane
• Présent dans tous les types cellulaires
• Très hydrophile et d’épaisseur variable pouvant atteindre 0,5 µm
Les radaux lipidiques
• Microdomaines de la membrane plasmique, riches en cholestérol et en
sphingolipides mais pauvres en DHA (Acide Docosa Hexaénoïque)
• Structures rigides constituant des zones privilégiées pour l'activité de certaines
protéines qui y sont intégrées
• Epaisseur de 70 nm environ
Les caractéristiques et le rôle de la
mitochondrie
• Organite de 1-2 à 10 μm de long et de 0,
5 à 1 μm de diamètre composé d’une
membrane externe, d’une membrane
interne et contenant un génome
mitochondrial
• Centrale énergétique de la cellule: c'est
dans la mitochondrie que se déroulent
les dernières étapes du cycle respiratoire
qui convertit l'énergie des molécules
organiques issues de la digestion
(glucose) en énergie
• Participent à la mort cellulaire (apoptose)
• Concentration et stockage des ions
calcium, sodium et potassium
Les outils et approches
expérimentales utilisées par les
chercheurs
Master IADE – Année 2012-2013
Les outils et les approches
expérimentales
• Les méthodes de purification et d’analyse des
molécules présentes dans les cellules
• Les cultures bactériennes
• Clonage et manipulation de l’ADN dans des bactéries
• Les cultures de cellules eucaryotes
• Les techniques de biologie cellulaire
• Souris transgéniques et souris porteuses de
mutations génétiques ciblées
Les méthodes de purification et d’analyse des
molécules présentes dans les cellules (1)
• Lyse de cellules en absence ou en présence de
détergents
• Selon les cas :
– Purification des organelles, des membranes et du cytosol par
centrifugation
– Fractionnement par chromatographie d’exclusion,
chromatographie sur couche mince ou chromatographie en
phase gazeuse
– Purification des acides nucléiques par extraction
phénol/chloroforme et précipitation en présence d’éthanol
• Séparation et visualisation des protéines par
électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide
• Séparation et visualisation de fragments d’ADN par
électrophorèse à travers un gel d’agarose
• Détermination de la séquence nucléotidique d’un
gène
• Détermination de la séquence d’acides aminés d’une
protéine
Les méthodes de purification et d’analyse des
molécules présentes dans les cellules (2)
Centrifugation
Chromatographie d’exclusion
Séparation de protéines par
électrophorèse
Séparation de fragments d’ADN par
électrophorèse
Les cultures bactériennes
Les plasmides bactériens
• Molécule d'ADN surnuméraire et
circulaire distincte de l'ADN
chromosomique
• Capable de réplication autonome et
non essentielle à la survie de cellule
• Peuvent contenir des gènes qui
permettent à une bactérie d’être
résistante à une antibiotique
• Peuvent être modifiés par des
techniques de recombinaison
génétique in vitro et réintroduits dans
des bactéries par transfection
Le clonage
d’un gène
dans un
plasmide
Les principales enzymes utilisées pour
modifier des plasmides
• Enzyme des restriction : protéine qui peut couper un
fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides
caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de
restriction reconnaît ainsi un site spécifique. Il en existe
plusieurs centaines qui reconnaissent chacune une séquence
différente
• ADN ligase : qui répare les brins brisés d'ADN et qui peut
former des liaisons phospho-diester covalentes et lier ou
connecter des brins d'ADN
Exemples d’enzyme de restriction
Exemple de ligation
