76 XXIII e réunion du CEDED C10 CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE DU RÉCEPTEUR PÉRIPHÉRIQUE DES BENZODIAZÉPINES DANS LES CEL- LULES COLIQUES HT29 MA Ostuni, G Péranzi, R Ducroc, V Papadopoulos, JJ Lacapère Unité INSERM U410, Neuroendocrinologie et Biologie Cel- lulaire Digestives, Department of Biochemistry and Mole- cular Biology, Georgetown University School of Medicine. Le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) est une protéine abondante dans les épithéliums, localisée dans la membrane externe des mitochondries. Il représente un site de liaison des benzodiazépines différent du classique récepteur GABA. Il a été décrit que cette protéine faisait partie d’un complexe multimérique mitochondrial composé du PBR de 18 kDa, et d’un canal anionique voltage dépendent (VDAC) de 34 kDa. Le PBR est impliqué dans plusieurs fonctions comme le transport de porphyrines ou de cholestérol, l’apoptose ou la régulation de certains mouvements ioniques. Cette protéine est sur-exprimée dans différents types de cancer comme les cancers colo-rectaux. Au cours des réunions précédentes du CECED nous avons montré que le PBR est exprimé tout au long du tractus gastro-intestinal du rat et que l’activation du PBR sous l’action de ses ligands induit l’activation de canaux chlore dépendant du calcium. Dans le présent travail nous avons étudié (i) la localisation sub-cellulaire du PBR dans les lignées coliques HT29 et HT29Cl.19A et (ii) l’action du ligand spécifique du PBR (PK 11195). La caractérisation immunohistochimique a révélé la présence du PBR dans les deux types cellulaires étudiés. La localisation sub-cellulaire du PBR est majoritairement mitochondriale comme le montrent les études de co-localisation en microscopie confocale utilisant à la fois un anticorp anti-PBR et une sonde mitochondriale. Les mesures de liaison de ligands radioactifs du PBR montrent que les fractions enri- chies en membranes mitochondriales présentent une stœchio- métrie de liaison deux à trois fois supérieure à celles des membranes totales. Les constantes pharmacologiques calcu- lées selon la méthode de Scatchard sont : Bmax 10 ± 1 et 13 ± 1.5 pmol/mg et Kd 12 ± 1.5 et 10 ± 1.5 nM respective- ment pour les cellules HT29 et HT29Cl.19A. Utilisant le Fluo3-AM comme fluorochrome sensible au calcium, nous avons observé que le PK 11195 induit une augmentation du calcium intracellulaire de façon indépendante du calcium extracellulaire suggérant la seule implication des réservoirs intracellulaires comme source du cation. Cette action est com- plètement inhibé par la cyclosporine A, un inhibiteur du pore de transition mitochondrial. Des études fonctionnelles sur HT29.Cl19A cultivées sur filtre et montées en chambre d’Ussing montrent que des concentrations nanomolaires de PK 11195 induisent une sécrétion de chlore couplée à celle de potassium. Ces sécrétions dépendent du calcium intracellulaire puisqu’elles sont fortement inhibées par le BAPTA-AM, un chélateur de calcium. Ces différents travaux ont permis de montrer que le PBR est largement exprimé dans ces lignées coliques. Ils constituent la première démonstration directe de l’effet du PK 11195 sur le calcium cytosolique à partir des « stocks » mitochondriaux. La stimulation par le PK 11195 des sécrétions Ca 2+ -dépen- dants de Cl - et de K + suggère l’implication du PBR dans le contrôle du volume cellulaire, un processus clé régulant la mort cellulaire par apoptose. Mots-clés : mitochondrie, calcium intracellulaire, signalisa- tion, courant ionique, lignées coliques.

C10 - Caractérisation fonctionnelle du récepteur périphérique des benzodiazépines dans les cellules coliques HT29

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XXIIIe réunion du CEDED

C10CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE DU RÉCEPTEURPÉRIPHÉRIQUE DES BENZODIAZÉPINES DANS LES CEL-LULES COLIQUES HT29

MA Ostuni, G Péranzi, R Ducroc, V Papadopoulos,JJ LacapèreUnité INSERM U410, Neuroendocrinologie et Biologie Cel-lulaire Digestives, Department of Biochemistry and Mole-cular Biology, Georgetown University School of Medicine.

Le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) est uneprotéine abondante dans les épithéliums, localisée dans lamembrane externe des mitochondries. Il représente un site deliaison des benzodiazépines différent du classique récepteurGABA. Il a été décrit que cette protéine faisait partie d’uncomplexe multimérique mitochondrial composé du PBR de 18kDa, et d’un canal anionique voltage dépendent (VDAC) de34 kDa. Le PBR est impliqué dans plusieurs fonctions commele transport de porphyrines ou de cholestérol, l’apoptose ou larégulation de certains mouvements ioniques. Cette protéineest sur-exprimée dans différents types de cancer comme lescancers colo-rectaux. Au cours des réunions précédentes duCECED nous avons montré que le PBR est exprimé tout aulong du tractus gastro-intestinal du rat et que l’activation duPBR sous l’action de ses ligands induit l’activation de canauxchlore dépendant du calcium.Dans le présent travail nous avons étudié (i) la localisationsub-cellulaire du PBR dans les lignées coliques HT29 etHT29Cl.19A et (ii) l’action du ligand spécifique du PBR (PK11195). La caractérisation immunohistochimique a révélé laprésence du PBR dans les deux types cellulaires étudiés. Lalocalisation sub-cellulaire du PBR est majoritairement mito-chondriale comme le montrent les études de co-localisation enmicroscopie confocale utilisant à la fois un anticorp anti-PBRet une sonde mitochondriale. Les mesures de liaison deligands radioactifs du PBR montrent que les fractions enri-chies en membranes mitochondriales présentent une stœchio-métrie de liaison deux à trois fois supérieure à celles desmembranes totales. Les constantes pharmacologiques calcu-lées selon la méthode de Scatchard sont : Bmax 10 ± 1 et13 ± 1.5 pmol/mg et Kd 12 ± 1.5 et 10 ± 1.5 nM respective-ment pour les cellules HT29 et HT29Cl.19A. Utilisant leFluo3-AM comme fluorochrome sensible au calcium, nousavons observé que le PK 11195 induit une augmentation ducalcium intracellulaire de façon indépendante du calciumextracellulaire suggérant la seule implication des réservoirsintracellulaires comme source du cation. Cette action est com-plètement inhibé par la cyclosporine A, un inhibiteur du porede transition mitochondrial. Des études fonctionnelles surHT29.Cl19A cultivées sur filtre et montées en chambred’Ussing montrent que des concentrations nanomolaires dePK 11195 induisent une sécrétion de chlore couplée à celle depotassium. Ces sécrétions dépendent du calcium intracellu-laire puisqu’elles sont fortement inhibées par le BAPTA-AM,un chélateur de calcium.Ces différents travaux ont permis de montrer que le PBR estlargement exprimé dans ces lignées coliques. Ils constituent lapremière démonstration directe de l’effet du PK 11195 sur lecalcium cytosolique à partir des « stocks » mitochondriaux.La stimulation par le PK 11195 des sécrétions Ca2+-dépen-dants de Cl- et de K+ suggère l’implication du PBR dans lecontrôle du volume cellulaire, un processus clé régulant lamort cellulaire par apoptose.

Mots-clés : mitochondrie, calcium intracellulaire, signalisa-tion, courant ionique, lignées coliques.