Cancer du sein || Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein. Facteurs pronostiques, facteurs prédictifs. Quels standards en 2005 ?

« Toute chose simple est théoriquement fausse,toute chose compliquée est pratiquement inutilisable. »

Paul Valéry

Le développement des biomarqueurs tissulaires représente le type même de larecherche biologique de transfert. Le but de cette revue est non d’être exhaustive,mais de présenter les buts, la démarche actuellement recommandée pour l’évalua-tion et la validation des marqueurs biologiques tissulaires et de faire un bilan pourles cancers du sein en 2005.

Ces trente dernières années, une étape a été franchie par le développement surle plan national et international d’une standardisation de l’approche thérapeutiquedes cancers permettant une évaluation de l’efficacité des protocoles thérapeutiques.Mais, malgré une augmentation régulière du nombre de protocoles thérapeutiqueset du coût global des traitements liés notamment au développement de la chimio-thérapie, le bénéfice en terme de survie n’est pas à la hauteur de nos espérances(1, 2). Ces succès limités de l’approche clinique actuelle dans les cancers s’expli-quent, d’une part, par le fait que les seuls critères anatomo-cliniques classiques stan-dards actuels des protocoles et essais thérapeutiques ne rendent pas assez compte del’importante hétérogénéité évolutive des tumeurs et sont de très faibles indicateurspotentiels de la sensibilité thérapeutique, et, d’autre part, par le manque de molé-cules ciblées et adaptées au processus fonctionnel individuel de chaque tumeur. Cesconstatations ont transformé en 1998 en challenge pour les directeurs du NIH/NCIl’hypothèse issue de la recherche fondamentale (3, 4), et émise en 1978 par W. L.McGuire : la notion de marqueur tumoral doit évoluer vers la définition d’une ana-lyse tissulaire multiparamétrique permettant l’établissement, l’évaluation et valida-tion d’une classification moléculaire des tumeurs humaines. Les récepteurs hor-monaux dans les cancers du sein en étaient la première démonstration. Cette clas-sification serait indispensable pour progresser vers des traitements ciblés et efficaces

Biomarqueurs tissulaires tumoraux.Cancer du sein. Facteurs pronostiques,facteurs prédictifs. Quels standardsen 2005 ?

P.-M. Martin

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(5). L’évolution des connaissances en biologie du cancer, ainsi que les progrès tech-nologiques réalisés à ce jour, permettent d’envisager une meilleure définition molé-culaire et fonctionnelle des tumeurs solides, aboutissant au concept de classificationmoléculaire des tumeurs humaines et au développement de thérapeutiques inno-vantes mieux adaptées à la spécificité de chaque tumeur.

Une classification moléculaire des tumeurs associée aux données cliniques etanatomo-pathologiques devrait contribuer, dès le diagnostic, à l’évaluation dupotentiel métastatique du cancer, isolant les patients à haut risque évolutif, échap-pant de ce fait à un contrôle thérapeutique loco-régional, et contribuant, en outre,à la mise en évidence dans le tissu tumoral de marqueurs associés à l’existenced’une sensibilité ou résistance aux molécules pharmacologiques anticancéreuses.Ce double but doit permettre la sélection des patients selon leur risque évolutif etleur sensibilité potentielle aux drogues, évitant les inconvénients des surtraite-ments et les effets iatrogènes qui peuvent en découler, orientant précocement versl’innovation thérapeutique les patients à haut risque évolutif peu ou non sensiblesaux traitements conventionnels. Enfin, cette démarche vers une classification molé-culaire des tumeurs doit renforcer la notion de standardisation des protocoles enconsidérant de manière objective des groupes homogènes sur le plan biologiquepour l’évaluation de l’efficacité des molécules thérapeutiques. L’étape ultérieure dudéveloppement de ce concept analytique moléculaire concerne l’identificationpotentielle du haut risque individuel constitutif afin d’exercer une politique de pré-vention.

Définition d’un biomarqueur tumoralUn biomarqueur tumoral est une molécule ou une fonction cellulaire caractéris-tique d’un cancer (ou d’une personne à haut risque de cancer) par rapport à sacontre-partie normale (en termes de tissus ou de population). Un marqueur peutêtre également une molécule associée à une fonction cellulaire qui caractérise lepotentiel évolutif particulier d’un processus tumoral (invasivité, néo-angiogenèse,résistance aux thérapeutiques…).

Durant les vingt dernières années, les progrès des connaissances fondamentaleset les progrès technologiques ont permis l’identification d’un très grand nombre demarqueurs tumoraux putatifs.

En dépit de ces avancées apparentes, dans les tumeurs solides, peu de marqueurstumoraux ont été promus et recommandés dans une utilisation clinique courantefaute de stratégie d’évaluation cohérente.Pour les marqueurs tumoraux, les termes « facteur pronostique » ou « facteur pré-dictif » sont utilisés dans différents contextes. Spécifiques de la pathologie et dutissu investigués (par exemple marqueur mesuré dans le tissu tumoral, cellulestumorales, sérum, fluides pathologiques...). Ces facteurs ont différents potentiels(ou champs) d’utilisation en clinique parfaitement décrits par G.-S. Ginsburg etJ.-J. McCarthy (6) (figure1).Les biomarqueurs tumoraux pronostiques sont évalués chez des patients ne rece-vant aucune thérapie ou des protocoles standards. Ces biomarqueurs pronostiques

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Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 85

peuvent être utilisés pour estimer le potentiel évolutif d’un processus tumoral spé-cifique et sélectionner les patients à haut risque évolutif susceptibles d’êtreorientés vers des protocoles thérapeutiques adjuvants.Les biomarqueurs tumoraux prédictifs d’une réponse ou non à une thérapiedonnée requièrent pour leur évaluation deux groupes de patients, de préférencerandomisés, pour un protocole thérapeutique spécifique par opposition, soit à l’ab-sence de toute thérapie, soit à un protocole standard type. La valeur prédictive desbiomarqueurs est obtenue par l’analyse de tests statistiques évaluant l’interactionentre le traitement et le statut des biomarqueurs (figure 2).

Figure 1 - De la définition d’une prédisposition, du dépistage au monitorage des protocoles

thérapeutiques.

Figure 2 - Définition des biomarqueurs pronostiques/prédictifs/mixtes. Classification baséesur l’évaluation de l’évolution pronostique des populations de patients classés en fonction dela présence (Fact+) ou de l’absence (Fact-) du biomarqueur dans leur tissu tumoral.Evolution spontanée (A) ou avec un traitement adjuvant ou complémentaire (B).A : évaluation pour une population sans traitement associé.B : évaluation pour une population avec traitement associé.


Les critères finaux d’évaluation clinique des marqueurs pronostiques ou pré-dictifs peuvent être divers, tels que : la survie globale, la survie spécifique associée àla pathologie, l’intervalle libre de toute évolution pathologique, le temps à progres-sion. L’évaluation de la réponse tumorale à une thérapie donnée pouvant être lamodification du volume tumoral ou même la modulation d’un biomarqueur étroi-tement liée au volume tumoral. L’efficacité d’un protocole thérapeutique peut êtreexprimée en terme de bénéfice absolu ou relatif. Le bénéfice relatif en termes desurvie est souvent exprimé comme un risque relatif (à savoir le risque de décès dansle groupe expertisé divisé par le risque de décès dans le groupe central), ou un« odds ratio » relatif (odds de survie versus de décès dans le groupe expertisé divisépar l’odds de survie versus décès dans le groupe contrôlé. La probabilité ou « hasardratio » obtenu dans les modèles statistiques de régression multiple est souvent uti-lisé pour estimer le risque relatif.

Les tests statistiques d’évaluation quantitatives et qualitatives des biomar-queurs font appel aux tests statistiques standards habituellement utilisés dans lesévaluations cliniques et biologiques. Mais peu à peu s’est établie une nécessité d’uneévaluation multifactorielle pour ne retenir que les facteurs et marqueurs biolo-giques individuellement informatifs, éliminant de ce fait des marqueurs redon-dants, pour répondre à une question clinique donnée telle la sélection des patientsà haut risque ou potentiellement sensibles à une thérapeutique spécifique. La tech-nique la plus généralement adaptée est dérivée d’un modèle d’évaluation de risquesdéveloppé pour les assurances : le modèle de Cox. Si ce modèle est actuellement unstandard, il demande une définition exacte des variables étudiées et ne prend pas encompte la variation de certains paramètres biologiques ou cliniques dans le temps,entre autres au cours de l’évolution du processus tumoral (4 et l’ensemble de larevue Breast Cancer Research and Treatment 1992 (22) : 187-293). Des modèlesplus complexes non acceptés comme standards sont utilisés par certaines équipes.Les approches analytiques multiparamétriques font appel également à des tech-niques de classification descriptives ou de hiérarchisation pour définir les relationspossibles entre facteurs, ou pour définir des clusters ou ensembles regroupant desindividus proches, si ce n’est pas identiques. Des pathologies tumorales, qui présen-tent un même profil biologique ou évolutif, se retrouvent ainsi isolées par des tech-niques analytiques telles les analyses en composantes principales ou analyse facto-rielle discriminante.

Bases objectives de jugement pour l’évaluation et la pertinencedes biomarqueurs tumorauxEn 1996, devant l’abondance, la dispersion et l’inhomogénéité des travaux et publi-cations évaluant des marqueurs tumoraux potentiels, l’American Society of ClinicalOncology a réuni un panel d’experts dans le but de poser des bases objectives dejugement pour l’évaluation et la pertinence des biomarqueurs tumoraux (7-10).

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Ce groupe d’experts, dans le cadre de l’ASCO, a émis un certain nombre deremarques et recommandations. Ils attirent l’attention sur le fait que les basesméthodologiques pour définir des études correctement évaluables sont communesà toutes les phases de la pratique clinique. Si ces bases sont actuellement bienadmises pour l’évaluation des protocoles thérapeutiques et répondent à des règlesprécises pour le développement d’une molécule thérapeutique, phase 1, phases 2, 3,4, critère de réponse, toxicité, etc., ces mêmes bases méthodologiques sont enrevanche mal connues ou peu utilisées dans le cadre de l’évaluation des biomar-queurs tumoraux.

Les experts rappellent dans ce cadre que :– les études d’évaluation, comme pour les études cliniques protocolaires, doivent

être basées sur des hypothèses clairement établies, répondre et prendre en compteune définition exacte des populations étudiées, des différentes sous-populations,des analyses, des techniques de dosage, avec mise en évidence de techniques ana-lytiques répondant aux critères d’assurance de qualité et contrôle de qualité ;

– les études doivent clairement identifier les problèmes éthiques et légaux associés àl’accès aux échantillons tissulaires individuels, aux informations du dossiermédical des patients pour lesquels l’expertise tissulaire est effectuée et permettreune évaluation claire du ratio coût-bénéfice, coût-efficacité.

Le travail du groupe d’experts a débouché sur la proposition d’un système d’évalua-tion des biomarqueurs « Tumor Marker Utility Grading System » (TMUGS), quirepose sur :– des recommandations pour la conduite des phases d’évaluation ;– les deux principes de base suivants : le concept d’utilité et le degré d’évidence.

Recommandations pour la conduite des phases d’évaluation d’un para-mètre biologique

Ceci peut se décomposer en quatre phases :– phase 1 : issue d’une hypothèse ou évidence biologique, une cible moléculaire est

définie, une méthode analytique adaptée à la caractérisation et à la mesure de cettecible dans les tissus pathologiques permettant une étude de faisabilité ;

– phase 2 : au sein d’un laboratoire maîtrisant la technique analytique, une étudepilote est conduite sur un échantillonnage clinique précis. Le rôle du laboratoireexpert est de faire évaluer la standardisation de la méthode analytique et la miseen route de contrôle de qualité pour que cette méthode analytique soit accessibleà un réseau de laboratoires, enfin d’établir une étude multifactorielle qui posi-tionne le nouveau biomarqueur par rapport aux facteurs classiques ou déjà éva-lués, montrant les corrélations possibles et la valeur indépendante de ce facteur ;

– phase 3 : cette phase utilise les outils mis au point en phase 2. Un réseau de labo-ratoires associé aux groupes cliniques ayant constitué des banques tissulairesconduit plusieurs études rétrospectives permettant une méta-analyse sur l’utilitéclinique du ou des facteurs prédictifs ou pronostiques ;

Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 87Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 87

– phase 4 : mise en route et analyse d’un essai clinique prospectif dédié, déterminantla valeur pronostique et la valeur prédictive des biomarqueurs tumoraux dans uncontexte d’utilisation prospective.

Le concept d’utilité

Le concept d’utilité définit la puissance relative des biomarqueurs pronostiques etdébouche sur une échelle d’utilité clinique.

Facteurs pronostiques (figure 3)

Figure 3 - Le concept d’utilité pour les facteurs pronostiques.

Concept d’utilité basé sur la différence du risque évolutif ∆RR entre deux populations depatientes ayant la présence ou non dans leur tumeur primitive du biomarqueur pronostique.L’évaluation pour chaque population du risque propre RRr (1 et 2) par rapport à une popu-lation référente permet de calculer secondairement le ∆RR, RR1-RR2.

Il repose plus sur la différence de risque relatif ∆RR, comme nous l’avons précisé,que sur la signification statistique, la « p-value » dépendant, entre autres, de la taillede l’échantillon.


Dans le cadre de toute pathologie tumorale pour évaluer le concept d’utilité desnouveaux paramètres pronostiques, les patients peuvent être divisés à partir des fac-teurs cliniques et anatomiques classiques en trois classes d’évaluation pronostique,en l’absence de toute thérapeutique systémique adjuvante.

Par exemple, dans le cancer du sein :- classe de très bon pronostic avec moins de 10 % de décès à dix ans ;- classe de pronostic intermédiaire avec entre 10 et 50 % de décès à dix ans ;- classe de très mauvais pronostic avec plus de 50 % de décès à dix ans.

La relative puissance d’un biomarqueur pronostique peut être définie commesa capacité à reclasser les patients définis sur des critères anatomo-pathologiquesstandards (figure 4).

Figure 4 - Définition de la puissance relative des facteurs pronostiques. A : % de survie à dixans en l’absence de toute thérapeutique.

Exemple : un facteur pronostique puissant est celui qui sépare par sa présence ou non deuxpopulations de patientes à pronostic excellent et à pronostic le plus péjoratif.

Les classes d’évolution clinique (pronostic excellent, pronostic moyen, pronosticpéjoratif) découlent des études anatomo-cliniques historiques.

La puissance d’un biomarqueur s’évalue à l’importance de déplacement du pro-nostic prévu à partir des seuls éléments anatomo-cliniques :- un facteur pronostique puissant déplace les patients à travers les trois classes stan-

dards d’un très bon pronostic ou pronostic le plus péjoratif (ou inversement) ;- un facteur pronostique moyen déplace les patients entre deux classes classiques

contiguës : de très bon à moyen ou de moyen à très péjoratif ;- enfin, un facteur pronostique faible déplace les patients au sein d’une même classe

standard ne modifiant pas le stade pronostique pré-établi.


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Facteurs prédictifs (figure 5)

Il prend en compte la valeur prédictive (VPR) qui différencie le risque relatif (RR)dans un groupe homogène de patients sans ou avec traitement spécifique, lesgroupes homogènes étant isolés sur la présence ou l’absence du facteur prédictifévalué. La puissance du concept d’utilité clinique du facteur prédictif est établieentre une très forte VPR > 4 et une faible VPR entre 1 et 2.

Le concept d’utilité des facteurs pronostiques et prédictifs débouche sur uneéchelle d’utilité clinique, échelle évoluant pour les facteurs présentant une utilitépotentielle de + à +++.

Figure 5 - Le concept d’utilité pour les facteurs prédictifs.Deux populations de patientes sont caractérisées par la présence (m+) ou l’absence (m-) d’unmarqueur prédictif dans leurs tumeurs primitives.La différence d’évolution ∆RR d’une même population avec ou sans traitement ∆RR m+,∆RR m- permet de calculer le coefficient d’utilité de marqueur prédictif VPR.

+ Le biomarqueur a une signification biologique dans le processus tumoral, maisne peut être utilisé dans une décision clinique pour trois raisons :- le biomarqueur proposé est corrélé à un marqueur dont le test est déjà établi et

l’avantage du nouveau biomarqueur n’est pas démontré ;- le biomarqueur apporte une information indépendante, mais n’apporte pas la

preuve d’une utilité quelconque pour une décision clinique ;- les résultats préliminaires sont encourageants, mais ne sont pas informatifs

concernant le niveau d’évidence d’utilité clinique.

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++ Le biomarqueur apporte une information indépendante et nouvelle, utile dansla décision clinique, mais, s’il ne peut être utilisé isolément, il peut et doit être prisen considération dans des conditions spécifiques.

+++ Le biomarqueur peut être utilisé comme un critère spécifique dans la décisionclinique et doit être introduit comme standard dans la pratique clinique.

Le concept de niveau d’évidence

Le degré d’évidence (Level Of Evidence, LOE) découle d’une analyse des différentesexpertises disponibles pour un marqueur donné et, de ce fait, doit être réévaluérégulièrement (6-9).

À terme, la conduite d’expertises selon les phases décrites permet l’évaluationdu niveau d’évidence d’utilité clinique des biomarqueurs tumoraux (cf. D. F.Hayes) (Level Of Evidence = LOE) (figure 6).

Figure 6 - Déroulement d’une expertise des biomarqueurs prédictifs ou pronostiques.

Niveau III / LOE III – niveau le plus bas d’évidence : confirmation d’une hypo-thèse biologique par une large étude rétrospective. Les propositions thérapeutiqueset le suivi des patients peuvent être ou non déterminés de façon prospective. Maisl’analyse statistique d’évaluation des marqueurs qui se fait de façon rétrospective nerépond pas à des critères pris en compte de façon prospective lors du descriptif duou des protocoles thérapeutiques (objectif principal ou secondaire de l’étude).


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Niveau II / LOE II : utilisation d’une technique analytique répondant au critèred’assurance qualité et contrôle de qualité. Analyse de protocoles cliniques prospec-tifs où l’étude du marqueur est un objectif secondaire tant sur le plan du descriptifdu protocole que de l’étude statistique.

Niveau I / LOE I – niveau le plus élevé d’évidence : l’évaluation de l’activité cli-nique du biomarqueur tumoral fait l’objet d’une importante méta-analyse positiveou compilation positive et concordante des études de niveaux II et III. Validationpar un protocole clinique prospectif « ad hoc » ou l’évaluation du biomarqueurtumoral est l’objectif principal de l’étude dans son descriptif et analyse statistique.Protocole incluant des groupes homogènes de patients sur les plans cliniques et thé-rapeutiques, ou, de façon idéale, un protocole clinique prospectif idéal pour l’éva-luation des biomarqueurs. Protocole prospectif randomisé dans lequel le diagnosticet les décisions cliniques thérapeutiques sont déterminés dans un bras en partantsur les bases des résultats d’analyse des biomarqueurs. Dans le bras contrôle, le dia-gnostic et les décisions thérapeutiques sont, en revanche, indépendants des résultatsde l’analyse des biomarqueurs.

L’enjeu pour le développement d’un panel de biomarqueurs est clairementdémontré par l’analyse de l’ensemble des conférences de consensus sur la prise en chargedes cancers du sein, notamment sans envahissement ganglionnaire (No) (11-15).

Une classification idéale reflèterait parfaitement les données épidémiologiqueset cliniques qui montrent que seuls 30 % des cancers No évoluent à dix ans, néces-sitant de ce fait un traitement systémique adjuvant. La conférence de consensus deSaint-Gallen (14-15), établie uniquement sur des critères cliniques et anatomiques,préjuge des indications justifiées de traitement systémique pour 90 % des patientesNo entraînant, de ce fait, un sur-traitement et l’exposition à des effets iatrogènes liésà celui-ci (figure 7). Il en est de même pour les autres conférences de consensus éta-blies à ce jour.

Figure 7 - Reconnaissance et isolement des populations de patientes présentant un cancer dusein No classé en maladie locale ou maladie systémique selon une classification idéale enaccord parfait avec l’évolution clinique (A) et selon les critères de la Conférence de consensusde Saint-Gallen (B).

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Bilan 2005 des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs dansles cancers du sein Dans les cancers du sein, durant ces vingt dernières années, un très grand nombrede biomarqueurs tumoraux tissulaires ont été étudiés par des techniques biochi-miques, ELISA ou immuno-histochimiques (tableau 1) (16-18).

Cependant, un très petit nombre de ceux-ci ont été retenus dans les recomman-dations (figure 8) (10, 18, 19).

Parmi les marqueurs évalués comme ayant un niveau d’évidence I, les récepteurshormonaux RO_ et RP, ainsi que HER2, se retrouvent plutôt comme facteurs pré-dictifs. Les biomarqueurs pronostiques de niveau LOE I+++ sont UPA et PAI1, quin’avaient pas été pris en compte dans l’analyse du panel d’experts de l’ASCO (2000,update). Ce, entre autres, du fait d’une série importante de publications entre 2000-2003 (figure 8).

Niveau Paramètres Pronostiques Prédictifsd’évidence (échelle d’utilité) (échelle d’utilité)

I ROα/RP +++ +++ Tt endocriniens (AE)HER 2 +/- +++ Herceptin®

UPA + PAI I +++ ? AE/Chimiothérapie

II Prolifération ++ ++(Phase S)

TK ++ +++ Antimétabolites+ Anthracyclines

III transcriptome + ?Mutations P53 - ++ Anthracyclines

MdR (induction) ++ + TaxaneTS + ++ Antimétabolites

Topo II ? + AntracyclinesCyclin D1 + -

Angiogenèse ? ?ROβ ? ? Tt. endocriniens

Bcl2/Bax ? ?IGF1/AKT

Transcriptome + ?(L. Vant’Veer)

Figure 8 - Marqueurs biologiques dans les cancers du sein LOE et échelle d’utilité/Niveaud’évidence (évaluation 2002). Tableau publié par le GETNA (OSMO) Magdelenat H., vant’Veer L.Classification réactualisée en 2003 d’après les références 10 et 18.


Biomarqueurs pronostiques LOE I/+++ dans le cancer du sein (8) :UPA/PAI1

Les facteurs de risque de dissémination métastatique infraclinique (tableau 1) lesplus étudiés sont les protéases et inhibiteurs. Les plus performants dans les analysesmultiparamétriques sont l’activateur du plasminogène type urokinase (uPA) et lesinhibiteurs des activateurs du plasminogène (PAI1 et PAI2). À titre d’exemple, dansle cancer du sein, la population No représente globalement une classe de faiblerisque dans laquelle cependant 20 % des patientes ont une évolutivité à six ans, 30 %à dix ans. Les taux tissulaires élevés d’UPA et PAI1 se sont révélés, dans des étudesconduites sur le plan européen, comme les paramètres les plus efficaces pour sélec-tionner cette sous-population à évolution rapide au sein d’une population demalades à risque classique clinique faible (20-24) (figure 9).

Figure 9 - Évolution des marqueurs pronostiques de LOE I +++ des cancers du sein (1991-2002).



Tumor characteristics

1. Histological features : type, grade, number of blood vessels, vascular invasion, necrosis.2. Stage (tumor, node, metastasis), bone marrow micrometastases.3. Steroid receptors : ER, PgR, AR, vitamin-D receptor ; steroid receptor coactivators

and coinhibitors.4. Membrane receptors for hormones and growth factors.

LHRHProlactin receptorIGF1 – IGFIIInsulin receptorEGFR – herceptin family receptors (HER2/HER3/HER4)TGFβ – family receptorsSSR family receptorsVEGF – family receptorsFGF – family receptorsUrokinase receptors

5. Enzymes, proteins and other cytoplasmatic factorsPlasminogen activator expression, (urokinase and tissular types).Plasminogen activator inhibitors (PAI1,PAI2).Cathepsin D, B, and LMetalloproteases/collagenases (MMP4-9-8..), tissue inhibitor metalloprotease (TIMP1,2)PSA (kallicrein)Thymidine kinase activityThymidine Synthase activityGrowth factor content (EGF, TGF_ and _, IGF1, Amphiregulin)Tyrosine kinase activitiesHeat shock proteins (MSP 27-70-90).Aromatase activity (CYP 19)Haptoglobin-related protein (Hpr) epitope expressionAdhesion factors (integrin, E cadherin)Glutathione –S-transferase 3Human milk fat globule antigens (HMFG-1)Prostaglandin levelsCox2 activityHypoxia-inducible factor-1_Breast cancer resistance proteinMultidrug-resistance-associated proteinBcar1/p130 as protein

6. Chromosomal abnormalitiesCytogeneticPloidyAmplification, (over)expression of oncogenes (c-myc, HER2/neu/c-erbB2, int2, ras)Deletion or mutation of suppressor genes (P53, RB, nm23)BRCA1/2 mutations

7. Cell proliferation indicesLabeling indexS-phase fractionKi-67 antigen (RB1)

8. Clonogenicity9. Immunological phenotypes

(revue réactualisée 2003 d’après J. A. Foekens et J.G. M. Klijn (16-18).

Tableau 1 - liste des biomarqueurs pronostiques et prédictifs étudiés dans le cancer du sein.


À l’inverse, dans des populations de cancer du sein avec envahissement ganglion-naire (N+), les taux tissulaires faibles de ces mêmes paramètres (UPA, PAI1) défi-nissent une sous-population représentant des cancers à évolution lente, répondantparfaitement aux thérapeutiques. Cette sous-population représente, en fait, des can-cers à évolution lente, mais diagnostiqués après un délai d’évolution important. Ladémarche analytique mise en place dans le cadre de réseaux européens pour les can-cers du sein (EORTC, Biomed I) a permis une évaluation dans le cadre d’analysesmultiparamétriques et une validation dans des essais prospectifs permettant d’at-teindre le LOE I+++, uPA et PAI 1 (figure 10) où ils sont actuellement pris encompte comme facteurs de sélection des patientes pour des essais thérapeutiques encours (25-29) (figures 11 et 12).

Figure 10 - Etude du RBG/EORTC : méta-analyse des dosages des récepteurs UPA/PAI1 dansles tumeurs primitives de 8 377 regroupant 15 laboratoires – équipes cliniques européennesayant permis avec le suivi des patientes sur dix ans (RFS : survie sans évolution clinique) dansdes études rétrospectives de calculer le risque relatif dans chaque population.


Figure 11 - Cancer du sein NO. Protocole européen Biomed I.Promoteurs : Pr F. Janicke, Pr M. Schmidt, université de Munich, 1995.

Figure 12 - Résultat du protocole Biomed I versus l’étude Pilot ayant justifié la mise en routedu protocole Biomed I. Arrêt à la demande du comité d’éthique à la cinquième année devantla confirmation du risque déterminé par la mesure de UPA PAI1, ce qui rendait inéthique lebras randomisé non traité.


Essai prospectif de niveau 1 permettant d'évaluer la valeurpronostique et prédictive de uPA/PAI 1 (Chemo NO)

(Thomssen C et Jänicke F, Eur. J. Cancer (2000) 36 : 293-306,Jänicke et al., JNCI (2001) 93 : 913-20

Study design

Inclusion criteria :node-negative, MO

1 cm, 5 cm

pre-andPostmenopausalreceptor-positive

uPA and PAI-1 lowca. 55 % of all patients

ca. 45 % of pts.uPA and/orPAI-1 high

Observation (A)

Observation (B 1)

CMF x 6 (B 2)

Stra

tifi

cati

on

Ran

dom

isat

ion

Figure 13 - Positionnement de la classification biologique associée à la mesure UPA/PAI1par rapport à la classification idéale (A) et les critères de Saint-Gallen (B) (figure 7).

Dans le cancer du sein, l’utilisation des paramètres tissulaires UPA PAI1 permetune sélection biologique des patientes No d’un groupe ne nécessitant pas de théra-peutique systémique (60 %), et d’une population nécessitant une thérapeutiqueadjuvante (40 %), ces pourcentages étant proches de la réalité clinique (70 % -30 %)(figure 13).

Le rôle majeur pronostique de UPA/PAI 1 peut s’expliquer par leur activitéphysio-pathologique. Dans le phénomène cancéreux, les activités protéolytiquesmises en jeu sont la conséquence d’un réseau complexe et interactif de plusieurs sys-tèmes protéolytiques. Les systèmes impliqués incluent les métalloprotéases, lessérines protéases, dont la plasmine générée à partir du plasminogène par un systèmed’activation spécifique, les cystines protéases, ainsi que d’autres enzymes extracellu-laires (30-34).

Ces différents systèmes enzymatiques interagissent non seulement dans le butd’activation de « pro-enzymes » et enzymes actifs, mais également certains enzymespartagent les mêmes substrats (35-39) et interagissent dans le processus d’invasivité,de migration et de néo-angiogenèse.

Le système d’activation du plasminogène est un système protéolytique complexecapable de produire de grandes quantités de plasmine (enzymes actifs à partir deson précurseur, le plasminogène). Le plasminogène est une prosérine protéase de90kDa produite par le foie et sécrétée dans le système vasculaire à très haute concen-



tration (1,5 à 2 mM). Le plasminogène peut également être trouvé dans les compar-timents extra-vasculaires (30, 40). De ce fait, cette pro-enzyme plasmatique et tissu-laire est disponible de façon importante pour une activation par des systèmes spé-cifiques (le système d’activation du plasminogène PA).

La plasmine est une protéase relativement non spécifique qui peut, directementou à travers sa capacité d’activer des prométallo-protéases, dégrader la plupart desconstituants de la matrice cellulaire (41-44). De plus, la plasmine active divers sys-tèmes tels que les facteurs de croissance (à titre d’exemple, le TGFβ) (45-46), quipeuvent secondairement moduler les interactions intervenant entre tumeur et envi-ronnement, et, entre autres, le développement des phénomènes de néo-angiogenèseet de migration cellulaire (47-50). Récemment, il a été mis en évidence que la néo-angiogenèse peut par ailleurs être fortement inhibée par un fragment du plasmino-gène (l’angiotensine) (51-52).

L’activation du plasminogène est catalysée par deux types d’activateurs diffé-rents, les activateurs de type urokinase (uPA) et de type tissulaire (tPA).Récemment, il a également été montré que le facteur XIIa était également un acti-vateur physiologique du plasminogène (53).

De très nombreux arguments suggèrent un rôle majeur de l’activation du plas-minogène par uPA durant l’invasivité tumorale. De nombreuses études utilisantl’immuno-histochimie et l’hybridation in situ ont montré que l’uPA et uPAR sontsurtout exprimés dans les foyers tumoraux invasifs, que ce soient des tumeurs expé-rimentales ou des cancers humains. Certains modèles cellulaires sont connus pourexprimer à la fois uPA et uPAR. Dans d’autres cas, les cellules cancéreuses aux foyersd’invasivité tumorale n’expriment que uPAR et ce sont les cellules stromales adja-centes aux cellules tumorales invasives qui produisent l’uPA (ce qui a été démontré,entre autres, dans les adénocarcinomes du côlon) (54-55). Par ailleurs, plusieursmodèles expérimentaux ont montré un retard à la croissance, que ce soient destumeurs primitives ou des métastases, lorsque l’activité uPA est inhibée (56-64).Dans un modèle de souris transgénique uPA-/-, il a été montré que la transforma-tion maligne et la croissance des tumeurs mélaniques chimiquement induitesétaient réduites (65).

Le rôle de PAI1 dans le développement tumoral n’est, à ce jour, pas clairementélucidé. Il joue probablement des rôles différents et variables selon le type de cancer.

Quatre hypothèses différentes peuvent être proposées quant au rôle de PAI1 dans laprogression tumorale :- PAI1 protège l’ensemble du stroma tumoral de l’autodégradation secondaire à la

plasmine activée par l’uPA ;- PAI1 joue un rôle dans l’établissement de l’invasivité et la dissémination des cel-

lules tumorales, en réduisant l’adhésion cellulaire par un déplacement de l’uPARou des intégrines de leur interaction avec la vitronectine ;

- PAI1 est lié à la néo-angiogenèse. Exprimé dans les capillaires borgnes, il est de cefait un marqueur de l’intensité de la pénétration de la néo-vascularisation dans latumeur ;

- PAI1 ne serait qu’un marqueur d’une phase aiguë inflammatoire associé à cer-taines croissances tumorales.


Biomarqueurs prédictifs LOE.I +++ dans les cancers du sein/Récepteurshormonaux HER2

Récepteurs hormonaux (figures 8 et 14)

Figure 14- Etudes cliniques majeures ayant permis d’évaluer la valeur prédictive ou pronos-tique de la mesure des récepteurs hormonaux Roα RP.

Les premiers dosages des récepteurs ont été développés en 1972 (66) pour sélec-tionner les patientes susceptibles de répondre à une endocrinothérapie de castrationqui était alors la seule thérapeutique accessible avec l'hormonothérapie à dose phar-macologique dans le cadre d'un traitement palliatif (67-70).

De très nombreuses études, réalisées sur des séries importantes de patientes, ontmis en évidence, depuis, l'étroite corrélation entre la présence de récepteurs hormo-naux et la réponse à l'hormonothérapie anti-estrogénique et/ou à des protocoles dechimiothérapie type CMF. Par ailleurs, la durée de réponse est corrélée aux taux desrécepteurs (71-72).

L'utilisation systématique de ces dosages et l'étude de la survie des patientes à lafin des années soixante-dix ont ensuite permis au groupe de W L McGuire de mon-trer leur valeur pronostique. Cependant, l'interférence des protocoles de thérapeu-tique adjuvante n'avait pas été prise en compte dans cette analyse princeps.L'utilisation des R.Oα. seuls permet une prédiction de la réponse au traitementdans environ 75 % des cas. Le manque de précision de la prédiction de la réponseest principalement dû à l'absence de réponse de certaines tumeurs R.Oα.+. Cecipeut provenir de l'hétérogénéité d'expression des R.Oα. dans les cellules tumoralesou à la présence d'un R.Oα. dépourvu d'action biologique. Le récepteur de proges-térone (RP) (71-73), ou PS2 (74) dont la synthèse est induite par le R.Oα., ont étéproposés secondairement pour améliorer la valeur prédictive des R.Oα.


Biomarqueur facteur préditifLOE / Niveau d'évidence I

Récepteurs d'hormones ROα + RP

Pronostic (I/II)

+

• NSABP• SWOG• ·FNCLCC• RBG/EORTC

Prédictif (I/II)

+++ (hormonothérapie)*

• EBCTCG• DBCG

La détection des récepteurs hormonaux a été dans un premier temps réalisée pardes méthodes biochimiques (75-78) dont la fiabilité a été largement validée. Dans lebilan, il est précisé que seule cette technique a fait l’objet d’une évolution et une vali-dation, avec mise en place de protocoles méthodologiques standardisés et decontrôles de qualité (76-90). Cette approche a permis l'établissement de seuils spé-cifiques précis au-delà desquels on peut escompter une réponse clinique ou établirun pronostic (67-69, 91-94).

Les méthodes biochimiques-biologiques impliquent la préparation d'un extraittissulaire après homogénéisation du tissu. La production d'anticorps anti-récep-teurs a ouvert de nouvelles perspectives techniques, dosages immuno-enzymatiquesou détection sur des coupes histologiques. Une bonne corrélation en terme de posi-tivité est généralement rapportée entre les techniques biochimiques et immuno-his-tochimiques. L’insuffisance majeure de l’immuno-histochimie réside dans lemanque d’une expression quantitative objective du contenu en récepteur. Or uneefficacité supérieure des thérapeutiques endocriniennes a été démontrée lorsque lestaux en récepteurs sont plus élevés (67-68, 95-96). Les deux approches méthodolo-giques sont en fait complémentaires, chacune ayant ses avantages relatifs (97-99).

L'importance clinique des récepteurs a été établie à une époque où seuls lesdosages biochimiques traditionnels étaient disponibles. On a ainsi montré l'évolu-tion péjorative des patientes dont les tumeurs étaient dépourvues de récepteurs(100-101). Il est cependant difficile, d'après les études initiales incluant des patientesayant reçu divers protocoles thérapeutiques, de distinguer leur valeur pronostiquepropre de leur valeur d'indicateur thérapeutique (10, 67-72). Dans les études univa-riées, les estimations de risque relatif sont de l'ordre de 1,5 à 2, et elles sont souventinférieures dans les études multivariées. Un apparent paradoxe a été décrit concer-nant les tumeurs en post-ménopause ayant des taux très élevés de ROα. Cestumeurs évoluent spontanément relativement rapidement, mais répondent extrê-mement bien aux protocoles d'hormonothérapie, suggérant une stimulation de cestumeurs par des facteurs endocriniens endogènes, associés à une activité aromatasetissulaire péritumorale (102-104).

En 1996, un deuxième récepteur (ROβ), situé sur le chromosome 14, a été isolé(Kuiper et al. 1996). Le premier, localisé sur le chromosome 6, a donc été rebaptiséROα. Ils se distinguent par un faible degré d’homologie dans le domaine A/B etdans le domaine de liaison aux estrogènes (régions DEF). Une étude récente par RT-PCR montre que les deux types peuvent coexister dans les cancers du sein (105). Ladétection classique des RO dans le cytosol des tumeurs par radio-ligand permettaitd’évaluer les présences des deux types de récepteurs dans la tumeur. Par contre, il estpossible que le dosage immuno-enzymatique, fait avec les anticorps commercialisés,ne permette pas d’évaluer la quantité des deux RO avec la même sensibilité. Cedosage mis au point pour quantifier la concentration du ROα est considéré commeun facteur de bon pronostic et de sensibilité au traitement hormonal.

Les récepteurs continuent à jouer un rôle central dans la décision d'un traite-ment hormonal. Le consensus actuel dans le cancer du sein est donc que les récep-teurs hormonaux sont des paramètres corrélés en premier lieu à la réponse théra-peutique et ne sont liés à l'évolutivité des patientes que secondairement, à savoir que


leur évolutivité est influencée par la mise ou non en route de protocoles thérapeu-tiques. De ce fait, les récepteurs hormonaux sont plutôt des facteurs prédictifs quepronostiques (paramètres de sélection et de réponse et liés à la réponse aux théra-peutiques). La limite de prédictivité parfaite d’hormono-sensibilité liée à la seuledétermination des récepteurs hormonaux telle que nous l’avons décrite a conduitdepuis 1992 a proposé plusieurs hypothèses et expertises complémentaires, afin demieux cerner le pourcentage de tumeurs primitives ROα+, certes, mais répondantmal aux protocoles d'hormonothérapie.

Dans ce cadre, il a été suggéré :- RO+, certes, mais une hétérogénéité cellulaire avec ROα- secondaire à un temps

de doublement rapide associé à cette fraction cellulaire tumorale. Ceci nécessite,pour certains auteurs, la détermination séquentielle des RH au niveau de latumeur primitive, mais également des métastases, pour mieux ajuster les proto-coles thérapeutiques à la biologie réelle des récidives et métastases (105-106) ;

- la détection des mutations des ROα ont été recherchées telles celles décrites dansdes lignées cellulaires, mais les tumeurs exprimant des ARNm mutés, codantspour une protéine tronquée, sont rares (107) ;

- une meilleure compréhension de la biochimie moléculaire des récepteurs prenanten compte l’expression des facteurs de régulation : co-activateurs, co-inhibiteurs,associés à l’évaluation des différentes isoformes des récepteurs estrogéniques(ROα et ROβ entre autres) devrait fournir des éclaircissements sur leurs méca-nismes de régulation et leur réponse aux thérapies (107-112). Une revue généralerécente a été faite au Congrès de la Société française de sénologie (« 25 ans d’évo-lution ». Récepteurs hormonaux et pathologie mammaire, Marseille, 1980.Hormones et sein, Paris, 1990. Sein, hormones et anti-hormones, Nancy, 2004.26es Journées de la Société française de sénologie et de pathologie mammaire,Nancy, novembre 2004, p. 22-45).

La liaison des estrogènes à leurs récepteurs induit une modification conformation-nelle caractéristique amenant la dimérisation du récepteur, sa liaison à l’ADN auniveau de régions spécifiques, appelées élément de réponse aux estrogènes (ERE),situées dans la région promotrice de gènes dont ils vont moduler l’expression (108).

L’action transcriptionnelle du RO nécessite sa liaison à d’autres protéinesnucléaires, appelées adapteurs ou co-activateurs, qui vont servir de facteurs trans-criptionnels intermédiaires (109).

Le rôle de ces protéines en tant que modulateurs de l’activité transcriptionnelledes récepteurs nucléaires a pu être mis en évidence sur des gènes témoins, soit partransfection transitoire de cellules de mammifères, soit dans le système de la levure.Le développement récent de travaux expérimentaux et cliniques suggèrent que,dans une cellule donnée, la balance entre co-activateurs et co-répresseurs pourraitrendre compte de la capacité de certains anti-estrogènes à bloquer ou non l’actiondes estrogènes.

Deux études ont montré que la surexpression du co-facteur SRC-1, capable delier l’extrémité carboxyl terminal du RO, entraîne une stimulation de l’activité ago-niste du 4-OHTam, mais est incapable d’inhiber l’action antagoniste de l’anti-estro-


gène (110). Par contre, les mêmes auteurs ont montré que SMRT était capable dediminuer l’activité agoniste du 4-OHTam sans affecter l’activité en présence d’estra-diol. Un travail récemment publié (111) présente, dans le cadre d’une cohorte despatientes ménopausées traitées par tamoxifène, l’expertise rétrospective de 27 co-régulateurs de ROα dans les tumeurs primitives du sein RH+. Cette étude montreque l’expression forte du co-répresseur NCOR1 est un facteur prédictif de laréponse à l’hormonothérapie et devrait, de ce fait, être plus largement expertisé.

La prise en compte du taux des ROβ dans les cancers du sein, et non de sonvariant ROβcx, serait un élément complémentaire pour mieux prédire la résistanceau tamoxifène (113). Par ailleurs, une étude récente confirme que la mise en évi-dence de la phosphorylation du ROα sur la sérine 118 serait associée à unemeilleure sensibilité au tamoxifène, confirmant les résultats obtenus sur desmodèles pré-cliniques (114).

Enfin, d’autres études des voies de résistance aux anti-estrogènes font appel àl’activation de voie signalitique des facteurs de croissance, à la famille des herégu-lines, aux voies métaboliques de la biosynthèse des bases pyrimidiques (TK entreautres) et de contrôle du cycle cellulaire (cyclines et protéine kinase associée dont lacycline D1, P53…). Mais ces facteurs n’ont pas franchi toutes les étapes d’évaluationet de validation pour une utilisation clinique, à l’exception de HER2.

HER2 – cerbB2/neu

L’oncogène HER2 est l’un des marqueurs moléculaires les plus étudiés ces dernièresannées. c-erbB-2 code pour une glycoprotéine transmembranaire de 185 KDa(p185) qui est un récepteur de facteur de croissance avec une activité tyrosine kinaseet dont la partie extra-cellulaire présente une homologie avec celle du récepteur del’epidermal growth factor (EGFR). La surexpression de HER2 conduit à une activa-tion de la transcription de gènes régulant la progression dans le cycle cellulaire.

L’évaluation et la validation de la détermination de HER2 comme facteur LOEI+++ (prédictif > pronostique) est exemplaire (figure 15) depuis la descriptionprinceps faite par D. Salmon en 1987, reliant la surexpression de HER2 à une ampli-fication, un nombre très important de travaux, tant sur le plan fondamental que surl’évaluation clinique, portant sur l’amplification et surexpression de HER2, est par-faitement présenté dans l’ouvrage édité par Y. Yarden (115). Une application des tra-vaux de recherche fondamentale portant sur HER2 a débouché sur la mise au pointd’un anticorps bloquant efficacement en clinique humaine le trastuzumab(Herceptine).


Figure 15 - Données actuelles sur la valeur prédictive ou pronostique des techniques de carac-térisation de HER2.

Une revue générale en 1997 (116) des études séparées portant sur 22 616 patientsmontre que, dans les cancers du sein, la présence de c-erbB2 est en moyenneretrouvée dans 26 % des cancers (avec une échelle de 5 % à 55 %). Cette revue géné-rale associée à d’autres bilans (18-116) montre qu’une majorité des études publiéessur le sujet conclue à une signification pronostique péjorative de la sur-expression(Allred, 1992) ou de l’amplification de c-erbB-2, essentiellement dans les cancers dusein avec envahissement ganglionnaire (Tandon, 1989). Plusieurs études ont montréqu’une amplification ou qu’une sur-expression de c-erbB-2 est également corrélée àune résistance à une hormonothérapie par tamoxifène, en phase adjuvante ou méta-statique (Borg, 1994 ; Carlomagno, 1996 ; Wright, 1992). Elledge (1998), dans unesérie rétrospective de patientes RE positives, n'a pas retrouvé cette tendance.Cependant, la plupart de ces études ont utilisé des méthodes immuno-histochi-miques, avec des conditions techniques et des anticorps différents, ce qui rend lescomparaisons difficiles (Press 1994, Têtu, 1994).

Plusieurs points sont cependant importants à rappeler dont, entre autres, la rela-tion claire entre amplification de HER2 et perte ou dissociation de l’expression desrécepteurs hormonaux (RO, RP).

Dans les cancers du sein de patientes ménopausées (117), les tumeurs négatives(RO- et RP) ont le taux de HER2 amplifié le plus élevé (47 %) ; a contrario, lestumeurs très fortement positives RO++ (≥ 200 fentomole) et RP++ (> 100 fento-mole) ont le pourcentage HER2 amplifié le plus faible (6 %). Entre ces deux


extrêmes, les tumeurs RO+ et RP+ ont un pourcentage HER2 amplifié moyen de22 %. Par contre, les tumeurs dissociées (RO-RP+ et RO+RP-) ont un taux d’am-plification de HER2 proche des tumeurs négatives, soit 40 %.

Les cancers du sein canalaires infiltrants ont une fréquence de positivité à HER2supérieure aux cancers in situ et les pourcentages de HER2 les plus élevés sont asso-ciés au grade histopronostique et nucléaire III, à l’aneuploïdie et au taux de prolifé-ration intratumorale le plus élevé (quelle que soit la méthode de détermination).

Le développement d’un dosage analytique quantitatif pour l’expression deHER2 permet de définir une répartition de la sur-expression non homogène avecune répartition, en fait, bimodale. Ceci permet d’isoler 12 % des tumeurs sur-expri-mant très fortement HER2 et qui sont RO- (ou RO très faible ou associé à RP-) etprésente, par ailleurs, un taux très important de HER2 phosphonylé (Y-1248-P) ; cesont enfin les tumeurs les plus résistantes aux thérapeutiques anti-estrogéniques ouchimiothérapiques (CMF entre autres) (118).

En 1998, un travail de S. Koscielny attire l’attention sur une signification péjo-rative associée à certains taux très faibles d’expression de HER2. Ceci a fait l’objetd’une controverse argumentée car ce fait paradoxal n’a pas été retrouvé par d’autresauteurs (116-119).

Par contre, le groupe de D F Hayes et I C Henderson en 2001 (120) démontre lasignification péjorative d’un sous-groupe de patients sur-exprimant HER2, maisdont on peut détecter dans le sérum la présence du domaine extracellulaire (ECD)de HER2. Cette forme circulante du ECD/ HER2 ou S HER2 peut être due au relar-gage après protéolyse par des métallo-protéases spécifiques. Ce clivage du domaineextracellulaire, bloqué, entre autres, par l’anticorps Herceptin®, a pour conséquencela libération et l’activation du domaine intracellulaire. L’ensemble de ces raisons,associé à un mauvais pronostic avec l’activation de HER2 et la facilité de détermi-nation de ces paramètres sériques, devrait prendre une place précise dans l’évalua-tion des patientes.

L’évaluation rapide des degrés d’évidence LOE I associée à la détermination deHER2 (cf. figure 15) est liée au développement des essais protocolaires thérapeu-tiques, qui démontrent l’efficacité de la détermination d’une amplification de HER2comme test prédictif de sensibilité à une thérapeutique spécifique utilisant un anti-corps anti-HER2 (trastazumab).

Dans ce cadre, les résultats des protocoles MO 648 g-MO 649 g-MO 650 g sontexemplaires (ASCO 2001). Dans le protocole MO 648 g incluant 469 patientes, uneaugmentation du bénéfice clinique liée au trastuzumab chez les patientes traitéespar chimiothérapie ou chimiothérapie et trastuzumab est démontrée chez lespatientes sélectionnées par FISH où le bénéfice se traduit par un RR = 0,71.

Dans les études MO 649 g/MO 650 g (336 patientes incluses dans les deux étudesIHC Dako 2+/3+).

Le taux de réponse au trastuzumab (en ce qui concerne les réponses complètes,partielles ou stabilisation > huit mois) en fonction de la détermination de l’ampli-fication de HER2 par technique FISH, est dans le protocole MO 649 g pour lespatientes FISH + de 24 %, alors que les patientes FISH ne présentent aucune


réponse ; dans le protocole MO 650 g, les patientes FISH + ont un taux de réponsede 48 % ; en revanche, les patientes FISH- présentent un taux de réponse de 10 %.

Un intérêt particulier supplémentaire à la détermination HER2 dans cestumeurs a été soulevé par la publication à l’ASCO 2000 d’une étude démontrantune réponse favorable des patientes HER2 aux protocoles de chimiothérapie com-portant des anthracyclines. En fait, l’amplification de HER2 dans le bras long duchromosome 17 fait partie d’un Amplicon associant ou non l’amplification de latopoï-isomérase II, et une étude (2002) démontre la sensibilité aux protocoles com-portant des anthracyclines chez les patientes HER2+ amplifiées si celle-ci est asso-ciée à une amplification de la topoïsomérase II (121). Mais ce résultat reste àconfirmer. Les résultats présentés à l’ASCO 2005 concernant les protocoles asso-ciant chimiothérapie/Herceptin® dans les cancers du sein confirment le niveauLOEI/I prédictifs du statut HER2.

Une étude récente du Southwest Oncology Group Study (Clin, vol. 10, n° 175670) met en évidence, dans les tumeurs du sein évoluées RO_ positives proposéespour une thérapeutique par tamoxifère, l’intérêt de la prise en compte de l’expres-sion de HER2 pour être associé à une amplification et de l’expression de HER1 pourprédire l’évolution clinique et la sensibilité à la thérapeutique.

Biomarqueurs de niveau LOEII et LOEIII (figure 8)

Le récepteur de l’EGF (LOEIII)

Le récepteur de l’EGF (EGFR/HER1) est une glycoprotéine transmembranaire de170 kD exprimée dans une grande variété de types cellulaires. La surexpression deEGFR a été mise en évidence dans les tumeurs mammaires humaines. Elle est cor-rélée positivement au grade histo-prognostique de Scarff Bloom Richardson et àl’absence des récepteurs stéroïdiens. La valeur pronostique de EGFR dans les can-cers du sein est l’objet de controverses. Cependant, une méta-analyse compilantquarante études séparées et regroupant 5 232 patients montre que le pourcentage depositivité à l’EGF-R est en moyenne de 45 %, avec une variabilité très grande (de 14à 91 %) en fonction des techniques utilisées (122). Neuf des quinze études montrentune association négative entre le taux d’EGF-R et les courbes de survie actuariellesen analyse univariée. Deux autres études montrent une tendance non significativedans le même sens. Sept études ont utilisé une approche analytique multivariée.Deux démontrent clairement la valeur pronostique indépendante de l’EGF-Rcomme facteur péjoratif (123, 124). Les autres études montrent la même tendance,mais avec une valeur statistique plus faible. Par contre, toutes les études ayant prisen compte un traitement hormonal montrent une association importante de l’EGF-R avec l’hormono-résistance (125, 126). Cependant, dans chaque étude, la surex-pression d’EGF-R est associée négativement avec le taux des récepteurs hormonaux.Le faible taux de ceux-ci doit être pris en compte dans l’analyse de l’hormono-résis-tance (127).


La signification pronostique est plus controversée selon les études et aucunesérie d’études d’importance comparable à celles conduites pour HER2 n’a étépubliée à ce jour concernant le bénéfice possible lié aux blocage de l’activité tyro-sine kinase associée à HER1. Des protocoles d’évaluation sont actuellement en coursdans d’autres pathologies tumorales, peu dans les cancers du sein.

La thymidine kinase (LOEII) (figure 8)

La thymidine kinase (TK) a un rôle majeur dans la synthèse de l’ADN. Elle recyclela thymidine issue du catabolisme de l'ADN cellulaire. Ce rôle de sauvetage est par-ticulièrement augmenté dans les cellules tumorales mammaires. La conversion de lathymidine (dT) en déoxythymidine monophosphate (dTMP) met en jeu uneenzyme spécifique, la déoxythymidine kinase (TK). Deux iso-enzymes ont étédécrites pour la TK : la TK1, la TK2. La TK2 mitochondriale est une activitéconstante non régulée par le cycle cellulaire. La TK1 est une iso-enzyme cytosoliqueinitialement décrite dans le foie fœtal, puis mise en évidence dans les tissus à proli-fération rapide (128). Dans les cellules eucaryotes, les taux de TK1 sont extrême-ment élevés en phase G1-S, mais ils sont à la limite de la détection dans les autresphases du cycle. Dans les cancers du sein, l'activité de la TK1 est liée à la composantetumorale, et les taux élevés ont une valeur pronostique péjorative (129-137). La TK1est un facteur pronostique indépendant chez les patientes pré-ou post-ménopau-sées, chez les patientes N- sans traitement adjuvant et chez les patientes N+ ayantreçu des protocoles de thérapie incluant le protocole de chimiothérapie adjuvanteCMF et FAC (138-139). Une corrélation inverse a été rapportée entre les taux de TKet la durée de survie sans récurrence chez ces patientes. Des travaux réalisés parnotre groupe montrent que des taux tumoraux élevés de TK sont associés à unenon-réponse au tamoxifène (140). Il n’existe actuellement aucun inhibiteur directspécifique de la TK1.

Marqueurs associés à la néo-angiogenèse (LOEII/LOEIII)

Depuis une dizaine d’années, sur les plans fondamental et expérimental, mais éga-lement clinique, une notion importante a pris corps : la relation entre la tumeur etson micro-environnement. Dans ces interactions complexes, de multiples facteursparacrines entrent en jeu et sous-tendent le développement tumoral, mais égale-ment le processus d’invasion de métastases (141). Au centre de ces interactions,nous retrouvons les protéases et facteurs de croissance qui concourent au dévelop-pement et à l’organisation de la néo-angiogenèse tumorale indispensable à la crois-sance tumorale et facteur indispensable au processus métastatique.

Le VEGF a été un des facteurs biologiques les plus étudiés à ce jour pour savaleur pronostique, entre autres dans les tumeurs sans envahissement ganglionnaireN0 (142-146). L’analyse d’une approche histo-pathologique avec comptage des néo-capillaires apporte également une valeur pronostique, mais avec une réelle disper-sion entre les différentes études liées au problème technique (comptage direct ouimmuno-histochimie, large du champ d’observation, localisation de cechamp…) (147).


La prise en compte de la néo-angiogenèse tumorale apporte, en fait, un éclairageimportant dans le profil biologique des tumeurs et a permis d’argumenter l’hétéro-généité d’évolution et d’agressivité de certaines tumeurs versus d’autres.

L’ensemble des facteurs biologiques permettant de mieux cerner la dynamiquepropre de chaque tumeur, isolant de ce fait à un stade clinique identique destumeurs très agressives prises précocement de tumeurs plus lentement évolutives depronostic évolutif plus favorable pris à un stade plus tardif de leur évolution chro-nologique (146-149).

D’autres facteurs associés à l’angiogenèse font l’objet d’études récentes : expres-sion HIF1α, CD31, CD105, TGFβ… Ceux-ci semblent être des facteurs intéressants,mais sont loin d’être totalement évalués et validés.

Tyrosines kinases (LOEIII)

La prolifération cellulaire normale ou maligne est associée à la stimulation de cas-cades de transmission du signal impliquant la phosphorylation/déphosphorylationde résidus tyrosine de certaines protéines cibles, et ceci en réponse à la stimulationpar les facteurs de croissance (150) de certains récepteurs spécifiques portés par lacellule, ou comme expression de certains oncogènes (151). Sur l’ensemble des tyro-sines-kinases décrites à ce jour, la dérégulation d’une trentaine environ est associéeau processus tumoral (« oncogénique », tyrosine-kinase = OKT) (152). Les activitéstyrosines-kinases (PTK) impliquées dans les cascades de transmission du signalsont, soit cytosoliques, soit associées à la membrane plasmique, en particulier sousla forme de domaines catalytiques de protéines trans-membranaires, tels EGFR,IGFR et c-erbB2 dont la présence a été rapportée dans les cancers du sein. De nom-breux oncogènes codent pour des PTK ou pour des protéines intervenant dans larégulation de leur activité. Les mutations et les amplifications affectant ces onco-gènes aboutissent à une augmentation et à une dérégulation des activités PTKmembranaires ou cystoliques. Si, dans les lames du sein, la mesure spécifique desfacteurs de croissance, de leurs récepteurs et de l’activité tyrosine-kinase associéspeuvent être utilisés dans le ciblage thérapeutique spécifique, en revanche, la valeurpronostique de ces paramètres fait l’objet de controverses (153-158).

Cycline D1 (LOE.III)

Les cyclines jouent un rôle important dans les différentes phases du cycle cellulaire.La cycline D1 joue un rôle capital dans le passage du point de restriction de la phaseG1. La perte de l’expression de P16 (159, 160) et la perte de fonctionnalité de la pro-téine Rb sont associées à une progression tumorale incontrôlée. Par contre, l’ampli-fication et la sur-expression de la cycline D1, également associée à la sur-expressionde CDK4, sont un facteur de non-contrôle du cycle cellulaire lié à la progressiontumorale. Récemment, l’amplification de la cycline D1 a été associée à une insensi-bilité aux molécules anti-estrogéniques (161).


Oncogènes – gènes suppresseurs de tumeur (LOE III), hyperméthylation des promoteurs

Depuis 1985, l’altération de plusieurs oncogènes, dont cMyc-Int2-cerbB2, faitl’objet de multiples travaux pour en évaluer la valeur pronostique de façon isolée ouconcomitante (162).

CMyc (chromosome 8) : l’amplification de cMyc est diversement reportée : 1-56% des cancers du sein, avec une moyenne de 20 % (163). La valeur pronostiqueassociée à l’amplification de cMyc a été reportée dès 1992 (164-165). Une méta-ana-lyse publiée en 2000 confirme l’amplification de cMyc dans 15,7 % en moyenne descancers du sein et une valeur pronostique associée à l’amplification avec un risquede récidive (RR = 2,05) et d’évolutivité péjorative (RR = 1,74) de décès par cancer.Ce paramètre semble significatif en lui-même car il présente une très faible associa-tion avec l’envahissement ganglionnaire et le statut négatif des récepteurs hormo-naux (165-166).

Int2 : l’amplification de cet oncogène est associée à un amplicon situé en 11 q 13comprenant Int2/FGF3 ; hst-2/FGF4 ; bcl-1 ; PRAD1, cycline D EMS-1, GST-pi.

Cette amplification a été reportée de façon diverse (9 à 23 % des cancers du sein)(167).

Une association forte existe entre amplification Int2 et statut des récepteurs hor-monaux positifs. La signification pronostique de Int2 est controversée car souventassociée à d’autres facteurs et, quoi qu’il en soit, inférieure à l’amplification de cMycou c-erbB2.

CerbB2 : nous avons déjà reporté les résultats concernant cet oncogène dans lechapitre des facteurs prédictifs LOEI+++.

p53 : ce gène code pour une protéine facteur de transcription. Dans les cellulesnormales non stressées, p53 est inactive ; elle est maintenue à un faible niveau parson association avec MDM2, qui provoque son transport du noyau vers le cyto-plasme et sa dégradation par la voie dépendante de l’ubiquitine.

Les stress génotoxiques déclenchent des voies de signalisation qui aboutissent àla stabilisation de la protéine p53, causant son accumulation dans le noyau et sonactivation comme facteur de transcription. Cette activation conduit à l’arrêt ducycle cellulaire et à l’induction de l’apoptose en cas d’altération génomique nonréparable, p53 apparaît comme un gène capital dans le contrôle du cycle cellulaire,la réparation de l’ADN, l’apoptose, la différenciation cellulaire, la sénescence et l’an-giogenèse. De ce fait, son altération dans les cancers a justifié un très grand nombred’études sur la valeur pronostique de ce facteur. Une revue générale de plus cin-quante études montre des résultats identiques à ceux reportés dans la référence 18,à savoir une très grande dispersion de la signification pronostique liée en grandepartie aux techniques analytiques. Les techniques liées à la mise en évidence et àl’accumulation de la protéine sont peu fiables sur le plan pronostique, tant par tech-nique immuno-histochimie (18) que par technique ELISA (168-169). Cependant,


les études de recherche directe de mutation par séquençage sont plus rares ouconcordantes (170-174) tant sur le plan pronostique que sur celui d’une mauvaiseréponse à la chimiothérapie (anthracycline) ou à l’hormonothérapie (tamoxifène)(175). Une revue récente fait un lien possible entre angiogenèse, hypoxie de latumeur et altérations des oncogènes dont nous venons de voir la valeur pronostiquecomme biomarqueurs tissulaires pronostiques ou prédictifs (176-177). Une étuderécente démontre que l’expression de p53 pourrait être un facteur pronostique pourles cancers du sein inflammatoires (178).

BCAR1 : une étude récente du groupe de Rotterdam a évalué la valeur pronos-tique de BCAR1 dans les cancers primitifs du sein (179).

Hyperméthylation des promoteurs de gènes spécifiques : une nouvelleapproche analytique permet de comprendre la perte de fonction de certains gènespar blocage de leur transcription et hyperméthylation de leur promoteur. L’étudesystématique de l’hyperméthylation de promoteur de gène sensible permet demettre en évidence un ciblage sélectif non randomisé dans les cancers du sein (180).

Par ailleurs, l’hyperméthylation des promoteurs sensibles définit des patterns deperte d’expression associés à des classes distinctes de cancers du sein (181). Enfin,une approche technique permettrait d’étudier l’hyperméthylation des promoteursde certains gènes suppresseurs dans le sérum de patientes porteuses de cancers dusein (182). L’approche analytique de l’hyperméthylation des promoteurs sembleêtre une voie de très haut intérêt pour déterminer un diagnostic moléculaire pré-coce du cancer du sein, entre autres dans les lésions frontières, et permettre demieux définir certaines classes de cancers du sein.

Réflexion-bilan 2005 sur le transfert et la pratique clinique La biochimie analytique, la biologie moléculaire, la biologie expérimentale et lagénétique ont apporté des contributions importantes à la connaissance précise desmécanismes moléculaires de la cancérogenèse. Cependant, à ce jour, l’utilisation desdonnées biologiques qui considèrent l’évolutivité moléculaire fonctionnelle destumeurs n’est pas suffisamment prise en compte. Dans l’approche clinique actuelle,cette situation est essentiellement due à un défaut de standardisation dans l’évalua-tion des marqueurs tumoraux biologiques et à une confrontation clinico-biolo-gique insuffisante, alors que depuis plus de trente ans le concept de marqueurtumoral existe et a fait l’objet d’un nombre très important de travaux et de publica-tions.

Il a fallu vingt ans (1969-1989) pour que le concept de récepteurs hormonaux(ROα RP) mis en évidence soit progressivement utilisé, validé et devienne un goldstandard LOEI avec utilisation de sa détermination dans la stratégie thérapeutiquede façon systématique. Des progrès sont actuellement possibles et à faire pour incré-menter et affiner la seule classification plus ou moins utilisée actuellement entermes de facteurs prédictifs.


Il a fallu dix ans (1987-1997) pour faire de HER2 un marqueur prédictif LOEIassocié à une thérapeutique spécifique ciblée. Il en est de même du délai pour UPAPAI1 entre la publication princeps de Duffy (1987) et le premier essai européenBIOMED 2 NNBC2 promu par le groupe AGO (Dr Thomssen, Dr Jänicke) prenanten compte leur utilisation dans la stratification des patientes atteintes d’un cancerdu sein No qui se poursuit actuellement par le protocole NNBC3. Ceci est dû à lanécessité d’obtenir le niveau d’évidence I entraînant la valorisation de toutes lesétapes de ce processus, avec obtention d’un outil diagnostique robuste, fiable, repro-ductible, validé, faisant l’objet de contrôles de qualité. Il s’agit d’un outil complé-mentaire de ceux disponibles actuellement, utilisé dans des conditions optimales,ainsi qu’une motivation des équipes cliniques pour bousculer leurs habitudes enintroduisant l’innovation dans le cadre d’essais thérapeutiques, puis dans leur pra-tique courante.

Le changement dans la pratique clinique ne doit pas se faire au détriment despatients et cela explique la lenteur de la mise en place et de l’utilisation des mar-queurs, lenteur relative qui est un juste milieu entre frilosité et pari risqué dû à l’im-patience ou l’enthousiasme des innovants prêts « à accélérer » les étapes de valida-tion.

Le procédé d’évaluation-validation est multidisciplinaire (biologique-tech-nique) et fait également appel à des méthodes spécifiques de bio-informatique etstatistique. Ce dernier point particulièrement important a fait l’objet de multiplestravaux et publications et, entre autres, d’une mise au point quant aux étapes etétudes nécessaires pour l’application de méthodes statistiques de validation non cri-tiquables (183). L’introduction des marqueurs biologiques dans les essais thérapeu-tiques est une nécessité pour leur validation, mais également pour mieux analyserl’efficacité ou non de protocoles thérapeutiques à partir de groupes de patients bio-logiquement et cliniquement homogènes.

Enfin, la nécessité d’une approche analytique ciblée et innovante peut se révélerplus complexe qu’une autre déjà validée dans un domaine proche, comme il estapparu entre détermination de la sur-expression, amplification HER2 pour l’effica-cité du trastazumab (Herceptine®) et analyse du REGF pour l’efficacité du gefritinib(Iressa®), où l’analyse doit prendre en compte, non seulement la sur-expression,mais également la présence de mutation spécifique.

Seule une coordination motivée entre groupes clinique et biologiste de transfertpermet, en fait, une avancée coordonnée et régulière.

En 2005, des outils sont disponibles et utilisables dans le cadre d’essais thérapeu-tiques et en pratique clinique quotidienne.

Évolution des biotechnologies analytiques. Approches futures

Les méthodes biochimiques

Les méthodes biochimiques d'étude des protéines ont été les premières utiliséespour l'analyse des facteurs pronostiques et de réponse thérapeutique. Elles impli-


quent la préparation d'un extrait tissulaire après homogénéisation du tissu. Ellespeuvent mettre en évidence une fonction de ou des protéines étudiées (liaison,métabolisme…), de leur statut d’activation (phosphorylation..), de la coopérativitéentre différentes structures macromoléculaires.

Avantages

Elles font, entre autres, pour les récepteurs hormonaux, l'objet de contrôles de qua-lité européens dans le cadre de l'EORTC depuis plus de quinze ans. Elles ont l’avan-tage d’être réellement quantitatives.

Limites

Les méthodes biochimiques actuelles, de part la quantité de tissus qu'elles exigent,ne permettent qu’une approche parciparamétrique dans tous les cas et sont parfoismême impossibles pour de très faibles cellularités.

Évolution future

Amélioration de la sensibilité et spécificité de la direction par utilisation de la spec-trométrie de masse, isolement des macromolécules informatives au sein de milieuxcomplexes (cytosol, fluides biologiques…) par technique de capture, désorptionlaser, puis identification par analyse par spectrométrie de masse (techniqueMALDI-TOF/ SELDI-TOF) : elles sont en cours d’évaluation, mais semblent êtreune voie analytique sensible, robuste, applicable à la clinique. Elles rendent possiblesdes études réellement multiparamétriques dans le cadre des évaluations post-géno-miques du protéome. Elles peuvent prendre en compte tous les marqueurs biolo-giques protéiques déjà évalués et validés, mais également participer à la caractérisa-tion et l’isolement de nouveaux marqueurs, tant sur le plan pronostique ou prédictifqu’en tant que cible thérapeutique. L’isolement des nouveaux marqueurs se fait àpartir de profils globaux, avec une caractérisation tant sur le plan bio-informatique,avec des techniques comparatives et de hiérarchisation, que par l’association demultiples techniques d’isolement plus lourdes (micro-séquençage). L’approche pro-téomique analytique cerne au plus près la réalité biologique et bio-pathologique duprocessus tumoral par un accès direct aux structures macromoléculaires fonction-nelles.

La sensibilité des techniques biochimiques permet de les associer avec la micro-dissection tissulaire (type laser microcapture) (177) elle permet aussi de mieuxcibler les compartiments cellulaires d’intérêt au sein d’un tissu hétérogène, normalou pathologique. Ces techniques analytiques (MALDI-TOF/SELDI-TOF) sontapplicables au fluide biologique avec efficacité telles les aspirations-lavages dessécrétions ductales mammaires (184).

L’accessibilité des techniques analytiques protéomiques multifactorielles est endécalage par rapport aux techniques de biologie moléculaire, mais ce décalage, dumoins dans le cadre de la biologie de transfert, se réduit rapidement par l’établisse-


ment de laboratoires experts et par la mise en place de réseaux coopératifs sur cetype de technologies.

Les méthodes de biologie moléculaire

Parmi les méthodes de biologie moléculaire, à l’heure actuelle, pour une analysemultiparamétrique, l'étude de l'expression des ARN messagers (ARNm) est unealternative rendue possible par un développement technologique rapide. Parmi lestechniques de biologie moléculaire permettant l'analyse de transcriptome, le déve-loppement technologique analytique à grande échelle et informatique appliqué arendu possible, d’une part, le séquençage complet du génome humain, d’autre part,la mise au point d’une approche analytique globale, entre autres, dans l’expressiondes gènes (transcriptome), et ce dans des situations particulières et comparativesdont font partie le cancer et son micro-environnement tissulaire.

Pour ce faire, il existe deux approches majeures :- Les puces ARN/ADN- La technique de PCR quantitative en temps réel

Puces ARN/ ADN

Les puces ADN/ARN constituent des outils d’analyse moléculaire parallèle capablesde fournir une information biologique sur un temps et un espace considérablementréduits par rapport aux méthodes conventionnelles de biologie moléculaire.

On distingue deux types d’applications principales :– les profils d’expression génique ;– l’analyse d’altérations structurales (SNP, mutations).

Puces d’expression

Des systèmes se développent dans ce domaine pour permettre l’analyse simultanéede l’expression (ARNm) d’un très grand nombre de gènes.

On peut distinguer deux types de puces :– les systèmes généralistes, pièces à haute densité de type Affymetrix (puces sili-

cium) ou Clontech (membrane), qui proposent l’analyse d’un très grand nombrede gènes ou EST prédéterminés : 5 000, 10 000, 25 000. Le coût unitaire d’analyseest actuellement très élevé pour une application médicale individuelle. L’analysepeut être, soit quantitative absolue, soit, le plus souvent, quantitative relative,c’est-à-dire que le résultat consiste en un niveau d’expression par rapport à uneréférence « normale ». La sensibilité reste très moyenne (20 d’ARN total, de trèsbonne qualité) et la technique elle-même demande toute une série de contrôles dequalité tant de la puce elle-même que du système de détection. L’exploitation desdonnées obtenues à demander le développement d’outils statistiques et de bio-informatique, outils de classification, association et hiérarchisation entre autres,permettant de gérer l’ensemble des informations obtenues. Les problèmes réels


liés au développement et à l’exploitation de telles technologies ont fait l’objetd’une série de recommandations (185), sur le plan du développement technique,que des publications issues des travaux utilisant ces techniques en développementdans le cadre de programmes de recherche fondamentale ou de transfert avecnécessité d’information minimale concernant les données expérimentales(MIAME, minimal information about a micro-arrays experiment) (186).Par ailleurs, sur un exemple précis, des équipes coopérant au projet du NIH font unbilan et également des recommandations sur la faisabilité et l’application des tech-niques utilisant les puces ARN pour l’expertise de tissus pathologiques avec l’asso-ciation de microdissections, pour capture des plages de tissus d’intérêt, l’expertisedes variations des gènes par technique single nucleotide polymorphism (SNPS), maiségalement étudiant la transcription alternative au splicéome (187-189) ;

– les puces « façonnables » avec spotters à pointe sèche ou piège électrique permet-tent l’analyse d’un nombre limité de gènes sélectionnés par l’utilisateur.Il s’agit d’une technologie encore en développement, avec de nombreux pro-blèmes de préparation des sondes de capture, de reproductibilité, ce qui la situeencore dans le domaine de la recherche préclinique. Les puces sont intéressantessi l’on souhaite avoir des profils d’expression comportant de nombreux gènes(> 80-100), mais demandent la mise au point synchrone au développement despuces d’un outil informatique analytique de gestion et d’évaluation. Dans cedomaine, certaines compagnies proposent des puces, faites à la demande, soitdédiées à une application clinique avec un nombre de gènes limités (100 à 250),mais avec des techniques de détection originales augmentant la sensibilité et uneassurance qualité dans la préparation. Mais les recommandations et guide-linesdéjà évoqués pour les puces généralistes sont également nécessaires.

Des expertises comparatives ont été menées entre puces généralistes et façonnables,ainsi qu’entre les différents types de puces pour une même pathologie, afin d’appré-cier leurs valeurs réciproques.

Évaluation actuelle des approches analytiques moléculaires

De nombreuses publications (190-201) présentent le travail actuel effectué dans lecadre du cancer du sein. Partant d’une analyse par puce d’expression haute densité,les études pour une évaluation et une classification pronostiques retiennent entre 25et 75 gènes décisionnels. Il est à noter par ailleurs que les gènes exprimés à fort pou-voir discriminatoire et, de ce fait, retenus, ne recouvrent aucun des biomarqueurstumoraux macromoléculaires UPA PAI1 déjà évalués comme de niveau d’évidenceI à l’exception des RO. Cependant, si la sélection par ce type d’analyse semble pro-metteuse, toute la démarche d’évaluation et validation que nous avons précédem-ment décrite reste à faire.

La méthodologie de l’expertise bio-informatique et statistique associée au déve-loppement des techniques analytiques multifactorielles est en pleine expansion. Uneapproche critique des résultats actuels a été faite récemment et attire l’attention surl’importance d’une conduite raisonnée des utilisations et développements pour


obtenir des résultats comparables, si ce n’est identiques, à travers différentes tech-niques analytiques du transcriptome (202-204).

Puces ADN

Pour l’analyse d’altération structurale, les puces ADN sont des outils qui peuventfonctionner dès maintenant dans les laboratoires de biologie médicale de transfert.Le système Affymetrix est déjà utilisé (Aarhus University Hospital, Danemark) pourl’analyse des mutations p53 et la polymorphisme individuel des enzymes du méta-bolisme oxydatif CYP. Toutefois, l’investissement est extrêmement lourd, la sensibi-lité absolue est moyenne, la sensibilité relative est faible, le contingent tumoral nedevant pas représenter moins de 50 % de la cellularité du prélèvement.

Comme les autres méthodes, sa précision n’est pas absolue (des faux positifs ontété détectés dans l’évaluation actuelle). Cependant, des progrès technologiquesd’automatisation et de détection font que plusieurs compagnies concurrentesentrent dans ce champ d’expertise à visée clinique.

Technologie de PCR en temps réel

La technologie de PCR en temps réel présente, par rapport aux méthodes standardsde PCR, les avantages scientifiques et techniques suivants :– elle permet l'enregistrement de la cinétique d'amplification en temps réel. La

quantification est réalisée au seuil initial de l'amplification et présente une excel-lente reproductibilité. Dans les méthodes standards de PCR, la quantification sefait à des temps extrapolés à partir d'études préliminaires, ce qui peut être à l'ori-gine d'erreurs importantes et imprévisibles, car on préjuge d’une réaction enzy-matique que l’on ne maîtrise pas ;

– la spécificité de la sonde pour la séquence amplifiée entre les deux amorces choi-sies informe sur la spécificité du produit amplifié et permet d'éviter les étapes fas-tidieuses de séparation des produits de réaction (électrophorèse en gel, transfertsur membrane) et de marquage radioactif des produits ;

– le développement de toutes ces techniques ayant une visée d’évaluation et de vali-dation pour une application clinique diagnostique doit être fait dans le cadre despratiques et notions de qualité du Guide de bonne exécution des analyses (GBEA)et faire appel à un appareillage compatible avec celles-ci. Dans le cadre d’une uti-lisation fréquente et multi-manipulateurs, la PCR quantitative en temps réel est latechnique de PCR qui met à l’abri d’un minimum de contaminations acciden-telles du fait de son développement, jusqu’à la phase analytique en milieu clos etpeut faire, de ce fait, l’objet d’une certification CE IVD (In Vitro Diagnostic). Denombreuses publications ont évalué le potentiel technique et les limites de la PCRquantitative et ont établi des recommandations pour une utilisation fiable etreproductible (188). Cette technique, contrairement aux puces ARN, pourraitéventuellement être utilisée non seulement pour des échantillons cryopréservés,mais également pour du matériel archivé en paraffine. Cependant, cette utilisationdoit être encadrée par de multiples contrôles et assurances qualité pour être réel-


116 Cancer du sein

lement évaluée. Enfin, dans les prélèvements pauci-cellulaires, inférieurs à5 000 cellules, la PCR quantitative se révèle la seule technique utilisable.

Conclusion Dans l’évolution potentielle à partir de tests LOEI « gold standards » actuels vers destests pluriparamétriques, soit protéomiques, soit de biologie moléculaire, il estimportant de rappeler que toutes les étapes d’évaluation et validation que nous vousavons exposées en début de cette revue générale sont, en fait, à franchir en ce quiconcerne la validation de ces nouvelles approches analytiques.

En effet, les résultats obtenus par techniques biochimiques/protéomiques quenous avons exposés en partie ne sont pas transposables pour préjuger ou sélec-tionner des marqueurs de biologie moléculaire. Si les protéines sont effectivementles acteurs directs des fonctions cellulaires normales ou pathologiques, les tauxd’ARN ne sont pas corrélés linéairement au taux de protéines dans un très grandnombre de cas, ceci étant dû au temps de turn-over spécifique de chaque ARN, aurendement de traduction, de processus de maturation, de sauvegarde de stockageintermédiaire de certains ARN.

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