apcellia®. cD4"CD8c' : . une nouvelle m thode mmunoenzymahque

de d termination des sous-populations de lymphocytes T en sang complet

D. CARRI[~RE *, J.-P. V E N D R E L L ** C. F O N T A I N E ~' A. J A N S E N * M. L A P R A D E *, R. J U I L L A R D **~ et B. P A U * " * "

RI~SUMF: SUMMARY

La numerat ion des lyrnphocytes T-CD4 et T-CD8 est un exarnen important pour le suivi clinique des pat ients infect~s par le VIH-1. Les auteurs ont d~velopp~ Capcellia ~ CD4-CD8 sang total, qui est une rn~thode nouvelle pour la d~terrnination des cellules T-CD4 et T-CD8. Pour la r~alisation en laboratoire, les ~chantillons de sang, pr~lev~s sur l 'anticoagulant EDTA, sont rnis en presence de billes rnagn~tiques qui se f i xen t rapidernent et sp~cifiquernent sur la surface des cellules T. Les cel- lules T sont ensui te s~par~es des autres ~l~rnents du sang dans les cupules d 'une rnicroplaque de dosage, associ~es d des airnants ; un anticorps anti-CD4 ou un anticorps anti-CD8, rnarqu~ ~ la peroxydase, d~tecte enfin l 'une ou l'autre des deux sous-populations de cellules T.

La quantification des cellules T est obtenue par cornpa- raison ~ des ~talons stables, prepares ~ partir de cel- lules T hurnaines lyophilis~es. Ces ~talons, pr~alablernent calibres par la rn~thode de cytorn~trie en f lux et d'h~rna- tologie, perrnet tent d'exprirner les r~sultats du dosage en nornbres de cellules T-CD4 ou T-CD8 par rnicrolitre de sang. Le coeff icient de correlation entre les cornptages obtenus avec Capcellia ® et la cytorn~trie en f lux est 0,94 et 0 ,82 pour les T-CD4 et les T-CD8 respectivernent. Finalernent, le dosage Capcellia ® est une rn~thode pr~- cise, sensible, facile a rnettre en oeuvre sans investisse- rnent Iourd et sans compe tence en cytorn~trie en f lux.

MOTS-CLf:S

cornptages des lymphocytes T - ELISA - rnol~cules CD4 ou CD8 - rnaladie due au VIH-I.

T-CD4 and T-CD8 cell counts const i tute an important biological parameter for diagnosis and follow-up o f HIV- l - infected patients.

The authors have developed Capcellia ® CD4-CD8 which is a manual method for CD4 and CD8 T-cell quantita- tion. Blood samples, collected on EDTA are mixed with magnetic beads which rapidly and specifically bind to T-cell surface. The T-cells are then separated f rom other blood e lements by using a magnet. Finally, an anti-CD4 or anti-CD8 antibody, labeled with peroxidase, detects either population o f T-cells. CD4 or CD8 T-cell quantita- tion is achieved by comparison to reference standards prepared with calibrated freeze-dried human T cells. Resul ts are therefore expressed as cell counts per rnicroli- ter blood. The correlation coeff icient between Capcellia @ and f low cytornetry counts is 0.94 and 0 .82 for CD4 and CD8 cells, respectively.

Finally, the Capcellia ® assay is an accurate and highly sensit ive technique, easy to per form without heavy invest- rnent nor expert ise in f low cytornetry.

KEY-WORDS

T lyrnphocytes counts - ELISA - CD4 and CD8 mole- cules - HIV-1 disease.

* Laboratoire d'irnmunodiagnostic Sanofi Recherche -Mon tpellier. ~* Laboratoire d'immunologie HSpital Lapeyronie - C.H.U. de Montpellier. ..... Sanofi Diagnostics Pasteur - Marnes-la-Coquette. .... CNRS-UMR 9921 - Facult~ de pharmacie de Montpellier.

(1) Capcellia® est un produit fabriqu~ par Sanofi Diagnostics Pasteur (Marnes-la~Zoquette - France).

TIRE-S A PART : M. le Dr D. CARRIERE Sanofi Recherche Laboratoire d'immunodiagnostic 371, rue du Pr-Joseph-Blayac 34184 MONTPELLIER CEDEX 04

article regu le 23 mai, accept~ le 31 juillet 1996.

Revue fran~aise des laboratoires, novembre 1996, N ° 288 77

Introduction

Le d@nombrement des lymphocytes T-CD4 du sang e s t u n examen h@matologique essentiel pour le suivi cl inique des patients infect@s par le virus de l ' immu- nod@ficience humaine (VIH). En effet, le hombre des cellules T-CD4 par microl i t re de sang est pris en compte pour pr@ciser le stade cl inique de la maladie (2), pour estimer ie pronostic (3) et pour @valuer les th@rapeutiques antir@trovirales ou de lutte contre les maladies opportunistes. En outre, en dehors de l ' infect ion par le VIH, le d@nombrement des lympho- cytes T-CD4 et T-CD8 est aussi indiqu@ chez les patients atteints de dysfonctionnements immunitaires ou apr@s transplantat ion d'organes.

FIGURE la Principe du fonctionnement de l'immunodosage Capcellia ®

CD4-CD8 sang total

Anltoorps-peroxydMe anll-CD4 ou anti-OD8

Lymphocyte T ~ ~ " Mok~cules 0134 ou 008

, . , . j Parlicules magn6tiques - - I ~,-~tS=o,-,o,,'~ Mol6cule 002

v I ~ l ~tJcoms anti.-CD2

~\\\\\\\\\\\N L Aimant ,x~\\\\\\\\\\\\"~

La s@paration immunomagn@tique des lymphocytes T e s t obtenue en deux minutes ~ l'aide de microparticules magn@tiques portant un anticorps monoclo- nal anti-CD2 sp@cifique de l'antig@ne CD2 de la surface cellulaire. La d&tection immunoenzymatique des lymphocytes T-CD4 et T-CD8 est obtenue par un anti- corps monoclonal de sp@cificit@ anti-CD4 ou anti-CDS, coupl@ ~ la peroxydase.

FIGURE lb Observation au microscope @lectronique de la surface

d'un lymphocyte T portant des particules magn@tiques (PM) fix~es sur les mol@cules du CD2

Les particules d'or (PO), associ@es fl l'anticorps anti-CD4 utilis& dans le dosage Capcellia ®, marquent la pr@sence des mol@cules du CD4. Pour la pr&paration de microscopie @lectronique, les cellules ont @t@ s@par@es du sang par les parti- cules magn&tiques (PM) puis d@os@es pendant deux minutes dans des pulis de dosages associ@s & des aimants. Apr&s retrait du sang r@siduel, les cellules ont @t@ incub@es avec l'anticorps anti-CD4 adsorb@ sur des particules d'or. Elles ont @t@, ensuite, fix@es au glutarald@hyde fl 2,5 % dans du tampon cacodylate, lav@es puis fix@es fl l'acide osmique & 1% dans le m@me tampon. Les inclusions ont @t~ r@alis@es en Epon et les coupes observ@es avec un microscope @lectro- nique Jeol type 1010 (grandissement : x 30 000).

La m@thode de r@f@rence la plus utilis@e pour le d@nombrement des cellules T-CD4 et T-CD8 du sang p@riph@rique met en oeuvre un compteur d'h@matolo- gie pour la d@termination du hombre total des leuco- cytes et du pourcentage des lymphocytes parmi les leucocytes (formule leucocytaire) et un cytom@tre en f lux qui d@termine les pourcentages des lymphocytes T-CD4 ou T-CD8 parmi les lymphocytes (immunoph@- notypage). Le hombre de cellules T de chacune des deux sous-populations est calcul@ & part i r du produit de ces trois mesures. De r@cents cytom@tres ont main- tenant la possibilit@ de rendre leurs r@sultats de num@ration en valeur absolue, sans recours & l'h@ma- tologie. Les m@thodes non cytofluorom@triques de d@nombre- ment des lymphocytes (7), tout comme la cytom@trie en flux, reposent sur l ' immunomarquage des mol@- cules de la surface de la cellule & l 'aide d'anticorps monoclonaux. Cependant, contrairement & la cytom@- tr ie en flux, les m@thodes non cytofluorom@triques ne n@cessitent pas de compteur d'h@matologie ni d'@qui- pement on@reux pour leur r@alisation. L' immunodo- sage Capcell ia ® CD4-CD8 d@velopp@ pr@c@demment (1, 4) d@terminait ies concentrations du CD4 et du CD8 et les hombres correspondants des lymphocytes T-CD4 ou T-CD8 & part i r de la suspension des cel- lules mononucl@@es s@par@es par centr i fugation du sang sur un gradient de Ficoll. Le dosage Capcellia ®, CD4-CD8 pr@sent@ dans ce travail permet la d@termi- nation directe, & part i r du sang complet, du nombre de lymphocytes T-CD4 ou T-CD8. Ce dosage met en oeuvre un support micropart iculaire magn@tique poro tant un anticorps monoclonal de sp@cificit@ anti-CD2. Les particules magn@tiques sont ainsi cibl@es sp@cifi- quement sur les cellules T, ce qui permet leur s@para- t ion s@lective des autres @l@ments figur@s du sang l 'aide d'aimants et sans recours & la centrifugation. Les mol@cules CD4 ou CD8 associ@es & la surface des cellules sont ensuite d@tect@es et marqu@es par deux anticorps de sp@cificit@ anti-CD4 ou anti-CD8, cou- pi@s & ia peroxydase. Nous r@sumons ici des @l@ments de val idation et d'@valuation de ce nouveau dosage sur une populat ion de sujets sains e t u n e populat ion de patients infect@s par le VIH-1.

I. Description de la technique du dosage

Le principe du fonctionnernent de l'irnmunodosage Capcellia ® CD4-CD8 sang total est montr@ sur les figures 1 a et lb. Le dosage~ de type ELISA, est r@alis@ en moins d'une heure et il comprend les @tapes suivantes : - le m@lange de 100 pL de sang et de 500 pL d'une suspen- sion de particules rnagn@tiques (2 min) ; - la distribution de 100 IJL ou de 50 laL (dosages des T-CD4 ou des T-CD8) du m@lange pr@c@dent dans des cupules de plaques de rnicrotitrations associ@es fl un cadre portant des aimants (figure 2), suivie de l'aspiration du liquid® r@siduel (2min) ;

- l 'apport de 100 I~L de la suspension de l'anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 coupl~ fl la peroxydase (incubation 20 min) ; - le lavage des cupules suivi de l 'apport de 100 pL du m@lange substrat plus chromog@ne (H202 et t@tram@thylbenzidine) afin de r@v@ler l'activit@ de la peroxydase associ@e aux cellules (incubation 20 min) ; - la distribution de 50 pL d'une solution d'H2SO 4 suivie de la mesure des absorbances des cupules fl l'aide d'un spectropho- tom&tre r@gl& ~ la Iongueur d'onde de 450 nm ; - le calcul des nombres de lymphocytes T-CD4 ou T-CD8 par r@f@rence fl deux gammes d'@talonnage calibr@es en nornbres de cellules T par microlitre de sang.

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2. Validation de l'immunodosage

1. Efficacit~ de la capture des lymphocytes par la phase magn~tique microparticulaire On a mesur~ par cytom~trie en flux les pourcentages des lym- phocytes T-CD2, T-CD4 et T-CD8 et des monocytes CD14 dans les ~chantillons de sang non trait~s (contr61es 100 %) ou trait~s pendant deux minutes avec la suspension des particules magn~tiques puis transfert dans les cupules de dosage asso- cites aux aimants. Les rendements de capture des lympho- cytes CD2+, CD4+ et CD8+ sont en moyenne de 99 %, 99 % et 94 %, respectivement, alors que les monocytes ne sont pas significativement captures (pourcentages des mono- cytes identiques dans des ~chantillons de sang contr61es ou trait~s (tableau [). Les dosages des cellules T-CD4 et T-CD8 sur sangs contr61es ou trait~s par la phase magn~tique confir- ment parfaitement les forts rendements de capture des lym- phocytes T dans le dosage (rendements > 96 %). Finalement, ces ~valuations d~montrent la capture s~lective des lympho- cytes T, alors que les monocytes, porteurs des mol~cules CD4, ne sont pas retenus dans le dosage. Ainsi, Capcellia ® d~ter- mine seulement les mol~cules CD4 d'origine lymphocytaire.

TABLEAU I Efficacit6 de ia s~paration des cellules T par la phase magn~tique

du dosage Capcellia ®

.............................. ........................... I ................................................... 1 i65,5 a 0,5 22,4 0,2 18,2 2 60,8 53,3 2 80,9 0,4 38,6 0,3 17,0 0,6 86,0 80,8 3 72,6 0,8 21,1 0,2 27,6 1,2 71,4 69,4

a Les pourcentages des cellules T et des monocytes oat ~t~ d~termin~s par cytc m~trie en flux dans trois ~chantillons sanguins avant (-) ou apr~s (+) traitemer par les particules magn~tiques puis contact avec les aimants (premiere ~tape d dosage Capcellia®). Pour l'analyse par cytom~trie en flux, les cellules ont ~t marquees en sang total avec les anticorps pendant 20 min & 4°C puis trait~ par un tampon de lyse des h~maties (NH4CI). On a utilis~ les anticorps su vants : Leu5b-FITC (anti-CD2), Leu4-FITC (anti-CD3), Leu3a-PE (anti-CD4 LeuM3-PE (anti-CD14), CD8-PE (anti-CD8).

FIGURE 2 Clich6 photographique d'une plaque de microtitration associ~e

au cadre magn~tique

2. Lin&arit6 des mesures et seuils de d6tection des lymphocytes T La lin~arit~ de la r~ponse obtenue pour les dosages des cel- lules T-CD4 et T-CD8 de diff~rents volumes de sang, confirme l'exactitude de la m~thode sur l'~chelle d 'analyse (figure 3). Les valeurs seuils des concentrations cellulaires mesur~es significativement par le dosage Capcellia ® ont ~t~ recherch~es sur des ~chantillons de sang dilu~, pr~alablement analys~s par la m~thode de r~f~rence. Les dosages sont encore significatifs pour une suspension ~ 14 cellules T-CD4 par microlitre : absorbances dosages = 0 ,116 + 0 ,006 (n = 11); absorbances non sp~cifiques = 0 ,085 _+ 0 ,007 (n = 11) (p < 0 ,0001 par le test de Student). Les dosages des lymphocytes T-CD8 sont significatifs (p < 0,0001) pour une suspension & 15 cellules par microlitre : absorbances dosages = 0,101 _+ 0 ,008 (n = 12), non sp~cifiques = 0 ,074 _+ 0 ,014 (n = 12). Pour les ~chantillons de sang provenant d'enfants, plus riches en lymphocytes que les ~chantillons d'adultes, le protocole de dosage doit ~tre adapt~ en introduisant seulement 50 I~L de sang sur les particules magn~tiques, au lieu de 100 IJL de sang introduits dans le protocole standard. Les valeurs des nombres

Apr~s le retrait d'une barrette (B), on peut observer les huit aimants (A) prob~ blement associ~s & chacune des huit cupules de la barrette retiree.

FIGURE 3 Dosages en triplicats des lymphocytes T-CD4 (A) et T-CD8 (B) dans diff~rents volumes (1,25 A 50 pL)

d'un 6chantillon de sang comprenant 1130 T-CD4 et 1160 ToCD8 par pL de sang

I,L~) T A

/ ',Z I"

°!o,. Volumes de sang par dosage Volumes de sang par dosage

Les signaux sont significatifs pour un ~chantillon ~quivalent ~ 14 cellules T-CD4 et 15 cellules T-CD8 par gL de sang (test de Student p < 0,0001). La lin~arit~ de la r~ponse obtenue d~montre l'exactitude des dosages sur l'~chelle d'analyse.

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TABLEAU II Dosages Capcellia ® CD4-CD8 sang total

coefficients de variation des d6terminations des lymphocytes T CD4 ou T CD8 de trois 6chantillons de sang de sujets sains

et de trois 6chantillons de patients infect6s par le VIH-1

1 VIH- 2 VIH- 3 VIH- 4 VIH+ 5 VIH+ 6 VIH+

550 7,8 980 6,7 1135 3~8 1190 3,2

756 5,1 449 4,7 357 3,2 1532 6,3 359 7,8 988 3,6 123 6,3 805 5,0

Pour chacun des echantillons de sang, les coefficients de variation (CV) ont ete calcules fl partir de 10 determinations Capcellia® (dosages en "inter-assays").

de cellules T d&termines dans ces conditions sur les courbes d 'e talonnage sont alors fl multiplier par deux.

3 . F o n c t i o n s d ' 6 t a l o n n a g e s

Les courbes d 'e talonnage sont &tablies & partir des valeurs d 'absorbances obtenues en dosant le CD4 et ]e CD8 de quatre

&talons prepares fl partir de cellules T-CD4 et T-CD8 precom- plexees fl des particules magnetiques et lyophilis&s. Ces 6ta- lons ont &t& calibr&s par le fabricant en hombres de cellules T-CD4 ou T-CD8 par microlitre de sang, par comparaison avec des 6chantillons sanguins analyses par la cytometrie en flux et l 'hematologie. On a utilis& pour le calibrage 19 6chan- tillons sanguins provenant de donneurs sains et de patients infect&s par le VIH-1. La figure 4 montre un exemple des deux courbes d 'etalonnage utilisees pour les d&terminations des nombres de lymphocytes T-CD4 et T-CD8 par microlitre de sang.

4 . S p 6 c i f i c i t 6 e t p r 6 c i s i o n des d o s a g e s des l y m p h o c y t e s T - C D 4 et T - C D 8 des 6 c h a n t i l l o n s de s a n g

La specificit6 des valeurs des absorbances des dosages des 6talons et des &chantillons de sang a 6t6 verifiee en melan- geant les conjugues anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 couples fl la peroxydase et un exc&s de 100 fois de l 'anticorps de re@me sp&cificit&, non marqu&. Dans ces conditions, l'exc&s d'anti- corps non marqu& reduit de plus de 98 % toutes les valeurs des absorbances des dosages.

FIGURE 4 Courbes d'6talonnage reliant le signal d'absorbance et la concentration en cellules T-CD4 (A) et T-CD8 (B)

E 2,000 2,o00-

8 1,000 8 1,000

0 ,500 0 ,500

I " "' '

4 1414

Les courbes d'etalonnage sont obtenues fl partir des absorbances des cupules de dosage d'une microplaque, dans lesquelles on introduit les cel- lules T de reference portant du CD4 et du CD8 fl leur surface. Les differents etalons, conserves sous la forme lyophilisee, sont rehydrates au moment de l'emploi et peuvent @tre utilises pendant 45 jours.

FIGURE 5 Corr61ation entre les num6rations des lymphocytes T CD4 et des lymphocytes T CD8 d6termin6es par Capcellia ®

et par cytom6trie en flux (m6thode de r6f6rence)

1600 °

1400 o

1000 _ %° " ' y o

i •o • ~ 0 • ,0,

0o4 BErn, , , ~ d l ~ l •

200 ~ m m- • n = 185 r = 0,945

/ a T - " O ~ I , I f 0 500 1000 1500

Capcellia CD4 - CD8

x

c -

1800 • • | •

o 1400 • •

1200 o

1000 nm •o I I I e 800 *°,x, %•

0 "t'/" • GD8 400 • I ~ n=111

200 • r = 0,82

0 I I I I

0 500 1000 1500 2000 Capcellia CD4 - CD8

• Donneurs sains - Patients infectes par le VIH-1.

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Afin d'evaluer la precision des dosages, on a mesur~ 10 lois les lymphocytes T-CD4 ou T-CD8 d'une s~rie d'~chantillons de sang (trois ~chantillons provenant de sujets sains et trois de patients infect~s par le VIH-1). Les coefficients de variation des diff~rentes mesures ~taient compris entre 3,2 et 7,8 % selon les ~chantillons analys~s (tableau II).

5. R6sul tats d 'ana lyses d '6chan tU lons sangu ins et corr61at ion avec la m 6 t h o d e de r6 f6 rence

L'~valuation des lymphocytes T-CD4 sur 185 ~chantillons sanguins provenant de sujets sains (n = 52) ou infect~s par le VIH-I (n = 133) a montr~ un coefficient de correlation de 0,94 entre la m~thode standard de cytom~trie en flux et le dosage Capcellia ® CD4-CD8 sang total (figure 5). L'analyse des lymphocytes T-CD8 montrait une correlation ~ 0,82 entre la m~thode standard et le dosage Capcellia ® CD4-CD8 sang total (n = 111) (figure 5).

Conclusion

Le dosage Capcell ia ® CD4-CD8 sang total, 6valu6 sur une large s6rie d'6chanti l lons sanguins, a donn6 des r6sultats de comptages des lymphocytes qui corr61ent 6troitement avec ceux obtenus par la m6thode de r6f6rence, mettant en oeuvre la cytom6trie en f lux et le d6nombrement par un compteur d'h6matologie. Ce nouveau test est ais6 ~ r6aliser dans les laboratoires 6quip6s seulement d 'un spectrophotom6tre pour les mesures des absorbances (dosages de type ELISA) ; i l ne n6cessite pas d'exp6rience en analyse cellulaire par cytom6trie en flux. Pour le dosage Capcell ia ®, la s6paration des lympho- cytes T du sang est obtenue simplement par la mise en oeuvre de particules magn6tiques anti-pan T et d'un cadre magn6tique associ6 6 la plaque de microti- tration. L'association d'aimants aux cupules de dosage 6ri te tout recours 6 des centri fugations pour l 'ex6cution des dosages. La sp6cificit6 de r6tent ion des lymphocytes T-CD4 ou T-CD8 exclut totalement du dosage la prise en compte des monocytes capables aussi d 'expr imer la mol6cule CD4 membranaire. Ainsi, Capcell ia ® CD4-CD8 d6termine seulement les mol6cules du CD4 associ6es aux lymphocytes T-CD4 et exclut les mol6cules du CD4 associ6es 6 la mem- brane des monocytes, contrairement 6 la m6thode de num6ration cellulaire mettant en oeuvre la lyse des cellules du sang, suivie du dosage des moi6cules du CD4 solubilis6es (6). Capcellia ® d~termine significativement des ~chan- tillons de sang comprenant seulement 15 lymphocytes

T-CD4 ou T-CD8 par microl i tre ; cette tr6s grande sensibilit6 permet le suivi clinique des patients infect6s par le VIH-1 jusqu au stade du sida tr6s avanc6 ; en outre, la qualit6 analytique du dosage permet d'appr6- cier les effets des th6rapeutiques antir6trovirales, sou- vent associ6s /i de faibles remont6es du nombre de lymphocytes T-CD4 circulants. La mise en oeuvre d'anticorps monoclonaux anti-CD4 ou anti-CD8 pos- s6dant de fortes valeurs des constantes d'association l '6quil ibre (K > 10 l° M 1) a permis d'obtenir ces perfor- mances 61ev6es en un d61ai de temps limit6 ~ 20 minutes pour la d6tection immunologique. En prat ique de laboratoire, le dosage Capcellia ® est r6al is6/ l l 'aide de barrettes mobiles comprenant huit cupules de dosage ; cette disposit ion apporte uue grande souplesse d'ut i l isat ion permettant, par exemple, l 'analyse d 'un 6 trois 6chantil lons de sang avec une seule barrette ou de dix-neuf 6chantil lons en uti l isant cinq barrettes associ6es sur un seul cadre d 'une plaque de microt i trat ion. De plus, le sang pr6- lev6 sur l 'ant icoagulant EDTA est util isable pendant 24 heures lorsqu' i l est gard6 & la temp6rature du laboratoire, ce qui permet de regrouper les analyses. La r6alisation des dosages est consid6rablement am6- l ior6e par l 'ut i l isat ion d'une pipette automatique huit canaux, pour les d6p6ts rapides des r6actifs et du l iquide de lavage ; de m6me, un "peigne" d'aspirat ion portant huit pointes associ6es, reli6 ~ une pompe vide ou & une t rompe & eau, permet une vidange ais6e et rapide des cupules. Finalement, l '6valuation du dosage Capcellia ® CD4- CD8 sang total, sur des 6chantil lons de sang de sujets sains ou de patients infect6s par le VIH-1, a permis de montrer une efficacit6 du dosage ELISA comparable celle de ia cytom6trie en flux. Cette nouvelle m6thode de quanti f icat ion des lymphocytes T pr6sente en outre les avantages suivants : - des cofits r6duits pour la mise en oeuvre, comparativement /~ ceux de la m6thode de r6f6rence combinant la cytom6trie et l 'h6matologie ; - l 'absence d'investissement lourd pour la r6alisation en routine ; - une simplicit6 d'uti l i- sation ; - une r6duction de la variabil i t6 des r6sultats des num6rations par rapport 6 la m6thode de r6f6- rence qui combine les variabilit6s individuelles des mesures du compteur d'h6matologie et du cytom6tre en f lux (5) ; - des d61ais de r6ponse courts (environ 1 heure) pour 1 6 19 6cbantil lons dos6s en une fois.

REMERCIEMENTS

Les auteurs remercient Isabelle Pages pour les analyses en cyto- mEtrie en flux, Christine Benoit et Bernadette Buser pour la rEali- sation des dosages, Alain Rouaud et Luc Beck pour les mesures en hEmatologie, Guy Mathieu pour les analyses statistiques et Catherine Goubet pour les preparations de microscopie Electro- nique.

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