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1 UNIVERSITÉ FRANÇOIS RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE SSBCV UMR INRA-CNRS-Université de Tours Physiologie de la reproduction et des comportements Microenvironnement et dynamique des réseaux neuroendocriniens THÈSE présentée par : Sarah GELLER soutenue le : 18 Avril 2013 pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François – Rabelais de Tours Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie / Neurosciences Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I : Rôle dans le développement de ces neurones THÈSE dirigée par : Tillet Yves Directeur de recherche, INRA, Tours-Nouzilly THÈSE co-encadrée par : Vaudin Pascal Maître de conférences, université F. Rabelais, Tours RAPPORTEURS : Jourdan François Directeur de recherche émérite, Université de Lyon I, Lyon Prévot Vincent Directeur de recherche, INSERM, Lille JURY : Jourdan François Directeur de recherche émérite, Université de Lyon I, Lyon Prévot Vincent Directeur de recherche, INSERM, Lille Risold Pierre-Yves Chargé de recherche, INSERM, Besançon Tillet Yves Directeur de recherche, INRA, Tours-Nouzilly Vaudin Pascal Maître de conférences, université F. Rabelais, Tours

Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

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Page 1: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

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UNIVERSITÉ FRANÇOIS – RABELAIS DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE SSBCV

UMR INRA-CNRS-Université de Tours

Physiologie de la reproduction et des comportements

Microenvironnement et dynamique des réseaux neuroendocriniens

THÈSE présentée par : Sarah GELLER

soutenue le : 18 Avril 2013

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François – Rabelais de Tours

Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie / Neurosciences

Caractérisation des cellules gliales olfactives

associées aux neurones à GnRH-I :

Rôle dans le développement de ces neurones

THÈSE dirigée par :

Tillet Yves Directeur de recherche, INRA, Tours-Nouzilly

THÈSE co-encadrée par : Vaudin Pascal Maître de conférences, université F. Rabelais, Tours

RAPPORTEURS : Jourdan François Directeur de recherche émérite, Université de Lyon I, Lyon Prévot Vincent Directeur de recherche, INSERM, Lille

JURY : Jourdan François Directeur de recherche émérite, Université de Lyon I, Lyon Prévot Vincent Directeur de recherche, INSERM, Lille Risold Pierre-Yves Chargé de recherche, INSERM, Besançon Tillet Yves Directeur de recherche, INRA, Tours-Nouzilly Vaudin Pascal Maître de conférences, université F. Rabelais, Tours

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A papilou, manou, babé et pépé,

Au poisson rouge et ses parents

A Doki et Lodie

A France, vers qui mes pensées se tournent…

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Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury : Francois Jourdan, Pierre-Yves Risold, Vincent prévot, Pascal Vaudin et Yves Tillet d’avoir consacré un peu de leur temps pour évaluer mon travail de thèse. Vincent merci de m’avoir fait découvrir la communication neurone à GnRH et cellules gliales et merci surtout pour votre soutien professionnel. Je tiens à remercier mes directrices de thèse. Yves, pour vos corrections, vos conseils et nos discussion scientifique mais également merci votre présence et votre soutien lors de ces derniers mois difficiles Pascal merci de m’avoir donnée l’occasion de faire cette thèse Je tiens également à remercier Anne Duittoz pour nos conversations scientifiques, votre implication dans la correction des articles scientifiques Je remercie également l’ensemble des membres de mon comité de thèse pour leurs conseils: Joelle Cohen-Tannoudji, Rémi Houlgatte, Anne Duittoz, Pascal Vaudin et Yves Tillet Merci à Didier Lomet pour ces trois ans de pcr et ces derniers mois d’histologie, je suis persuadée que ça te manque déjà… merci surtout pour ton soutien moral, nos conversations, ton implication scientifique, ta curiosité bibliographique, pour nos balades à Nantes ! Merci à Monique Ottogali qui à mon grand regrées est partie beaucoup trop tôt du laboratoire pour se consacrer à ses abeilles, elles en ont de la chance ! Merci de m’avoir appris les dissections de placodes olfactives, merci pour ces deux premières années de thèse, nos conversations, nos mardi philosophie, les vendredis FACS, et plus sérieusement merci pour les fromages de chèvres et le miel Merci à Alain Caraty pour l’anticorps qui m’a permis de faire mes triples marquages tant attendus, pour votre implication dans la caractérisation de cet anticorps, merci de m’avoir laissé votre porte grande ouverture et une oreille toujours attentive à mes questions. Une pensée toute particulière à Isabelle Franceschini pour nos discussions scientifiques, d’avoir partagé tes connaissances sur les OEC, ta bonne humeur, ton entrain, d’avoir su me rassurer aux moments de stress

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Je souhaite maintenant remercier différentes personnes avec qui j’ai partagées mes doutes, mes déceptions et qui m’ont toujours épaulées dans les moments de bonheur mais également dans les périodes difficiles que j’ai pu traverser pendant cette thèse : - Elodie pour toutes nos conversations scientifiques riches en émotion mais également pour ton amitié qui a se perdure avec l’éloignement Je tiens à remercier tout particulièrement Martine Batailler pour tellement de choses : d’avoir été là, de m’avoir encouragé et soutenu dans les moments les plus dures. Merci pour ces moments de pur délire, pour ton expertise. Je tiens également à te remercier pour tes conseils en histologie, pour la relecture de cette thèse, pour cette motivation et cet entrain scientifique, pour toutes nos conversations… - Marine merci pour cette année de colocation qui fut fort sympathique riche en émotion, j’ai su apprécié ton recul et ton sens du stratège, je suis sure que tu t’épanouiras à Poitier… -Vincent pour ton soutien, nos conversations, et merci d’avoir été un coach lors des nuits au labo pour le confocal - Vanessa pour m’avoir coaché pendant cette rédaction, pout ton aide ton soutien, pour tout ce que tu as pu faire pour moi, MERCI…..J’espère que tu trouveras le poste de tes rêves -Mathilde, Melanie, Margot, merci pour votre amitié, votre soutien, pour ces journées au labo, ces soirées au labo, ces nuits au labo, ces we au labo et surtout pour ces appéro pas au labo, ces repas au dehors du labo -Aux amoureux Vincent et Laura, merci pour ces explicatiosn de word vincent, merci pour tes relectures laure, j’espère que vous trouverez la thèse qui vous correcpond -Anthony merci de m’avoir soutenu et d’être toujours présent

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Résumé

Chez le mammifère la fonction de reproduction est sous le contrôle des neurones

hypothalamiques à GnRH-I. Au cours du développement embryonnaire ces neurones migrent

de la fosse nasale vers le cerveau. De nombreuses études s’intéressent aux facteurs impliqués

dans leur migration, mais l’influence de leur environnement cellulaire est très peu étudiée.

Nous avons émis l’hypothèse que les neurones à GnRH-I d’origine extra-cérébrale possèdent

un environnement gliale nécessaire à leur migration, connaissant le rôle de ces cellules dans

l’ontogenèse neuronale du cerveau. Nos résultats montrent que 1) les neurones à GnRH-I sont

associés à des cellules gliales au cours de leurs migrations nasale et télencéphalique 2) ces

cellules gliales sont des progéniteurs des cellules gliales olfactives engainantes qui se

différencient dans les régions rostrales au cours de la migration neuronale. 3) ces cellules

expriment des gènes codant pour des facteurs impliqués dans la migration de ces neurones. 4)

le transcriptome de ces cellules gliales est perturbé en présence d’un perturbateur endocrinien

œstrogèno-mimétique, et touche des familles de gènes impliquées dans les molécules

d’adhésions cellulaires nécessaire à la migration et à la régulation de l’activité des neurones à

GnRH-I.

Mots clefs : neurones à GnRH-I, cellules gliales olfactives engainantes, migration,

perturbateur endocrinien

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Résumé en anglais

GnRH-I cells control reproduction functions in mammals. These cells are extra cerebral since

they come from the nasal pit and migrate to the forebrain during embryonic development.

Numerous studies have described the influence of different molecules on the migration of

GnRH-1 neurons, however, the role of microenvironment cells remains poorly understood.

Considering the role of glial cells in the forebrain’s neuronal migration, we had hypothesized

that extra-cerebral GnRH-I neurons possess a glial environment necessary for their migration

from the nose to the brain. Our results demonstrated that 1) GnRH-I neurons are associated

with glial cells during their migration in the nasal septum and forebrain 2) These glial cells

are progenitors of olfactory ensheathing cells, and differentiated within the rostral regions

during neuronal migration. 3) These cells express genes encoding factors involved in GnRH-I

neurons migration 4) Glial cells transcriptome are disrupted with estrogen-mimicking

endocrine disruptor, and affects gene families involved in cell adhesion molecules necessary

for migration and activity regulation of GnRH-I neurons

Keywords : GnRH-I neurons, glial olfactory ensheathing cells, migration, endocrine

disruptor

Page 7: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

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Table des matières

Remerciements ......................................................................................................................... 3

Résumé ...................................................................................................................................... 5

Résumé en anglais .................................................................................................................... 6

Table des matières .................................................................................................................... 7

Liste des Abréviations ............................................................................................................ 10

Liste des publications ............................................................................................................. 11

Liste des communications affichées ...................................................................................... 12

Liste des communications orales et séminaires ................................................................... 13

Liste des tableaux ................................................................................................................... 14

Liste des Figures ..................................................................................................................... 15

INTRODUCTION .................................................................................................................. 17

I. La GnRH-I et la fonction de reproduction .............................................................. 19

I.1. L’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique .............................................................. 19

I.2. L’activité sécrétrice des neurones à GnRH-I et ça régulation .................................. 20

II. Le développement du système GnRH-I et du système olfactif ............................... 22

II.1. La genèse des neurones à GnRH-I et du système olfactif ........................................ 22

II.2. La migration des neurones à GnRH-I et la mise en place des nerfs du système

olfactif 26

II.3. La différenciation embryonnaire des neurones à GnRH-I ....................................... 41

II. 3. c. Une période clef dans la différenciation des neurones à GnRH-I : le passage de la

lame criblée de l’ethmoïde ................................................................................................... 43

III. Le système GnRH, une cible des perturbateurs endocriniens à activité

oestrogéno-mimétique ........................................................................................................ 44

III.1. Rôle des œstrogènes dans le développement et la régulation du système GnRH-I . 44

III.2. Le système GnRH une cible des perturbateurs endocriniens à activité œstrogénique

ou anti-œstrogénique ............................................................................................................ 45

III.3. Le 17α-éthinyloestradiol et le système GnRH ......................................................... 47

OBJECTIFS ............................................................................................................................ 52

RESULTATS .......................................................................................................................... 54

Chapitre 1 :Les neurones à GnRH-I en migration sont associés aux cellules gliales

olfactives .................................................................................................................................. 55

I. Contexte scientifique .................................................................................................... 55

Page 8: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

8

II. Article 1 : Les cellules gliales olfactives engainantes forment le

microenvironnement des neurones à GnRH-I en migration .......................................... 56

III. Article 2 :Maturation des cellules gliales associées aux s neurones à GnRH-I en

migration dans le septum nasal ......................................................................................... 58

IV. Conclusion du chapitre I .......................................................................................... 91

Chapitre 2 : ............................................................................................................................. 92

Le transcriptome des cellules gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I est-il

modulé par les Perturbateurs Endocriniens ? ..................................................................... 92

I. Contexte scientifique .................................................................................................. 92

II. Matériel et Méthode ................................................................................................... 95

II.1. Cultures de placodes olfactives GFAP-GFP et traitements au 17-α-éthinyloestradiol

95

II.2. Analyse par RT-PCR de l’expression des gènes codants pour les récepteurs aux

œstrogènes en condition contrôle ......................................................................................... 97

II.3. Procédure de puces à ADN ...................................................................................... 97

III. Résultats ................................................................................................................ 104

III.1. Les cellules gliales olfactives [GFP+] expriment les gènes codant pour les

récepteurs aux œstrogènes .................................................................................................. 104

III.2. Effet d’un traitement de 17-α-éthinyloestradiol sur la survie cellulaire des explants

et sur le pourcentage de cellules gliales [GFP+] : Analyse par FACS ............................... 104

III.3. Effet d’un traitement de 17-α-éthinyloestradiol (EE2) sur le transcriptome des

cellules gliales [GFP+] ....................................................................................................... 106

IV. Discussion du chapitre III.................................................................................... 116

IV.1. Les cellules gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I sont une potentielle

cible des œstrogènes et des xéno-œstrogènes .................................................................... 116

IV.2. Impact d’un traitement d’EE2 et d’E2 sur le transcriptome des cellules gliales

associées aux neurones à GnRH ......................................................................................... 117

V. Conclusion ................................................................................................................. 123

DISCUSSION ....................................................................................................................... 124

I. Les neurones à GnRH-I possèdent-il un environnement glial avant d’entamer leur

migration nasale ? ............................................................................................................... 125

II. Les cellules gliales olfactives engainantes accompagnent-elles les neurones à GnRH-I

dans l’APO et l’hypothalamus ? ......................................................................................... 126

Page 9: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

9

III. Les cellules gliales olfactives engainantes permettent-elles la migration des

neurones à GnRH-I ? .......................................................................................................... 127

IV. Les cellules gliales olfactives engainantes permettent-elles la différenciation et la

régulation de l’activité des neurones à GnRH-I ? .............................................................. 128

V. Ce système est-il dérégulé en présence d’un pertubateur endocrien ? ....................... 129

CONCLUSION ..................................................................................................................... 131

Bibliographie ......................................................................................................................... 132

ANNEXE ............................................................................................................................... 140

Page 10: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

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Liste des Abréviations

APO : aire pré-optique

AR : récepteurs à androgènes

BLBP: brain lipid biding protein

CN : cartilage nasal

CNC : crête neural cranienne

div: jours de cultures in vitro

E: stade embryonnaire

E2 : 17-β-oestradiol

EE2 : 17-α-éthinyloestradiol

EM : éminence médiane

Enr : enrichissement

EO : épithélium olfactif

ERα : récepteur à l’oestradiol α

ERβ : récpeteur à l’oestradiolβ

ERE: Estrogen Reponsive Element

OB: bulbe olfcatif

ESM : écart standart à la moyenne

FACS : Fluorescence activating cell

sorting

FC : facteurs de croissance

FG : facteurs de guidances

FSH : follicule stimulating hormone

GFP : green fluorescent protein

GFAP : glial fibrially acide protein

GnRH : gonadotropin releasing homone

LCE : lame criblée de l'ethmoïde

LH : Luteinizing Hormone

LP : lamina propria

Mole. Adh. : Molécule d'hadhésion

NFJ: jonction naso-cérébrale

NPN : nerf nasopalatin

NT : neurotransmetteurs

OEC : cellules olfactives gliales

engainantes

ONL: olfactory nerve layer

OR : récepteurs à odeurs

PE : perturbateurs endocriniens

PO : placodes olfactives

PSA-NCAM : protéine neuronale

d'adhésion cellulaire

RIN: RNA Integrity Number

RE : récepteurs à oestrogènes

SK : syndrome de Kallman

SM : second messager

SN : septum nasal

T : Témoin

TF : facteurs de transcriptions

TG : ganglion trigeminal

TGFb: Transforming Growth Factor beta

VN: voméronasal epithelium

VNN: nerfs voméronasaux

VT: vésicule télencéphalique

VNO: organe voméronasal

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Liste des publications

Geller S, Kolasa E, Tillet Y, Duittoz A.H and Vaudin P. Olfactory ensheathing cells form

the microenvironment of migrating GnRH-1 neurons during mouse development. Glia.

2013 Apr;61(4):550-66.

Geller S, Lomet Didier, Tillet Y, Caraty Alain, Duittoz A.H and Vaudin P Rostral

maturation of glial ensheathing cells associated to GnRH-I neurons during mouse

development, en préparation pour Eur J Neurosci

Geller S, Desroziers E, Ottogalli M, Lomet D, Georgelin C, Tillet Y, Vaudin P, Franceschini

I, Duittoz A.H. GnRH-1 episodic secretion is modulated by impairment of glial cell to cell

communication en preparation pour Glia

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Liste des communications affichées

Geller S, Kolasa E, Tillet Y, Duittoz A.H and Vaudin P Characterization of glial cells

during GnRH-1 neurons development. 8TH

FENS Forum of Neuroscience, 14-18 Juillet

2012, Barcelone, Espagne

Geller S, Ottogalli M, Georgelin C, Pillon D, Vaudin P, Duittoz A.H. L’ethinylestradiol

régule l’activité des neurones à GnRH in vitro via les récepteurs ERb et GPR30. 37ème

Colloque de la Société de Neuroendocrinologie, 28 -30 september 2011, Ville de Québec,

Canada

Geller S, Kolasa E, Duittoz A.H and Vaudin P. Characterization of glial cells during

GnRH-1 neurons development. 2nd

joint meeting of French and British Society for

Developmental Biology, 3-6 September 2011, Nice, France

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Liste des communications orales et séminaires

Sarah Geller : The role of glial cells in GnRH neuron development, invite par le Pr L.

Pellerin à la Faculté de biologie et demédecine Département des neurosciences

fondamentales, Lausanne, Suisse le 19 septembre 2012

Sarah Geller : Caracterisation of glial cells associated to GnRH neurons during

migration, 38ème

colloque de la société de Neuroendocrinologie, Banyuls sur Mer le 20

Septembre 2012

Sarah Geller : Rôle des astrocytes dans la maturation neuronale de la lignée

hypothalamique adulte GnV sécrétant la GnRH, invité par le Pr F. Pralong au Service of

Endocrinology, Diabetology and Metabolism, University Hospital and Faculty of Biology and

Medicine, Lausanne, Suisse le 24 Novembre 2009

Page 14: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

14

Liste des tableaux

Tableau 1 : Liste de facteurs impliqués dans la migration des neurones à GnRH-I au cours du

développement embryonnaire. ......................................................................................... 36

Tableau 2 : Listes des antigènes exprimaient par les cellules olfactives gliales engainantes

(OEC), par les cellules Schwann et les astrocytes. .......................................................... 39

Tableau 3 Quantité et qualité du matériel biologique utilisé pour étudié l’effet du 17-α

éthinyloestradiol sur le transcriptome des cellules gliales olfactives [GFP+]. ................ 96

Tableau 4 : Séquences des amorces de RT-PCR des gènes codant pour les récepteurs aux

œstrogènes ........................................................................................................................ 96

Tableau 5 : Tableau des annotations des signalisations biochimiques sous-exprimées dans les

cellules [GFP+] traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement .................. 109

Tableau 6 : Tableau des annotations fonctionnelles sous-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement ............................................ 109

Tableau 7 : Tableau des annotations fonctionnelles sur-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement ............................................ 111

Tableau 8 : Tableau des annotations des signalisations biochimiques sur-exprimées dans les

cellules [GFP+] traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement .................. 111

Tableau 9 : Tableau des annotations fonctionnelles sous-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 10jours à 100nM d’E2. ......................................................................... 115

Tableau 10 : Tableau des annotations fonctionnelles sur-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 10jours à 100nM d’E2. ......................................................................... 115

Page 15: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

15

Liste des Figures

Figure 1 : Schémas de cerveau de rongeurs adultes présentant la localisation des neurones à

GnRH-I (en vert). ............................................................................................................. 18

Figure 2 : Etapes de la neurulation primaire. ........................................................................... 23

Figure 3 : Images de film en « time-laps » illustrant la migration des cellules de la crête

neurale (CN, vert) avec les précurseurs de la placode olfactive (PO, rouge). ................. 23

Figure 4 : Schémas du développement de la placode olfactive de souris entre le 10,5 et al 12,5

jours de développement. ................................................................................................... 25

Figure 5 : Schémas illustrant la Croissance des axones olfactifs de l’épithélium olfactif (EO) à

la vésicule télencéphalqiue (VT) à l’aide la masse migratoire (mm) chez l’embryon de

souris âgés de E10,5 à E12. .............................................................................................. 27

Figure 6 : Schéma illustrant l‘innervation périphérique et centrale du système olfactif

accessoire (orange) et du système olfactif principale (violet) chez le rongeur adulte. .... 29

Figure 7 : Schéma du système voméronasal chez le rongeur. .................................................. 29

Figure 8 : Mise en culture et développement des explants de placodes olfactives de souris. .. 30

Figure 9 : Migration des neurones à GnRH-I au cours du développement embryonnaire chez

la souris. ........................................................................................................................... 33

Figure 10 : Représentation de la molécule du 17β-œstradiol et du 17α-éthinyloestradiol ....... 48

Figure 11 : Gammes de concentrations de 17α-éthinyloestradiol retrouvées dans les eaux de

différents pays et dans les traitements hormonaux. Adapté de Pillon et al 2012 ............. 48

Figure 12 : Schéma représentant les voies moléculaires utilisé par les récepteurs à l’œstradiol

(ER et GPR30) après fixation de leur ligand. ................................................................... 50

Figure 13 : Schéma général des études menées dans le chapitre 3 .......................................... 94

Figure 14 : Segments d'un électrophérogramme (Scroeder 2006) .......................................... 98

Figure 15 : Etapes d’analyses primaires des puces à ADN .................................................... 103

Figure 16 Expression des gènes codant pour les récepteurs aux œstrogènes par les cellules

gliales olfactives GFAP-GFP. ........................................................................................ 105

Figure 17 : Analyses des cultures d’explants de placodes olfactives par FACS. (A-B)

échantillons est représentée par un trait. Les cultures ont soit été traitées à l’EE2 pendant

48h EE2(48h) ou pendant 10jours EE2(10j) ; soit traitées à l’œstradiol pendant 10 jours

E2(10j). T(48h) et T(10j) représentent les témoins respectifs ........................................ 105

Page 16: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

16

Figure 18 : :Matrice de sondes illustrant le différentiel d’expression des échantillons de

cellules gliales [GFP+] traitées pendant 48h à l’EE2 par apport aux échantillons témoins.

........................................................................................................................................ 108

Figure 19 : Matrice de sondes illustrant le différentiel d’expression des échantillons de

cellules gliales [GFP+] traitées pendant 10 jours à l’EE2 et à l’E2 par apport aux

échantillons témoins ....................................................................................................... 113

Page 17: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

17

INTRODUCTION

Page 18: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

18

Figure 1 : Schémas de cerveau de rongeurs adultes présentant la localisation des neurones à

GnRH-I (en vert). A. Coupe sagittale d’un cerveau de rongeur adulte, illustrant l’aire pré-

optique (APO) en vert foncé, l’hypothalamus en vert claire et la base de l’éminence médiane

(EM) en rouge B. Agrandissement schématique d’une coupe sagittale d’hypothalamus : le

système porte hypophysaire est représenté en rouge. 3V : 3 ème

ventricule.

Page 19: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

19

I. La GnRH-I et la fonction de reproduction 1

Chez les mammifères, la fonction de reproduction est sous le contrôle d’un décapeptide, la 2

gonadolibérine de type I ou GnRH-I (Gonadotropin-Releasing Hormone). Chez les vertébrés 3

trois types de formes de GnRH codés par des gènes différents et présentant des variations des 4

séquances d’acides aminés o ont été décrit (Okubo et Nagahama 2008) : le GnRH-I, le GnRH-5

II et le GnRH-III. Le GnRH-II dit de poulet représente la forme la plus ancienne (Sherwood et 6

al 1993). Il est exprimé dans beaucoup d’espèces à la frontière entre le diencéphale et le 7

mésencéphale (Volkoff et al 1999) mais n’est pas toujours activité chez les mammifères 8

(Okubo et Nagahama 2008). Le GnRH-III présent uniquement chez le poisson téléostéen 9

contrôle la fonction de reproduction chez certaines espèces comme le zebrafish (Steven et al 10

2003). Les neurones qui produisent la GnRH-I et III sont d’origines extra-cérébrales. Ils sont 11

issus de la fosse nasale et migrent pendant le développement embryonnaire dans le cerveau 12

(Wray et al 1989, Schwanzel-Fukuda 1989, Abraham et al 2008). 13

I.1. L’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique 14

Les neurones à GnRH-I sont des neurones hypothalamiques dont leurs corps cellulaires sont 15

distribués de manière diffuse dans la région septo-préoptique chez les rongeurs (qui regroupe 16

le septum médian et l’aire préoptique APO) (Figure 1) (Baker and Yu 1976; Gross 1976; 17

Witkin et al. 1982) et l’hypothalamus médio-basal chez les primates. Leurs axones se 18

projettent à plus de 70% dans l’éminence médiane formant une voie hypothalamo-19

hypophysaire (Baker and Yu 1976; Gross 1976; Witkin et al. 1982) (Figure 1). 20

La GnRH-I est sécrétée sous forme de très courts épisodes de sécrétion, appelés pulses, dans 21

les vaisseaux portes hypothalamo-hypophysaires situés au sein de l’éminence médiane (EM) 22

(Clarke 2011). La GnRH-I est ensuite transportée par le sang porte-hypothalamo-23

hypophysaire vers les cellules de l’hypophyse antérieure, où elle induit la libération des 24

hormones gonadotropes, LH (Luteinizing Hormone) et FSH (Folliculo Stimulating Hormone) 25

(Clarke 2011). Ces deux hormones, en agissant sur les cellules cibles des testicules et ovaires, 26

induisent la gamétogenèse et la stéroïdogenèse. Les cellules de GnRH-1 sont donc une partie 27

intégrante de l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) (Figure 1). 28

Page 20: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

20

I.2. L’activité sécrétrice des neurones à GnRH-I et ça régulation 29

La pulsatilité de la sécrétion de GnRH-I est une caractéristique essentielle à sa fonctionnalité. 30

Cette sécrétion est induite par une activité rythmique endogène des neurones à GnRH-I qui est 31

associée avec une synchronisation de l’activité neuronale.En effet une sécrétion pulsatile sous 32

entend que chaque neurone ait une activité pulsatile de sécrétion et que au moins une partie 33

des neurones soient synchrones pour donner un pulse. Deux paramètres essentiels permettent 34

de définir la sécrétion pulsatile : 35

- La fréquence d’apparition du pulse qui est déterminée à partir des intervalles inter-pulse. 36

Cette fréquence est spécifique à chaque espèce, elle est de ~50minutes chez le mouton 37

(Duittoz and Batailler 2000) et le primate (Terasawa et al. 1999), ~30 minutes chez le rat 38

(Funabashi et al. 2000) et ~20minutes chez la souris (Constantin et al. 2009). 39

- L’amplitude des pulses qui correspond aux taux maximal d’hormone détecté auquel est 40

soustrait le niveau de GnRH de base. Ce paramètre est essentielle pour la survenue du pic pré-41

ovulatoire de GnRH, et donc de LH (Levine and Ramirez 1982) 42

La machinerie intracellualire reponsable de cette sécrétion pulsatile n’est pas clairement 43

définis, cependant il a été mis en evidence une correlation entre la synchronisation des 44

oscillations calciques et les « pulses » de GnRH-I chez le primate (Terasawa et al. 1999) et 45

chez la souris (Constantin et al. 2009) 46

Toutes modification des paramètres de sécrétions au niveau hypothalamique peut se traduire 47

par des troubles du déclenchement de la puberté, un hypogonadisme, ou encore des troubles 48

de la fertilité pouvant aller jusqu’à l’infertilité (Lopez et al. 1998). Chez la femelle, la 49

sécrétion de GnRH-I est également caractérisée par une fluctuation au cours de la vie 50

reproductive (période pré-pubère, cycle oestrien, reprise de la reproduction chez les animaux 51

saisonniers). 52

Cette rythmicité endogène des neurones à GnRH-I est sous l’influence de multiples contrôles 53

hormonaux et cellulaires. Ces neurones reçoivent des informations : 54

i) par voie humorale, en particulier des hormones stéroïdiennes gonadiques, dont l’œstradiol 55

(Herbison 1998), 56

ii) par voie nerveuse, au niveau des corps cellulaires des neurones à GnRH-I par des 57

afférences de neurones à GABA, à NPY, à Galanine mais aussi au niveau des terminaisons 58

nerveuses à GnRH-I par des neurones dopaminergiques (Herbison 1998). Ces dernières 59

Page 21: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

21

années il a également été mis en évidence la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I 60

par les neurones à Kisspeptine au niveau de l’APO (Patterson et al 2004) et de l’éminence 61

médiane (d'Anglemont de Tassigny et al. 2008) 62

iii) par des communications impliquant des cellules non neuronales telles que les cellules 63

gliales astrocytaires au niveau de la région préoptico-septale et les cellules épendymocytes 64

tanycytaires, qui bordent le troisième ventricule au niveau de l’éminence médiane (Prevot et 65

al. 2007). En effet plusieurs études mettent en évidence l’implication des facteurs 66

astrocytaires dans la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I, tel que l’IGF-1 (Insuline 67

Growth Factor type 1) (Hiney et al, 1996), le bFGF (Basic Fibroblast Growth factor) (Galbiati 68

et al. 2001) (Galbiati et al. 2002) (Ojeda et al. 2003), la PGE2 (Prostaglandine E2) (Barres et 69

al, 1991), et le TGFb (Transforming Growth Factor beta) (Melcangi et al. 1995) (Galbiati et 70

al. 1996). 71

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Page 22: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

22

II. Le développement du système GnRH-I et du système olfactif

II.1. La genèse des neurones à GnRH-I et du système olfactif

II. 1. a. La double origine des neurones à GnRH-I et du système olfactif

Il y a 24 ans, deux groupes ont mis en évidence l’origine extra-cérébrale des neurones

à GnRH-I chez la souris : ces neurones hypothalamiques migrent de la placode nasale au CNS

(Schwanzel-Fukuda and Pfaff 1989; Wray et al. 1989b). Depuis, la migration des cellules

GnRH-I et, chez le poisson des cellules GnRH-III, a été documentée pour de nombreuses

espèces (Caldani et al. 1995; Daikoku-Ishido et al. 1990; Ronnekleiv and Resko 1990)

(Mulrenin et al. 1999; Steven et al. 2003). Cependant, la localisation des précurseurs de ces

neurones endocrine n’a été élucidée que récemment. En effet une étude publiée au cours de

ma thèse a mis en évidence que ces neurones possédaient une double origine. A partir de deux

lignées de souris transgéniques complémentaires, de traçage génétique Rosa Cre-lox, le

groupe du Dr Susan Wray a démontré que 70% des neurones à GnRH-I provenaient de la

placode olfactive (PO), tandis que 30% étaient originaires de la crête neurale crânienne (CN)

(Forni et al. 2011b).

La crête neurale est un type cellulaire embryonnaire unique au vertébré qui dérive du neuro-

ectoderme et qui se trouve à la jonction entre la plaque neurale et l’ectoderme non neural

(épiderme) (Figure 2) (Baker and Bronner-Fraser 1997). Après le stade de neurulation

primaire, ces cellules de la CN se placent centralement entre le tube neural et l’épiderme

(Figure 2). Au stade précoce du développement, les cellules de la crête neurale subissent 2

vagues de migrations, une ventrale puis une dorsale. Cette seconde vague, qui a lieu du 6 ème

jour de développement embryonnaire (E6,5) au 9,5 chez la souris, formera une partie de la

masse cellulaire nécessaire au développement du système olfactif (Baker et al. 1997).

La placode olfactive est un épaississement local et transitoire de l’ectoderme qui provient de

la plaque neurale, qui se fait par une convergence rostrale de cellules de part et d’autre du

télencéphale en développement, autour de E9,5 chez la souris (Figure 3) (Forni et al. 2011b;

Harden et al. 2012; Whitlock and Westerfield 2000). La formation de la placode olfactive

s’accompagne d’une migration rostrale des cellules de la crête neurale qui vont entourer la

placode olfactive (Figure 3) (Harden et al. 2012). Ainsi les deux domaines, crête neurale et

placode olfactive, vont être étroitement associés ; certains les considérant adjacents, à la limite

d’une mixité ((Harden et al. 2012; Whitlock and Westerfield 2000), tandis que d’autres

Page 23: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

23

Figure 2 : Etapes de la neurulation primaire. (A) La frontière de la plaque neurale (vert) est induite

par la signalisation entre le neuroectoderme (violet), l’ectoderme non neural (bleu) et le mésoderme

paraxial sous-jacente (jaune). (B-D) Au cours de la neurulation, les frontières de la plaque neurale se

plissent (B-C), permettant la formation du tube neural (violet) (D). Les cellules de la crête neurale

(vert) se décollent de la partie dorsale du tube neural et migrent d’abord ventralement (1ère vague)

puis dorsalement (2ème

vague) (D). Adapté de Laura S. et al 2003

Figure 3 : Images de film en « time-laps » illustrant la migration des cellules de la crête neurale

(CN, vert) avec les précurseurs de la placode olfactive (PO, rouge). (A) Au stade 10 somites, les

précurseurs de la PO (rouge) sont enroulés autour de l’extrémité rostrale du tube neural (médian). (B)

les précurseurs de la PO s'éloignent de la ligne médiane rostrale (astérisque), et les CN (vert) migrent

rostralement. (C) Les CNC commencent à entourer le bord postérieur des précurseurs de la PO. (D) A

16 somites les précurseurs de la PO ne sont plus détectés à l'extrémité du tube neural. Les cellules de

la CN (vert) arrivent à la limite antérieure des PO (E) A 18 somites, les cellules de la CN (vert) ont

migré vers la limite rostrale des placodes olfactifs. La région postérieure de la placode olafctive

contient ni de cellules vertes, ni rouges (contour blanc). (F) A la fin du film, les placodes olfactives

sont complètement formées. Embryons de poulet en vues dorsales, (*) : partie rostrale. (Harden et al

2012)

Page 24: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

24

considéreront un envahissement de la PO par les cellules de la crête neurale (Barraud

(Barraud et al. 2010; Forni et al. 2011b). Quoiqu’il en soit, l’ensemble s’invagine pour former

la fosse nasale entre E10 et E10,5 chez la souris (Cuschieri and Bannister 1975) (Figure 4).

Dès E11,5, se forment respectivement l’épithélium olfactifs (EO) et l’épithélium voméronasal

(VN) dans la partie latérale et médiale du nez (Figure 4). Ainsi ces épithéliums possèdent

également une double origine, la crête neurale et la placode olfactive (Forni et al. 2011b).

II. 1. b. La neurogenèse olfactive et la neurogenèse des neurones à GnRH

1. La période neurogénique olfactive

La naissance des neurones à GnRH-I est un des premiers événements neurogéniques dans la

fosse nasale en développement (Forni et al 2010). Elle se fait dans une fenêtre de temps courte

et limitée contrairement aux neurones voméronasaux/olfactifs (Forni et al. 2011a; Murdoch

and Roskams 2007; Murdoch and Roskams 2008; Wray et al. 1989a). En effet, la

neurogenèse olfactive à partir de précurseurs multipotents se fait entre E9,5 et P0 chez la

souris (Murdoch and Roskams 2007); tandis que les neurones à GnRH-I naissent pendant le

développement et la différenciation de la fosse nasale, entre E9,5 et E12,5 (Wray et al.

1989a,(Jasoni et al. 2009). Les dernières divisions mitotiques des précurseurs se font

majoritairement (80%) entre E9,5 et E10,5 (Wray et al. 1989a,(Jasoni et al. 2009)et les

neurones commencent à exprimer la GnRH-I 48h à 72h après leurs mitoses dans l’ébauche du

VNO ou en cours de migration (Forni et al. 2011b).

2. Les inducteurs de la neurogenèse des neurones à GnRH-I

Dans la fosse nasale en développement plusieurs inducteurs neuronaux ont été mis en

évidence : latéralement l’acide rétinoïque, postérieurement le BMP4 (bone morphogenetic

protein 4) et médialement le FGF8 (fibroblast growth factor 8) et SHH (Sonic hedgehog)

(LaMantia et al. 2000).

En ce qui concerne les neurones à GnRH-I, la signalisation FGF et tout particulièrement le

facteur trophique FGF8 et son récepteur FGFR1, sont essentiels pour la formation de ces

neurones (Chung et al. 2008). En effet la perte d’expression de Fgf8 a comme conséquence

l’absence de formation de neurones à GnRH-I mais également du VNO (Chung et al. 2010),

qui s’explique par l’implication du FGF8 dans l’induction et la différenciation de la placode

nasale de souris (Kawauchi et al. 2005).

Page 25: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

25

Figure 4 : Schémas du développement de la placode olfactive de souris entre le 10,5 et al 12,5

jours de développement. La placode olfactive s’invagine et forme l’épithélium respiratoire (ER),

l’organe voméronasal présumptif (pVNO) et l’épithélium olfactif (EO). VT : vésicule télencéphalique.

Adapté de Wray S. 2010

Page 26: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

26

Récemment il a été mis en évidence le rôle de CHD7 (chromodomain helicase DNA binding

protein 7) dans la prolifération des progéniteurs des neurones à GnRH-I et dans la

neurogenèse de ces neurones, en régulant l’expression de Fgfr1 et Bmp4 (Layman et al.

2011).

Enfin il a également été décrit le rôle de FE65, une protéine de liaison aux précurseurs de la

protéine amyloïde (APP), dans le contrôle de la neurogenèse des neurones à GnRH-I (Forni et

al. 2011a). Le FE65 est fortement exprimé par les cellules post-mitotiques du VNO

présomptif dont les neurones à GnRH-I à partir d’E11, en fin de période de la neurogenèse de

ces derniers. Cette protéine de liaison à l’APP exerce une fenêtre d’action neurogénique

restreinte dans le temps sur les progéniteurs multipotents des neurones à GnRH-I au sein de la

placode nasale en développement. Ainsi les souris déficientes en FE65 présentent une

augmentation du nombre de neurones voméronasaux/olfactifs et une augmentation de 25%

des neurones à GnRH-I.

II.2. La migration des neurones à GnRH-I et la mise en place des nerfs du

système olfactif

II. 2. a. La mise en place des voies de migration des neurones à GnRH-I

1. La masse migratoire

La migration nasale des neurones à GnRH-I est décrite comme un exemple de migration

tangentielle (Wray 2010) qui dépend de la formation des voies de migration, c'est-à-dire des

nerfs du système olfactif (Miller et al. 2010).

Les premiers axones commencent à traverser la lamina propria dans le mésenchyme nasal à

partir de E10-E11 (Cuschieri and Bannister 1975; Miller et al. 2010) et pénètrent la vésicule

télencéphalique dès E11,5-E12 (Cuschieri and Bannister 1975; Doucette 1989; Miller et al.

2010) et al 2010) associées à une masse cellulaire en migration (Figure 5) (Marin-Padilla and

Amieva 1989) (Valverde et al. 1992).

Cette masse migratoire (Valverde et al. 1992) est composée au centre de précurseurs

neuronaux originaires de la PO (Blanchart et al. 2011; Miller et al. 2010) qui vont se

différencier en cellules OMP+ (olfactory marker protein) (Farbman et al. 1998) (Valverde et

al. 1993), en cellules à acetylcholistérase (AchE) (De Carlos et al. 1995),en neurones à

GnRH-I (Schwanzel-Fukuda and Pfaff 1989; Wray et al. 1989b), en neurones synthétisant le

GABA (Tobet et al. 1996a; Wray et al. 1996), en neurones synthétisant le

Page 27: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

27

Figure 5 : Schémas illustrant la Croissance des axones olfactifs de l’épithélium olfactif (EO) à la

vésicule télencéphalqiue (VT) à l’aide la masse migratoire (mm) chez l’embryon de souris âgés

de E10,5 à E12. Adapté de Miller et al 2010

Page 28: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

28

(Verney et al. 1996), en neurones à NPY (Hilal et al. 1996), en neurones à Galanine (Key and

Wray 2000), dont les marqueurs peuvent être exprimés transitoirement dans des neurones à

GnRH-I. En périphérie, la masse migratoire est composée de précurseurs gliaux originaires de

la CNC et qui vont se différencier en cellules olfactives engainantes (OEC) (Doucette 1989)

(Blanchart et al. 2011; Miller et al. 2010) (Forni et al. 2011b).

2. Les trajets des nerfs olfactifs, voméronasaux et du nerf terminal

La masse migratoire est un poste de guidage indispensable à la croissance axonale des

neurones olfactifs et voméronasaux (De Carlos et al. 1995). Ainsi, elle permet latéralement

l’extension des axones olfactifs de l’épithélium olfactif aux glomérules du bulbe olfactif

principal en formant la couche de nerf olfactif (ONL : olfactory nerves layers) ventro-

latéralement aux bulbes olfactifs, au niveau de la jonction entre le septum nasal et les bulbes

(Figure 6). Médialement elle permet l’extension des axones voméronasaux du VNO au bulbe

olfactif accessoire, en empruntant une voie médio-dorsale (Figure 6 et Figure 7).

Elle permet également la formation du nerf terminal, un composant du système olfactif

accessoire. Ce nerf ganglionnaire est une structure originaire de la PO, composée de chaines

de neurones à GnRH-I, à NPY, et à AChE (Schwanzel-Fukuda et al. 1985) (Caldani et al.

1987; Oelschlager 1988; Schwanzel-Fukuda and Silverman 1980; Zheng and Jourdan 1988).

Le nerf terminal se projette de la lamina propria, au niveau de la sortie de l’épithélium du

VNO jusqu’au diencéphale (Figure 7) (Wirsig-Wiechmann and Oka 2002). Chez les

mammifères, la projection centrale de ce nerf n’est pas bien définie, des études de traçage

montrent clairement qu’il traverse la surface ventro-mediale du BO, puis la région olfactive

rostrale et le septum Wirsig-Wiechmann and Oka 2002) et postérieurement à l’amygdale

(Jennes 1987). Wray et al. (1989b) considèrent qu’il se projette jusque dans l’aire pré-optique

cependant il est difficile de distinguer dans cette région le nerf terminal des projections des

neurones à GnRH-I (Wirsig-Wiechmann and Oka 2002).

Page 29: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

29

Figure 6 : Schéma illustrant l‘innervation périphérique et centrale du système olfactif accessoire

(orange) et du système olfactif principale (violet) chez le rongeur adulte.

Figure 7 : Schéma du système voméronasal chez le rongeur. En noir sont représentés les corps

cellulaires et les prolongements des neurones à GnRH-I qui composent le nerf terminal (NT vert), le

long des nerfs voméronasaux (VNN, jaune), de la sortie de l’organe voméronasal (VNO) au cerveau.

NPN : nerf nasopalatin, PPG : ganglion pterygopalatin, TG : ganglion trigeminal. Adapté de Wirsig

2011

Page 30: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

30

Figure 8 : Mise en culture et développement des explants de placodes olfactives de souris. (A-B)

embryons de souris âgés de E11,5, (A) vue sagittale de l’embryon, (B) vu frontale de la tête de

l’embryon (C) Etapes de développements des cultures d’explants de placodes olfactives (PO), de la

mise en culture (0div) jusque 14 jours de développement in vitro (div), d’après les données de

Fueshko et Wray 1994 et de Constantin et al 2009. VT : vésicule télencéphalique, CN : cartilage nasal.

Page 31: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

31

II. 2. b. La migration des neurones à GnRH-I

1. Caractéristiques de la migration des neurones à GnRH-I à

partir du modèle d’explant de placodes olfactives

L a migration des neurones à GnRH-I est bien documentée depuis plus de vingt ans à

partir d’analyses immunohistochimiques sur des coupes de têtes d’embryons (Schwanzel-

Fukuda and Pfaff 1989; Wray et al. 1989b). Depuis elle a été analysée en utilisant la

microscopie en temps –accéléré (time-lapse) sur des tranches d’embryons de souris (Bless et

al. 2005; Tobet et al. 1996b) et sur des explants nasaux de placodes olfactives (Casoni et

Wray 2008).

Le modèle de culture d’explants de placodes olfactives est développé depuis 20 ans

chez la souris le primate et le mouton (Fueshko and Wray 1994; Terasawa et al. 1993)

(Duittoz et al. 1997). Cette approche se base sur l’origine extra-cérébrale des neurones à

GnRH-I. Les placodes olfactives sont disséquées et mises en culture lorsque les neurones à

GnRH-I n’ont pas encore entamé leur migration, soit à E11,5 chez la souris (Figure 8). Les

cellules migrent depuis la partie médiane de la placode olfactive vers l’extérieur de l’explant.

Il a été estimé que ce modèle de culture maintient 20 à 50% (160-400 neurones) du nombre

total de la population de neurones à GnRH-I (Fueshko and Wray 1994). De plus les étapes de

développement in vitro (div) sont relativement standardisées et présentent beaucoup de

caractéristiques communes avec celles décrites in vivo (Fueshko and Wray 1994). A 3div les

neurones à GnRH-I émergent sur le plan dorso-ventral de l’explant et après 5div une

continuité de neurones à GnRH-I migre bilatéralement de la PO, à travers la masse du tissu de

l’explant, jusqu’au substrat cellulaire qui compose l’environnement extérieur de l’explant.

L’émergence bilatérale des neurones à GnRH-I se fait en étroite association avec les nerfs

voméronasaux, qui forment un long rail dès la sortie de la PO. Les signaux moléculaires qui

permettent d’initier la migration et de maintenir une migration bidirectionnelle sont donc

intacts dans ce système de culture. Les neurones à GnRH-I parcourent in vitro une distance

moyenne de 0,4mm, ce qui correspond in vivo à la traversée de la région olfactive des

neurones à GnRH-I. In vivo les neurones à GnRH-I parcourent du voméronasal à l’APO une

distance comprise entre 0,5mm et 1mm entre E11,5 et E13,5 (Fueshko and Wray 1994).

Page 32: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

32

Les études réalisées à partir de ces modèles ex vivo et in vitro, ont permis de mettre en

évidence que la vitesse et les mouvements de ces neurones à GnRH-I extra-cérébraux sont

semblables à la migration des cellules dans le système nerveux central :

i) la migration des nuerones à GnRH-I fait appel à une extension des neurites, avec une

nucléokinèse associée à une translocation du soma et présente un mouvement saltatoire

(Casoni et al 2008)

ii) Les neurones à GnRH-I migrent dans la région du nez à une vitesse de 13-20 µm/h ((Tobet

et al. 1996b) (Casoni et al 2008), de manière semblable aux neurones corticaux qui utilisent

de la glie radiaire (Wray 2010).

2. Le chemin de migration des neurones à GnRH-I

Le trajet de migration des neurones à GnRH-I a été décrit pour la première fois par

Schwanzel-Fukuda et al (1989) et Wray et al (1989b) sur le modèle murin. Plusieurs étapes

peuvent être identifiées (Figure 9 A et B):

i) La migration intra-mésenchymale de la fosse nasale à la lame criblée de

l’ethmoïde (LCE) commence chez la souris entre E12,5 et E13,5. Les neurones

forment un trajet migratoire au sein du septum nasal (SN), médialement, de part et

d’autre du cartilage nasale en développement, jusqu’à la jonction entre le SN et le

cerveau. Cette étape initiale requiert le mouvement des neurones à GnRH-I et des

facteurs spécifiques qui favorisent l’adhérence des neurones aux axones des nerfs

voméronasaux (Wierman et al. 2010; Wray 2002).

ii) Le passage de la lame criblée de l’ethmoïde, au niveau de la jonction entre le nez et le

cerveau, est caractérisé par un ralentissement de ces neurones (Wray 2002). La raison

de cette pause n’est pas clairement définie. Elle pourrait être due à un changement de

la composition du milieu extracellulaire et pourrait impliquer une différenciation des

neurones à GnRH-I nécessaire pour appréhender/entamer leur migration cérébrale. Au

niveau de cette jonction les neurones à GnRH-I convergent vers des racines centrales

du nerf terminal et tournent caudalement dans le cerveau.

Page 33: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

33

Figure 9 : Migration des neurones à GnRH-I au cours du développement embryonnaire chez la

souris. (A) Schémas représentant le développement des neurones à GnRH-I du 10,5 au 16 jours de

développement embryonnaire (E10,5 à E16). Les points noirs représentent les neurones à GnRH-I. (B)

Schéma résumant la progression des neurones à GnRH-I de la placode olfactive à la partie caudale de

l’aire pré-optique (POA). Les bâtons représentent le nombre de cellules GnRH-ir dans chaque zone

étudiée (la placode, le septum nasal, la jonction entre le nez et le cerveau, la partie centrale du nerf

terminal, la POA proximale et distale) et à chaque stade étudié (de E11 à E16-E20). Les courbes

noires précisent l’organisation de l’ensemble des cellules à ces stades. Adapté de Schwanzel-Fukuda et

al 1989

Page 34: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

34

Page 35: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

35

iii) La migration intracérébrale vers la région pré-optico-septale est entamée par les

neurones à GnRH-I à E13,5. A ce stade, les neurones ont envahi le télencéphale (la

partie centrale du nerf terminal) et ont atteint la partie rostrale du diencéphale.

Plusieurs études ont montré que les neurones à GnRH-I augmentent leur vitesse de

migration dans le cerveau et présentent des trajets de migration diffus (Bless et al.

2005; Tobet et al. 1996b). Au niveau de la région pré-optico-septale les neurones se

détachent de leurs guides axonaux et se dispersent dans l’hypothalamus et arrêtent de

migrer. A E16,5 la distribution des neurones à GnRH-I au sein du cerveau est similaire

à celle d’une souris adulte et les premières fibres GnRH-I atteignent l’éminence

médiane.

II. 2. c. La régulation de la migration des neurones à GnRH-I

Les données sur la migration des neurones à GnRH-I sont axées sur les mécanismes

moléculaires qui permettent aux neurones de migrer selon une trajectoire déterminée

(Wierman et al. 2010; Wray 2002; Wray 2010).

Beaucoup de molécules/récepteurs sont exprimés par les neurones à GnRH-I en migration du

nez au cerveau (Tableau 1). Ces neurones vont migrer spatialement et temporellement à

travers plusieurs zones, le septum nasal, la lame criblée de l’ethmoïde et le cerveau, qui

produisent des molécules de guidance différentes (Tableau 1) :

- des molécules d’adhésion inter-cellulaires, qui associent les neurones à GnRH-I à la

partie rostrale des nerfs voméronasaux et des faisceaux de neurones du nerf terminal.

Ces molécules comprennent les formes polysialées des protéines neuronales

d’adhésion cellulaire (PSA-NCAM) mais aussi l’anosmin-1, le produit du gène Kal-1.

La mutation de ce gène, absent dans le génome des rongeurs, a été mis en évidence

chez l’Homme dans le syndrome de Kallmann ou hypogonadisme-hypogonadotrope-

anosmique qui se traduit par l’absence de puberté et d’odorat à l’âge adulte, dût à un

défaut de migration des neurones à GnRH-I et des axones olfactifs (MacColl et al.

2002; Schwanzel-Fukuda et al. 1989)

Page 36: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

36

Tableau 1 : Liste de facteurs impliqués dans la migration des neurones à GnRH-I au cours du

développement embryonnaire. Quatres types de molécules sont distingués (classification) : les molécules

d’adhésions (Mol. Adh.), les Facteurs de guidances (F.G) qui peuvent être attractif ou répulsif, les facteurs

de croissance (F.C.) et les neurotransmetteurs (N.T). Ces facteurs peuvent être impliqués (système ciblé)

dans la mise en place du système GnRH-I et/ou du système olfactif et peuvent intervenir dans la migration

des neurones à GnRH-I dans différentes régions : le septum nasal (SN), la lame criblée de l’ethmoïde

(LCE) et dans le cerveau. Une mutation de certains des gènes codant pour ces molécules a été mise en

évidence dans le syndrome de Kallman (SK) ou des syndromes d’hypoganisme-hypoganotrophique

idiopathique normosmique (HHin). Selon les données de Wray et al 2002, Wray et al 2010, Wierman et al

2010. (*) selon Hanchate et al 2012

Molécule/ Récepteur Classification Système

ciblé Lieu

d'action Pathologie humaine

PSA-NCAM (neural cell adhesion molecule)

Mol. Adh. GnRH-I, Olf SN

Anosmine Mol. Adh. GnRH-I, Olf SN SK

EphA5/EphA,EphB (Ephrines)

F.G répulsif GnRH-I, Olf SN

Nelf (Nasal embryonic LHRH Factor)

F.G. attractif GnRH-I, Olf SN SK

Netrin-1/Netrin1R F.G. attractif GnRH-I, Olf SN

Reelin F.G. attractif GnRH-I SN

Semaphorin4D/Plexin/HGF F.G. attractif GnRH-I SN

Semaphorin3A/Neuropilin2/PlexinA1 F.G. attractif GnRH-I, Olf SN SK*

SDF1/CXCR4 (chemokines)

F.C répulsif GnRH-I, Olf LCE,

cerveau

FGF8/FGFR1 F.C. attractif GnRH-I, Olf SN SK, HHin

HGF/cMet F.C. attractif GnRH-I, Olf LCE,

cerveau

Axl/Tyro3 F.C. attractif GnRH-I LCE,

cerveau

GABA N.T. répresseur GnRH-I, Olf SN, LCE, cerveau

CCK8/CCK-1R (cholecistokinie)

N.T. répresseur GnRH-I, Olf SN

Page 37: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

37

- des molécules de guidages et les facteurs de croissances chimio-attractives ou chimio-

répulsives tels que les Sémaphorines, les nétrines, ou encore le FGF8 et son récepteur

FGFR1, vont guider la migration des neurones à GnRH-I directement ou

indirectement en agissant sur la croissance des terminaisons des nerfs. Ces molécules

peuvent être attractives ou répulsives selon le tissu et régulent la migration des

neurones à GnRH-I par gradiant de concentration Wray 2002; Wray 2010).

- des neurotransmetteurs tels que le GABAA et la cholecystochinine (CCK) qui, au

niveau de la lame criblée de l’ethmoïde, inhibent la migration des neurones à GnRH-I

et contribuent ainsi à l’entrée des neurones dans le cerveau à une période propice à

leur différenciation (Fueshko et al. 1998; Giacobini et al. 2004).

Ainsi de nombreux facteurs sont impliqués dans la migration et le développement des

neurones à GnRH-I, dont le plus part régulent également le système GnRH-I à l’âge adulte

(Wierman et al. 2010). Bien que les neurones à GnRH-I expriment un certain nombre de ces

molécules /récepteurs, cela ne signifie pas qu’ils soient actifs dans toutes les régions, comme

nous l’avons précisé dans le tableau. De plus, les neurones à GnRH-I présentent un phénotype

hétérogène (Todman et al. 2005) qui pourrait être important pour moduler la migration à

différents temps de la gestation selon l’environnement tissulaire des neurones.

L’hétérogénéité d’expression de l’ensemble de ces facteurs par les neurones à GnRH-I

empêcherait qu’une seule mutation génétique induisent un défaut de (Wierman et al. 2010).

Cependant il existe des syndromes d’hypoganisme-hypoganotrophique (HH) anosmique (ou

syndrome de Kallmann, SK) et l’HH idiopathique normosmique (HHin), qui entrainent un

défaut de migration de ces neurones et par conséquent une stérilité à l’âge adulte (Pitteloud et

al. 2006). Ces syndromes sont généralement dus à une mutation mono-génique impliquant des

gènes dont le produit peut être une molécule membranaire ou un facteur diffusible (Tableau

1) Pitteloud et al. 2006). Ces dernières années il a également été mis en évidence des

phénotypes hétérogènes et synergiques dus à des mutations di-géniques de gènes dont les

produits sont impliqués dans la migration de ces neurones, comme par exemple FGFR1 et

NELF (Pitteloud et al. 2007).

Page 38: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

38

II. 2. d. L’environnement glial des neurones à GnRH-I au cours du

développement embryonnaire

Comme nous venons de le voir de nombreuses études s’intéressent aux facteurs

impliqués dans la régulation de la migration des neurones à GnRH-I mais très peu d’entre-

elles s’intéressent au microenvironnement cellulaire qui serait susceptible de les produire.

Dans ce chapitre nous avons pourtant vu que les neurones à GnRH-I n’étaient pas les seules

cellules à migrer de la fosse nasale au cerveau, de nombreux types neuronaux mais également

des cellules gliales migrent jusqu’à la vésicule télencéphalique.

1. Caractéristiques des cellules gliales olfactives engainant les

axones olfactifs

Ces cellules gliales nommées cellules olfactives engainantes (olfactory ensheathing

cells, OEC) dérivent de la crête neurale (Barraud et al. 2010; Forni et al. 2011b; Katoh et al.

2011). Leurs progéniteurs font partie de la masse migratoire qui quitte la fosse nasale vers

E10,5 chez la souris et qui parcours le septum nasal jusqu’à la base du télencéphale

(Blanchart et al. 2011; De Carlos et al. 1995; Doucette 1990; Miller et al. 2010). Elles ont été

décrites pour la première fois par Golgi (Shepherd et al. 2011) comme une classe de cellule

gliale unique restreinte au système olfactif principal. Dans la littérature plusieurs noms les

désignes : la glie des nerfs olfactifs (olfactory nerves glial), les cellules de Schwann du nerf

olfactif (olfactory nerve Schwann cells) ou encore cellules de Schwann olfactives (olfactory

Schwann cells)(Chuah and Au 1991; Doucette 1984; Ramon-Cueto et al. 1993).

En effet ces cellules ont comme caractéristique d’envelopper les axones olfactifs dès la

sortie de l’épithélium olfactif au bulbe olfactif principal, au cours du développement

embryonnaire et chez l’adulte (Doucette 1990; Graziadei and Monti Graziadei 1985; Marin-

Padilla and Amieva 1989). De plus ces cellules possèdent des caractéristiques

morphologiques, antigéniques (Tableau 2) et fonctionnelles communes aux cellules de

Schwann mais également aux astrocytes (Ramon-Cueto and Avila 1998). En effet elles

peuvent être bipolaires et supporter la croissance axonale comme les cellules de Schwann, ou

comme les astrocytes elles peuvent être un soutien cellulaire mutipolaires.

Page 39: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

39

Antigène cellules de Schwann

OEC astrocyte

GFAP (Glial fibrillary acidic protein ) + + +

S100β + + +

NCAM (Neuronal cell adhesion molecule) + + +

Vimentine + + astrocyte immature

O4 (oligodendrocyte marker 4) + + -

P75 NTR (low affinity nerve growth factor receptor) + + -

Mpzero (Myelin protein zero) + + -

Cx43 (Connexin 43) - + +

BLBP (Brain lipid binging protein) - + -

Nestin - + -

NPY (Neuropeptide Y) - + -

Tableau 2 : Listes des antigènes exprimaient par les cellules olfactives gliales engainantes

(OEC), par les cellules Schwann et les astrocytes.

Page 40: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

40

Ces variabilités morphologiques et antigéniques, qui sont extrêmement bien décrites

dans la littérature in vivo et in vitro, dépendent du stade étudié et du lieu d’intérêt (la lamina

propria à la sortie de l’épithélium olfactif, le long des axones olfactifs dans le septum nasal,

au niveau de la couche des nerfs olfactifs (ONL) et au niveau de la couche externe du bulbe

olfactif) (Barnett 2004; Chuah and Au 1991; Doucette 1993; Franceschini and Barnett 1996).

Fonctionnellement plusieurs rôles leurs sont attribués. Elles contribuent à la croissance

des nerfs olfactifs au cours du développement et au renouvellement physiologique des

neurones sensoriels olfactifs (Richter et al. 2008) grâce à leur capacité de migration. En effet

ces cellules sont sensibles aux facteurs attractifs secrétés par le bulbe olfactif (Liu et al 1995)

au cours du développement embryonnaire tel que le GDNF (Cao et al 2006) mais également à

des facteurs secrétés par d’autres régions du cerveau telque le néocortex (Graziadei et al

1979). Elles guident la croissance axonale en activant la voie des sémaphorines tel que la

sémaphorine 3A (Schwarting et al 2000) mais également la voie des éphrines (St John et al

2002). Elles maintiennent une croissance axonale continue en enveloppant les axones, et

fournissent un substrat cellulaire contenant des facteurs favorables à l’élongation (Doucette

1990), Ramon-Cueto and Valverde 1995, Kafitz and Greer 1999). Ainsi les OEC expriment

des molécules d’adhésion telles que les NCAM à tous les stades de développement (Miragall

1989, 1988), et Wnt4 qui induit l’extension des axones des neurones olfactifs (Rodriguez-Gil

and Greer 2008). Les OEC possèdent également des fonctions immunitaires innées et

protègent ainsi les tissus olfactif des pathogènes en secrétant des facteurs immunitaires tels

que les chemokines (Vincent et al 2005). Ces dernières années il a été mis en évidence un rôle

de ces cellules gliales dans la prolifération et la différenciation des progéniteurs neuronaux

mais également dans la survie de ces progéniteurs (Zhang et al 2008). Enfin les OEC régulent

la formation du bulbe olfactif (pour revue Su et al 2010) en permettant le contact entre les

axones olfactifs et le bulbe olfactif présomptif (Doucette 1989) et en encapsulant les

glomérules (Marine-Pedilla et al 1989).

Page 41: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

41

2. Les cellules gliales engainant les axones voméronasaux

En ce qui concerne les axones du système olfactif accessoire, quelques études mettent

en évidence la présence de cellules gliales, que les auteurs nomment cellules de Schwann,

autours des nerfs voméronasaux chez le rat au cours du développement embryonnaire (Fraher

et al 1982) post-natal (Ichikawa and Osada 1995) et chez l’adulte (Raisman 1985).

L’arrangement de ces cellules gliales le long de ces axones s’apparente à celui qui est décrit

pour les axones olfactifs ; c’est à dire une couche engainante continue le long des axones,

avec une glie limitante au niveau de bulbe olfactif accessoire (pour revue Fraher et al 2002).

Cependant, très peu d’études s’y intéressent et les décrivent. Quelques-unes mentionnent la

présence de ces cellules gliales à proximité des neurones à GnRH-I en migration et suppose

que ces cellules seraient des OEC. Des observations faites par microscopie électronique

montrent des cellules de morphologie gliale associées à des neurones à GnRH-I en migration

dans le septum nasal d’embryon de souris âgés de E13,5 (Livne et al 1993). Une autre étude

qui s’intéresse aux propriétés neurotrophiques de la S100, met en évidence la présence de

cellules immunoréactive à la protèine S100 et à la GFAP le long du trajet de migration des

neurones à GnRH-I (Cummings and Brunjes 1995). Au cours de cette thèse une étude a

montré à E12 chez la souris, la présence de progéniteurs gliaux BLBP positif et des cellules

GnRH-I immunoréactives dans la masse migratoire marquée à la double-cortine (Miller et al

2010). De même au cours de ces trois dernières années, il a été montré in vitro, dans des

cultures d’explants de placodes olfactives, la présence de cellules gliales de types OEC

étroitement associées aux neurones à GnRH-I à 7div et 21div (Forni et al 2011b,

Franschescini et al 2010).

II.3. La différenciation embryonnaire des neurones à GnRH-I

II. 3. a. Une différenciation précoce des neurones à GnRH-I

Les neurones à GnRH-I commencent à se différencier très tôt au cours du

développement embryonnaire puisqu’ils expriment la GnRH-1 à partir de E11,5 chez la souris

(Wray et al 1989a), 1-2 jours après le début des dernières divisions des précurseurs (Wray et

al 1989a, Jasoni 2009) et produisent suffisamment de GnRH-I pour être immunodétectés dès

E12,5 (Schwanzel-Fukuda et al 1989, Wray et al 1989b).

Page 42: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

42

II. 3. b. Une différenciation qui s’étend tout au long de la migration des

neurones à GnRH-I

1. Une différenciation morphologique

Les études menées in vivo et in vitro montrent une différenciation morphologique des

cellules à GnRH-I tout au long du développement embryonnaire. Aux premiers stades de

développement entre E11,5 et E13,5 in vivo (Schwanzel-Fukuda et al 1989, Wray et al 1989b)

et jusqu’à 3 jours de cultures in vitro (Fueshko et wray 1994) les neurones à GnRH-I

présentent une morphologie ronde avec des neurites courts dans la fosse nasale. Au cours de

leur migration entre E12,5 et E15,5 in vivo (Schwanzel-Fukuda et al 1989, Wray et al 1989b)

et jusqu’à 5-6 jours de cultures in vitro (Fueshko et wray 1994) les cellules grandissent et

deviennent bipolaires. A E16,5, ces neurones, dont les corps cellulaires sont distribués dans

l’aire pré-optique, présentent une extension importante de leurs prolongements dans

l’éminence médiane (Scwanzel-Fukuda et al 1989, Wray et al 1989b). En fin de gestation la

taille des axones s’accroit ainsi que leur contenu en granules de sécrétions (Scwanzel-Fukuda

et al 1989, Wray et al 1989b).

2. Une différenciation fonctionnelle

L’ensemble des études menées ces vingt dernières années montrent une bio-

disponibilité du GnRH-I au cours de la migration de ces neurones, une machinerie

fonctionnelle pour la sécrétion de GnRH-I et enfin une sensibilité des cellules gonadotropes

de l’hypophyse à la GnRH-I.

En effet une augmentation graduelle de la quantité moyenne du transcrit de la GnRH-I a été

décrite dans le nez et dans le cerveau de souris entre E12,5 et E19,5 (Simonian et Herbisson

2001), suggérant que cette transcription dépend de signaux régulateurs présents tout le long de

la route migratoire de ces neurones. Il a également été mis en évidence chez le rat que le

pourcentage de neurones à GnRH-I possédant le décapeptide mature s’accroit entre E12,5 et

E14,5, puisque seulement 15% de cette population présentent de la GnRH-I amidée à E12,5

contre 85% à E14,5 (Livne et al. 1993). Des études de microscopie électronique ont mis en

évidence que cette GnRH-I présente dans le cytoplasme à E12,5 et détectée dans l’appareil de

Golgi et les granules de sécrétion à partir de E14,5 chez le rat (Zheng et al. 1992), Silverman

et al 1993). In vitro à partir de cultures d’explant de placodes olfactives de souris, Constantin

et al. (2009) ont mis en évidence une sécrétion pulsatile de GnRH-I qui débute autour de 3div

Page 43: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

43

et qui augmente entre 7 et 14div (Figure 8). L’ensemble de ces résultats suggère que la

GnRH-I peut être sécrétée au cours du développement embryonnaire.

Enfin plusieurs études mettent en évidence la sensibilité de l’adéno-hypophyse à une

stimulation de GnRH-I au cours du développement embryonnaire in vivo. Chez le mouton, il a

été mis en évidence le rôle central de la GnRH-I dans la régulation de l’ontogenèse et de la

fonction hypophyso-gonadique pendant la vie fœtale, en stimulant la production de LH et de

FSH à partir de E70 (le terme de la gestation chez le mouton étant de 145 jours) (pour revue

Brooks et al 1995). Chez le rat, la GnRH-I peut stimuler la libération de LH en fin de

gestation, puisqu’une injection de GnRH-I entraîne une augmentation du contenu de LH

plasmatique à E18,5 (Daikoku et al 1981).

II. 3. c. Une période clef dans la différenciation des neurones à GnRH-I : le

passage de la lame criblée de l’ethmoïde

Une régulation spécifique des neurones à GnRH-I se ferait au niveau de la jonction entre le

nez et le cerveau à E14,5, puisque plusieurs études mettent en évidence une nette

augmentation du transcrit au niveau de la lame criblée de l’ethmoide à ce stade (Simonian et

Herbisson 200, Wray 2002) et qu’une entrée prématurée des neurones à GnRH-I dans le

cerveau a comme conséquence une diminution d’expression de GnRH-I dans le cerveau

(Wray et al 2002).

Page 44: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

44

III. Le système GnRH, une cible des perturbateurs endocriniens à activité

oestrogéno-mimétique

III.1. Rôle des œstrogènes dans le développement et la régulation du système

GnRH-I

Comme nous l’avons vu dans les deux premiers paragraphes de cette introduction

bibliographique, la régulation et le développement du système GnRH-I sont extrêmement

complexes et dépendent de nombreux acteurs dont les hormones stéroïdiennes. Le rôle des

œstrogènes sur la physiologie des neurones à GnRH-I est bien connu. En effet à forte

concentration, l’oestradiol est responsable du pic pré-ovulatoire de GnRH-I en induisant un

rétrocontrôle positif sur la fréquence des pulses de GnRH-I chez le primate, le mouton et le

rongeur (Xia et al. 1992) Caraty et al 1998,(Herbison 1998), tandis qu’une faible

concentration d’œstradiol induit un rétrocontrôle négatif sur la fréquence des pulses de

GnRH-I (Ordog et al 1997). Ainsi de nombreuses études décrivent l’effet de l’oestradiol sur la

physiologie cellulaire des neurones à GnRH-I chez la souris et le primate tel que l’activité

calcique (Romano et al 2008, Abe et al 2008, Temple et al 2004), l’activité électrique (Chu

(Chu et al. 2009) et la sécrétion de GnRH-I (Abe et Terasawa 2005).

Les neurones à GnRH-I sont sensibles à l’œstradiol précocement au cours du développement,

puisqu’une exposition à ce stéroïde sexuel en période néonatale chez la souris, entraîne une

augmentation du nombre de neurones à GnRH-I chez le mâle (Grober et al 1998). Le rôle des

œstrogènes dans le bon développement des neurones à GnRH-I a également été mis en

évidence in vitro sur des cultures d’explants de placodes olfatives de mouton (Agca et al.

2008). En effet il a été observé qu’un antagoniste de récepteur à l’oestradiol induit une

diminution importante de la neurogenèse des précurseurs des neurones à GnRH-I.

On peut donc supposer qu’une exposition extra-physiologique d’œstrogènes pourrait avoir des

conséquences sur la régulation mais également sur la mise en place du système GnRH-I. En

effet, chez les mammifères les hormones sexuelles sont capables de franchir la barrière

placentaire et d’agir directement sur le fœtus (Slob AK 1980). Cependant en condition

physiologique, le fœtus est protégé de l’action des œstrogènes maternels grâce à l’α-

foetoprotéine. De plus, bien que le développement embryonnaire des neurones à GnRH-I ne

présente pas de dimorphisme sexuel, le mode d’action des hormones sexuelles à cette période

de la vie est différent entre les femelles et les mâles (Gorski 1985). En effet au cours de

Page 45: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

45

développement embryonnaire, les femelles ne sont pas exposées aux œstrogènes, puisque les

ovaires ne produisent pas d’hormones sexuelles avant la puberté. Ce qui n’est pas le cas des

mâles dont les testicules fœtaux produisent les œstrogènes issus de l’aromatisation de la

testostérone, qui est indispensable à la masculinisation du cerveau en période périnatale et à

l’activation du comportement sexuel à l’âge adulte (pour revue McCarthy et al 2009).

Ainsi, une aberration du profil d’exposition à des molécules à activité œstrogénique ou anti-

œstrogéniques au cours du développement pourrait causer un défaut du développement du

système GnRH-I mais aussi du système nerveux central et périphérique exprimant des

récepteurs aux œstrogènes (RE) fonctionnels. Cette aberration peut survenir suite à une

exposition à des perturbateurs endocriniens (PE), qui peuvent franchir la barrière placentaire

et être en contact direct avec le fœtus.

III.2. Le système GnRH une cible des perturbateurs endocriniens à activité

œstrogénique ou anti-œstrogénique

Les perturbateurs endocriniens sont définis par l’organisation mondiale de la santé comme

« une substance ou un mélange exogène altérant les fonctions du système endocrinien et

induisant donc des effets nocifs sur la santé d'un organisme intact, de ses descendants ou

(sous-)populations » (world health organization, WHO 2002).

Le groupe de molécule identifié comme des perturbateurs endocriniens est très hétérogène et

inclut des composés industriels, des solvants/lubrifiants (Polychlorinated biphenyls, PCB,

Dioxine), de l’industrie plastique (le bisphénol A, BPA), les dérivés des produits industriels

(les dioxines TCDD), les fongicides (vinclozoline) et les pesticides (methoxyclore) (pour

revue Diamanti-Kanrakis et al 2009). Les produits pharmaceutiques et les phytoestrogènes

sont également considérés comme des perturbateurs endocriniens lorsqu'ils sont consommés

en grande quantités ou lorsque les médicaments sont donnés à des niveaux élevés, à des

périodes inappropriées du développement (par exemple pendant la gestation) ou quand ils

sont présents dans l'environnement en quantité biologiquement active (pour revue Gore et al

2010). Ces perturbateurs endocriniens environnementaux comprennent les hormones

naturelles dérivant des stéroïdes sexuels, tels que le 17α-oestradiol et l’oestrone et des

hormones de synthèses originaire de l’industriel pharmaceutique, telles que le 17α-

éthinyloestradiol, le Diéthylstibestrol, le Tamoxifène (Gore and Patisaul 2010).

Page 46: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

46

Les PE ont en commun l’induction de modifications de l’homéostasie endocrinienne par des

mécanismes d’actions multiples et complexes en interagissant avec des récepteurs aux

œstrogènes (ER), androgènes (AR) et sont susceptibles d’avoir des conséquences délétères

pour les organismes. Les PE peuvent interagir avec les récepteurs hormonaux en mimant

l’action des hormones naturelles (effet agoniste), ou en bloquant de manière compétitive ou

non compétitive l’action des hormones naturelles sur leurs récepteurs (effet antagoniste) (Frye

et al. 2012).

Plusieurs études ont ainsi établi un lien entre la présence de PE dans l’environnement et

l’apparition de troubles du développement ou de la fonction de reproduction (Diamanti-

Kandarakis et al. 2009). Chez l’Homme, il y a de fortes suspicions quant à l’implication des

PE dans l’incidence croissante de certaines pathologies telles que les cancers hormonaux-

dépendants, l’oligospermie, l’endométriose, et la cryptorchidie (Diamanti-Kandarakis et al.

2009). De même, les PE sont incriminés dans les troubles de la fertilité et dans l’apparition de

pubertés précoces (Diamanti-Kandarakis et al. 2009).

Ces phénomènes peuvent être mis en lien avec le contrôle de la fonction de la reproduction

par l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadotrope et notamment par un effet de perturbateurs

endocriniens sur les neurones à GnRH. De ce fait ces dernières années plusieurs études

s’intéressent aux effets des perturbateurs endocriniens sur le système GnRH.

Des travaux menés in vitro mettent en évidence sur la lignée de neurones à GnRH-I de souris

GT1-7, qu’un traitement aux pesticides organochlorés œstrogèno-mimétiques (tels que le

méthoxychlore et le clorpyifos), aux solvants PCB (Aroclor 1121 et Aroclor 1254), ou encore

aux phyto-estrogènes, induisent une augmentation de l’expression du GnRH-I (Dickerson et

al. 2011; Gore et al. 2002)(Bowe et al 2003). A partir d’explants hypothalamiques de rats,

Rasier et ses collaborateurs ont mis évidence en un effet du DDT et du BPA sur

l’augmentation de la fréquence des pulses de GnRH-I (Rasier et 2008, Rasier et al 2007)

In vivo il a été mis en évidence chez les mammifères une augmentation de la fréquence de

sécrétion pulsatile de GnRH-I chez le rat, après une exposition néonatale de DTT (Rasier et al

2007) et de BPA (Fernandez et al 2009). Tandis qu’un traitement au coumestrol, un

phytoestrogène, chez le rat adulte entraîne une diminution de la fréquence de sécrétion

pulsatile de GnRH-I (McGarvey et al 2001). Des expositions fœtales chez le mouton à des

mixtures de composés présents dans les boues d’épuration (Bellingham et al 2010) ou à une

combinaison de BPA et de méthoxychlore (Mahonney and Padmanabhan 2010) induisent une

Page 47: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

47

diminution de l’expression de GnRH-I dans l’hypothalamus mais aussi une diminution de

l’expression du récepteur à la GnRH (Bellingham et al 2010). Chez le rat l’exposition à la

TCDD au cours du développement embryonnaire induit une augmentation du contenu de

GnRH-I dans l’hypothalamus et une diminution de libération de GnRH-I mesurés sur des

explants hypothalamiques (Clements et al 2009).

III.3. Le 17α-éthinyloestradiol et le système GnRH

III. 3. a. Effets du 17α-éthinyloestradiol sur le système GnRH

Dans le cadre de ce travail de thèse nous avons choisi d’étudier les effets d’un xéno-

oestrogène : le 17α-éthinyloestradiol (EE2) sur le système GnRH-I.

Le 17α-éthinyloestradiol (Figure 10) est une hormone stéroïde de synthèse utilisée

principalement dans les contraceptifs hormonaux mais également dans l’hormonothérapie

substitutive. L’EE2 est métabolisé dans le foie par éthynylation et hydroxylation, puis il est

inactivé par conjugaison (pour revue Stanczyk et al 2013). Le groupement éthinyl ralentit la

métabolisation de l’estradiol et modifie considérablement ses propriétés pharmaceutiques ;

puisque la demi-vie de l’EE2 est de 30h dans le plasma humain tandis que celle de l’E2 est

d’approximativement 1h (Bolt et al 1979). Contrairement à l’E2, l’extraction de l’EE2 se fait

majoritairement dans les fèces (62%) et non dans les urines (38%) ; et 40% de l’EE2 retrouvé

dans les urines ne serait pas métabolisé (Johnson et William 2004). Ce composé est évacué

dans les effluents des stations d’épuration et libéré dans le milieu aquatique. Dans la majorité

des effluents les niveaux d’EE2 sont inférieurs aux limites de détections des procédures

(0,03ng/L), cependant il a toutefois été détecté dans certains effluents à des niveaux

supérieurs à 5ng/ml et dans des eaux de surfaces à des concentrations comprises entre 0,4 ng/l

et 15 ng/l (Linterman et al 2003,Cargouet et al. 2004; Desbrow et al. 1998; Ternes et al. 1999)

et pouvant atteindre exceptionnellement des concentrations supérieures à 40 ng/l (Ternes et al.

1999) (Figure 11). De plus des tests de biodégradation ont montré que le temps de demi-vie

de l’EE2 dans les eaux de rivière était environs 14 fois supérieur à celui de l’E2 (17 jours

versus 1,2 jour) (Jürgens et al 2002). Plusieurs travaux suggèrent également que l’EE2 est

capable de se bio-accumuler dans les organismes à des concentrations allant de 1,4-1,6ng/ml

chez le poisson (Al-Ansari et al. 2010).

Page 48: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

48

Figure 11 : Gammes de concentrations de 17α-éthinyloestradiol retrouvées dans les eaux de

différents pays et dans les traitements hormonaux. Adapté de Pillon et al 2012

17β-œstradiol (E2)

C18H24O2

17α- éthinyloestradiol (EE2)

C20H24O2

Masse molaire : 272,4g/mol Masse molaire : 296,4g/mol

Figure 10 : Représentation de la molécule du 17β-œstradiol et du 17α-éthinyloestradiol

Page 49: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

49

Plusieurs travaux ont montré que l’EE2 avait des effets délétères sur la fonction de

reproduction chez le rongeur. Un traitement in utéro et au cours de la lactation d’EE2 induit

une stérilité et une dérégulation du cycle oestrien à des fortes concentrations (400ng/kg/jour)

(Fusani et al 2007, Della-Seta 2008). A des faibles doses (4ng/kg/jour) elle induit des

altérations de la fécondité et du comportement sexuel (Fusani et al 2007, Corrieri et al 2007).

Ces dernières années, des études ont également mis en évidence l’effet de l’EE2 sur le

développement des neurones à GnRH-I chez la souris (Pillon et al. 2012; Vosges et al. 2012).

Ainsi une exposition moyenne et longue (1 à 3 semaines) à des doses environnementale d’EE2

d’œufs de poissons zèbres fertilisés induit une augmente du nombre de neurones à GnRH-III

immunoréactif, de manière proportionnelle à la dose d’exposition (Vosges et al. 2010) Vosges

et al. 2012). Un traitement de 10 jours à une concentration de 0,1nM entraîne une diminution

de la taille des fibres GnRH-III (Vosges et al 2010). Chez la souris, une exposition in utéro

comprise entre E10 et E13 induit également une augmentation du nombre de neurones GnRH-

I proportionnellement à la dose du traitement (Pillon et al 2012).

III. 3. b. Mode d’action de l’EE2 via les récepteurs à l’œstradiol

L’EE2 a une activité œstrogéniques en se fixant avec une affinité élevée sur les récepteurs

nucléaires aux œstrogènes ERα et ERβ (Cosnefroy et al. 2009; Legler et al. 2002, Shyu 2011).

De plus récemment il a été mis en évidence que l’effet de l’EE2 sur l’ontogénèse des neurones

à GnRH-III, chez le poisson zébre, est médié par ces récepteurs, puisqu’il est abolit en

présence d’un inhibiteur des récepteurs ERα et ERβ (l’ICI182-780) (Vosges 2012).

Ces récepteurs aux œstrogènes peuvent activer la transcription des gènes cibles après fixation

du ligand (pour revue Watson et al 2007). Cette réponse dite lente (heures à minutes)

comprend deux mécanismes de régulation transcriptionnelle (Figure 12) :

i) L’activité transcriptionnelle ERE dépendante, qui est le mécanisme de régulation le

plus classique. La liaison du ligand à son récepteur, après diffusion à travers la

membrane plasmique, mène à la dimérisation du récepteur de façon stable et à sa

translocation nucléaire (Shiau et al. 1998). Dans le noyau, il se fixe sur des

séquences ERE (Estrogen Responsive Element) situées en amont des gènes cibles

via le domaine de liaison à l’ADN. Cette fixation entraîne le recrutement des co-

activateurs essentiels à l’activité transcriptionnelle.

Page 50: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

50

Figure 12 : Schéma représentant les voies moléculaires utilisé par les récepteurs à l’œstradiol

(ER et GPR30) après fixation de leur ligand. (A) Voie activation génomique directe : les récepteurs

ERα ou ERβ (RE) liés à leur ligand se dimérisent et se fixent directement sur l’élément de réponse aux

oestrogènes (ERE) en amont du gène cible ce qui permet d’activer la transcription. (B) Voie

d’activation génomique indirecte, le dimére de récepteur ER interagit avec des facteurs transcriptions

(TF), permettant une liaison indirecte à l’ADN. (C) Voie d’activation non génomique, le ligand se fixe

aux récepteurs membranaires ERα ou ERβ (RE) ou GPR30, par l’intermédiaire de second messager

(SM) ils activent des cascades de signalisations qui peuvent influer sur les canaux ioniques et induire

un effet physiologique rapide. Adapté de Heldring et al 2007

Page 51: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

51

ii) L’activité transcriptionnelle ERE-indépendante. Les récepteurs des œstrogènes,

après interaction avec leur ligand, sont capables de moduler l’expression de gènes

qui ne possèdent pas de séquence ERE dans leur région promotrice. Après la

translocation nucléaire des ER, ils interagissent directement avec des facteurs de

transcription actifs, qui sont fixés à la région promotrice des gènes cibles, et

activent ainsi la transcription.

Ces récepteurs ERα et ERβ peuvent également activer une voie non génomique (pour

revue Herbison, et al 2009, Watson et al 2007) (Figure 12), induisant un effet rapide des

œstrogènes (quelques secondes à quelques minutes) sur la régulation des neurones à GnRH-I

chez l’adulte (Chu et al. 2009) (Romano et al 2008) et chez l’embryon (Temple et al 2004).

En effet, les récepteurs ERα et ERß peuvent être transportés vers la membrane plasmique,

après modification post-traductionnelle (Ascenzi et al. 2006, Galluzzo et al. 2007). Ces

actions rapides de l’E2 sont capables d’induire l’activation de plusieurs voies de

signalisations dont la voie des cAMP/PKA dans les neurones à GnRH-I de souris (Abraham et

al 2003), la voie des phospholipase C et de la PKCα, induisant un influx de calcium dans

diverses populations cellulaires (Picotto et al. 1996; Perret et al. 2001) . Un troisième

récepteur membranaire des oestrogènes, de la famille des récepteurs couplés aux protéines G,

appelé GPR30 serait également impliqué dans certains effets non génomiques des œstrogènes

sur l’activité des neurones à GnRH-I chez le primate (Noel et al. 2009)(Terasawa et al 2009)

L’étude de Vosges et ses collaborateurs (2011) ne permet pas d’affirmer que le mode

d’action de l’EE2 sur les neurones à GnRH-I via ERα et/ou ERβ soit direct. En effet bien que

l’expression et la production de ERα ont été mis en évidence dans les neurones à GnRH-I

chez de nombreuses espèces (Herbison et al 1998), l’expression et la production d’ERβ n’ont

pas été détectées dans les neurones à GnRH-I chez l’embryon (Sharifi et al 2002), chez le

rongeur pré-tubaire et adulte (Herbison and Papes 2001, Kallo et al 2001). De plus les études

menés à partir de souris ERα KO et ERβ KO ont permis de mettre en évidence que les

régulations physiologiques de l’oestradiol sur l’activité des neurones à GnRH-I lors des rétro-

contrôles négatifs et positifs impliquent principalement le récepteur ERα, puisque seul une

déficience de ERα conduit à une dérégulation importante du phénotype endocrinien

(Beauvillain 2008; Clarke 2011), ce qui suggère que l’effet des œstrogènes et des

xénoestrogènes sur les neurones à GnRH-I serait transmis indirectement par des afférences

neuronales, ou encore des cellules gliales (pour revue Herbison 2009).

Page 52: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

52

OBJECTIFS La période de développement péri-embryonnaire est critique pour la mise en place de

l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadotrope. Un défaut de migration des neurones à GnRH-I

entraine une hypofertilité voire une stérilité à l’âge adulte (Miraoui et al. 2011). Ces neurones

se différencient au cours de leur migration (Levine and Ramirez 1982), et présentent une

activité sécrétrice précoce au cours du développement (Foster 1972)

En ce qui concern la majorité des différentes populations neuronales, très peu d’études

s’intéressent au microenvironnement cellulaire impliqué dans l’ontogenèse des neurones à

GnRH-I. En effet il est maintenant bien établi que la migration des précurseurs neuronaux du

système nerveux central vers leur destination finale, et la projection des axones vers leurs

cibles impliquent des interactions cellules-matrice extracellulaire et cellule-cellule (Keiko

1995). Il a été montré que dans le cortex cérébral (originaire de l’ectorderme du tube neural),

les neuroblastes sont guidés par la glie radiaire au cours de leur migration (Rakic 1990, Hatten

1993). Les progéniteurs de la crête neurale utilisent des prolongements cellulaires et la

matrice extracellulaire pour atteindre leur destination (Bronner-Fraser 1992). Les neurones à

GnRH-I ont une double origine : le territoire ectodermique de la placode olfactive et la crête

neurale (Forni et al. 2011). Cette double origine tissulaire des neurones à GnRH-I n’exclut pas

le fait qu’ils puissent posséder un environnement glial au cours de leur migration. En effet,

quelques études suggèrent et décrivent la présence de cellules gliales le long de la route

migratoire de ces neurones (Fraher 1982).

Dans ce contexte nous posons comme hypothèse que les neurones à GnRH-I possèdent

un environnement glial au stade précoce du développement et que celui-ci serait

nécessaire à la migration mais également à la mise en place de la sécrétion pulsatile de

GnRH-I et participerait à la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I

Le premier objectif de cette thèse a été de caractériser l’environnement glial des neurones

à GnRH-I en migration in vitro. Dans un premier temps, nous avons étudié le développement

de cet environnement glial associé aux neurones à GnRH-I sur des cultures de placodes

olfactives, puis caractérisé le phénotype de ces cellules gliales (article 1: Olfactory

ensheathing cells form the microenvironment of migrating GnRH-I neurons during mouse

development. Glia). Dans une seconde étude, nous avons caractérisé in vivo l’évolution

Page 53: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

53

spatiotemporelle du phénotype de ces cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I en

migration (article 2 : Rostral maturation of glial ensheathing cells associated to GnRH-I

neurons during mouse development, en préparation pour Eur J Neurosci).

Le second objectif de cette thèse a été d’étudier, in vitro, les effets d’un perturbateur

endocrinien, le 17-α-éthinyloestradiol (EE2), sur l’expression de gènes codants des cellules

gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I. En effet, le développement et la

régulation du réseau neuroendocrine GnRH-I est dépendant des hormones stéroïdiennes

(Clarke 2011; Herbison 1998; Parhar et al. 2012) et constitue donc une cible privilégiée pour

des perturbateurs endocriniens (PE) à activité oestrogénique ou anti-oestrogénique.

Récemment, des études ont mis en évidence l’effet d’un PE à activité oestrogéno-mimétique,

le 17-α-éthinyloestradiol (EE2), sur l’ontogenèse des neurones à GnRH-I (Pillon et al. 2012;

Vosges et al. 2012). Afin de déterminer quelles sont les cibles moléculaires potentiellement

impliquées dans les effets de l’EE2 sur le développement et la régulation des neurones à

GnRH-I, nous avons étudié l’effet d’une concentration compatible avec une exposition

environnementale de ce PE sur le transcriptome des cellules gliales GFAP-GFP isolées à

partir de cultures d’explants de placodes olfactives.

Page 54: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

54

RESULTATS

Page 55: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

55

Chapitre 1

Les neurones à GnRH-I en migration sont associés aux

cellules gliales olfactives

I. Contexte scientifique

Les neurones à GnRH-I migrent le long des axones des nerfs voméronasaux et du nerf

terminal (Wray 2011). Bien que de nombreuses études s’intéressent aux facteurs diffusibles et

aux molécules d’adhésions impliquées dans la migration des neurones à GnRH-I (Wray

2011), peu d’études s’intéressent au micro-environnement cellulaire qui pourrait produire ces

facteurs. Quelques études mentionnent la présence de cellules gliales à proximité des

neurones à GnRH-I en migration : i) trois études menées in vivo, sur des embryons de souris à

E13,5 (Livne et al. 1993; Miller et al. 2010) et sur des nouveaux nés d’opossums (Cummings

and Brunjes 1995), ii) deux études menées in vitro, sur des cultures d’explants de placodes

olfactives de souris (Forni et al 2011, Franceschini 2012). Néanmoins, la présence de cellules

gliales le long des axones olfactifs a été décrite (Doucette 1989; Farbman 1990), ainsi que le

long des axones voméronasaux (Fraher 1982) et le long du nerf terminal (Zheng et Jourdan

1993a). Ce sont les cellules gliales engainant les axones olfactifs, nommées cellules olfactives

engainantes (ou Olfactory ensheathing cell = OEC) qui sont principalement décrites dans la

littérature (Farbman 1990) (Lindsay et al.) ((Vincent et al. 2003) ((Franceschini and Barnett

1996). Ainsi le but des deux études présentées dans ce chapitre est de déterminer si les

neurones à GnRH-I possèdent un environnement glial au cours du développement

embryonnaire.Pour mener à bien ces études nous avons utilisé une lignée de souris

transgéniques hGFAP-GFP (human Glial fibrillary acidic protein - Green Fluorescence

Protein) (Zhuo et al 1997). Dans ce modèle de souris la GFP est codée par un transgène sous

la dépendance du promoteur du gène de la GFAP humaine (Zhuo et al 1997), une protéine de

filaments intermédiaires du cytosquelette, exprimée par les cellules gliales du système

nerveux central et du système nerveux périphérique (Astic et al 1998, Pellitteri et al 2010).

L’utilisation d’un système rapporteur permet de détecter les cellules gliales exprimant la

GFAP précocement au cours du développement (Baba et al. 1997; Morita et al. 1997). Une

lignée de souris transgéniques GnRH-eGFP a également été utilisée (Spergel et al 1999).

Dans ce modèle de souris la GFP est codé par un transgène sous la dépendance du promoteur

du gène du GnRH-I (Spergel et al 1999).

Page 56: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

56

II. Article 1 :

Les cellules gliales olfactives engainantes forment le microenvironnement des

neurones à GnRH-I en migration

Schéma général des études menées

Pour mener à bien cette étude une approche in vitro a été menée sur des cultures

d’explants de placodes olfactives provenant de souris GFAP-GFP âgées de 11,5 jours de

développement embryonnaire et une approche in vivo sur des embryons GFAP-GFP âgés de

12,5 jours de dévellopement embryonnaire (E), E13,5, E14,5 et E15,5.

Environnement glial et cinétique de mise en place

A partir de cultures de placodes olfactives nous avons mis en évidence la présence d’un

environnement glial [GFP+] associé aux neurones à GnRH-I sur tissus frais (grâce à la

fluorescence émise par la GFP et à la réfringence des neurones à GnRH) et par

immunohistochimie. L’association étroite des deux types cellulaires a été confirmée par

microscopie électronique. Les observations des tissus frais et immunomarqués (GFP-ir)

montrent que les cellules gliales [GFP+] et/ou GFP-ir sont détectées hors de l’explant avant la

détection des premiers neurones à GnRH-I suggérant qu’elles débutent leur migration avant

les neurones à GnRH-I ou qu’elles proviennent d’un territoire moins éloigné. L’analyse du

ratio de la distance des fronts de migration des deux types cellulaires au cours du

développement in vitro nous a permis de montrer que les cellules gliales GFP-ir arrêtent leur

migration après que les neurones GnRH-ir se soient arrêtés.

Des résultats préliminaires menés in vivo montrent que le long des axones voméronasaux, les

neurones à GnRH-I sont également associés à des cellules gliales GFP-ir dès 12,5 jours de

développement embryonnaire. Une cartographie des cellules [GFP+] et des neurones à

GnRH-I a été réalisée à partir de marquages immunohistochimiques de coupes sagittales de

têtes d’embryons de souris âgées de E12,5 à E15,5. Une corrélation de la répartition spatio-

temporelle a été mise en évidence dès la sortie du VNO jusqu’au niveau de la jonction naso-

cérébrale.

Caractérisation phénotypique des cellules gliales

Cette étude a montré par RT-PCR, que les cellules gliales [GFP+] triées par FACS

(Fluorescence activating cell sorting) à partir des cultures d’explants, expriment des gènes

codant pour des molécules connues pour intervenir dans la migration des neurones à GnRH-I

Page 57: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

57

(Nelf et la Sémaphorine 4D). Par exemple, des mutations affectant le gène codant Nelf sont

retrouvées dans des cas d’hypogonadisme hypogonadotrope (syndrome de Kallmann) (Miura

et al 2004). La caractérisation par RT-PCR et par immunocytochimie des cellules [GFP+] a

mis en évidence que ces cellules gliales correspondent à différentes sous-populations de

cellules olfactives engainantes.

Conclusion et modèle proposé

Ces résultats montrent que des cellules gliales précèdent et accompagnent les neurones à

GnRH-I au cours de leur migration. Ces cellules gliales peuvent être caractérisées comme des

cellules olfactives engainantes (OEC) en raison de la combinaison de marqueurs qu’elles

expriment. Néanmoins elles présentent une grande hétérogénéité phénotypique. Elles

expriment aussi des molécules connues pour être impliquées dans la migration des neurones à

GnRH-I. Ainsi, nous proposons dans ce premier article un modèle dans lequel les OEC

joueraient un double rôle : i) tout d’abord en tant que cellules "meneuses", qui dirigeraient la

migration des neurones à GnRH-I en créant un gradient chimiotactique ; ii) et d'autre part en

tant que support cellulaire en créant une matrice spécifique et un microenvironnement qui

faciliterait la migration de ces neurones.

Page 58: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

58

III. Article 2 :

Maturation des cellules gliales associées aux s neurones à GnRH-I en migration dans

le septum nasal

Schéma général des études menées

Dans cette étude, nous avons caractérisé l’évolution spatio-temporelle du phénotype

des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I en migration in vivo sur des souris

GnRH-GFP âgées de 11,5 jours de développement embryonnaire (E11,5) ainsi que des souris

GFAP-hGFP et des souris sauvages âgées de E12,5 E13,5 et E15,5.Pour mener à bien cette

étude, nous avons développé un nouvel anticorps anti-GnRH-I performant sur du tissu

embryonnaire.

Les progéniteurs gliaux engainent les neurones à GnRH-I de la sortie de l’organe

voméronasal à l’entrée du diencéphale

A partir de coupes sagittales de têtes d’embryons de souris âgés de 11.5 jours de

développement embryonnaire, nous avons mis en évidence la présence de progéniteurs gliaux,

BLBP-immunoréactif (ir) associés aux neurones à GnRH-I le long des axones voméronasaux

dans le septum nasal (NS). A partir de E12,5, nous avons détecté une association des deux

types cellulaires jusqu’à la partie proximale du nerf terminal au niveau de la jonction entre la

vésicule télencéphalique et le diencéphale.

Evolution du phénotype des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I en

migration

Dès E13,5, nous détectons des cellules gliales matures GFAP-GFP-ir qui engainent les

neurones à GnRH-1. La majorité des cellules GFAP-GFP-ir est observée dans le NS, et une

faible proportion est mise en évidence au niveau de la jonction naso-cérébrale et du bulbe

olfactif (NFJ-OB). A E13.5, a l’aide de doubles marquages dirigés contre la BLBP et GFAP-

GFP, nous détectons que plus de 70% des cellules gliales engainant les neurones à GnRH-I

sont simplement immunoréactives à la BLBP, dans le NS et au niveau de la NFJ-OB.

A E15,5 les cellules doublement marquées GFAP-GFP-ir et BLBP-ir sont la population gliale

majoritairement associée aux neurones à GnRH-I dans le NS. A ce stade, la proportion de

cellules doublement marquées au niveau de la NFJ-OB reste minoritaire.

Page 59: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

59

L’évolution spatio-temporelle du phénotype des cellules gliales associées aux neurones à

GnRH-I peut être interprétée comme une maturation précoce des cellules gliales du NS. La

caractérisation du phénotype de ces cellules gliales sur un champ plus large nous permet

d’affirmer que la maturation rostrale des cellules gliales olfactives n’est pas spécifique aux

cellules associées aux neurones à GnRH-I mais concerne l’environnement glial colonisant ces

différentes structures.

La quantification du microenvironnement cellulaire des neurones à GnRH-I en

migration

La quantification de ce microenvironnement révèle que plus de 60% des cellules associées

à ces neurones sont des cellules gliales (BLBP-ir et/ou GFAP-GFP-ir), quelque soit le stade

de développement et la localisation. De plus nous mettons en évidence que plus de 90% des

neurones à GnRH-I sont associés à au moins une cellule gliale (BLBP-ir et/ou GFAP-GFP-ir)

aux trois stades étudiés et ce, dans les deux régions d’intérêt. Cet environnement glial

constitue donc le microenvironnement majoritaire des neurones à GnRH-I en migration.

Conclusion

Une maturation rostrale des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I en

migration est mise en évidence au niveau du septum nasal. Les cellules gliales olfactives

colonisant la jonction entre le septum nasal et le diencéphale présentent un phénotype

immature. Ces résultats suggèrent donc que les cellules gliales immatures accompagnent les

neurones à GnRH-I jusqu’à l’entrée du diencéphale tandis que les cellules gliales maturent

arrêtent de migrer pour coloniser le septum nasal.

Page 60: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

60

Maturation des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I en

migration dans le septum nasal

Sarah Geller, Didier Lomet, Alain Caraty, Yves Tillet, Anne Duittoz and Pascal Vaudin

Physiologie de la Reproduction et des Comportements, UMR 0085 INRA, 6175 CNRS,

Université François Rabelais de Tours, IFCE, IFR135 Imagerie Fonctionnelle. 37380

Nouzilly. France

Résumé

Au cours du développement embryonnaire, les neurones à GnRH-I proviennent de la

placode olfactive et migrent de l’organe voméronasal au cerveau le long des nerfs

voméronasaux et du nerf terminal. Dans une précédente étude, nous avons mis en évidence

que les neurones à GnRH-I en migration présentent un microenvironnement glial chez la

souris. Dans cette étude, nous caractériserons l’évolution spatio-temporelle du phénotype glial

des neurones à GnRH-I en migration chez la souris in vivo de 11,5 jours de développement

embryonnaire (E11,5) jusque E15,5. Pour mener à bien cette étude, nous avons développé un

nouvel anticorps anti-GnRH-I performant sur le tissu embryonnaire. Notre étude met en

évidence la présence de progéniteurs gliaux, BLBP-immunoréactifs (ir), associés aux

neurones à GnRH-I dès 11.5 jours de développement embryonnaire le long des axones

voméronasaux dans le septum nasal (NS), puis dès E12,5 le long du nerf terminal au niveau

de la jonction entre la vésicule télencéphalique et le diencéphale. Les cellules gliales matures

GFAP-GFP-ir qui engainent les neurones à GnRH-I sont détectées dès E13.5 dans le NS, et en

faible proportion au niveau de la jonction naso-cérébrale et du bulbe olfactif (NFJ-OB). A ce

stade les doubles marquages BLBP et GFAP-GFP mettent en évidence que la majorité des

cellules gliales engainant les neurones à GnRH-I est simplement immunoréactive à la BLBP

dans les deux régions d’intêret. A E15,5 on observe que les cellules doublement marquées

GFAP-GFP et BLBP-ir sont les cellules gliales majoritairement associées dans le NS. La

proportion de cellules doublement marquées au niveau de la NFJ-OB reste minoritaire.

L’évolution spatio-temporelle du phénotype des cellules gliales associées aux neurones à

GnRH-I peut être interprétée par une maturation plus précoce des cellules gliales du NS qu’au

niveau de la NFJ-OB. La quantification de ce microenvironnement révèle que plus de 60%

des cellules associées à ces neurones sont des cellules gliales, quelque soit le stade de

développement et la localisation. Cet environnement glial constitue donc le

microenvironnement majoritaire des neurones à GnRH-I en migration.

Page 61: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

61

Introduction

Pour l’ensemble des mammifères, la fonction de reproduction est sous le contrôle d’un

décapeptide, la GnRH-I (Gonadotropin-Releasing Hormone). Les neurones qui produisent la

GnRH-I sont d’origine extra-cérébrale , puisqu’ils sont issus des placodes olfactives et

migrent pendant la vie embryonnaire le long des nerfs voméronasaux et du nerf terminal dès

11,5 jours de développement embryonnaire chez la souris (Schwanzel-Fukuda et al. 1989;

Wierman et al. 2010; Wray 2010). Ainsi, à l’âge adulte, leurs corps cellulaires se situent dans

deux régions distinctes de l’hypothalamus : la région septo-préoptique (qui regroupe le

septum médian et l’aire préoptique POA) et l’hypothalamus médio-basal (Jasoni et al. 2009;

Spergel et al. 1999).

Dans une précédente étude, nous avons mis en évidence, sur des cultures de placodes

olfactives, la présence de plusieurs sous-populations de cellules olfactives engainantes (OEC)

environnant les neurones à GnRH-I (Geller et al., 2012). En effet, une grande variabilité du

phénotype de ces cellules gliales a été observée in vitro (Geller et al., 2012). Cependant un

des marqueurs, la BLBP (Brain Lipid Binding Protein) est exprimée par 90,4% des OEC dont

62,3% co-exprimaient la GFAP après 10 jours de culture (Geller et al., 2012). La BLBP ou

FABP7 (Fatty Acid-Binding Protein), est un membre spécifique d’une large famille de

protéines de liaison de ligands hydrophobes (Feng et al. 1994). Elle est connue en tant que

marqueur des cellules gliales radiaires dans le système nerveux central (NSC) (Anthony and

Heintz 2007; Anthony et al. 2004; Feng et al. 1994). Les progéniteurs des OEC (pOEC)

exprimant la BLBP sont détectés dans la région de la placode olfactive entre E10-E11

(Anthony et al. 2004; Murdoch and Roskams 2007). Le traçage du lignage dans le système

olfactif à l’aide de souris transgéniques BLBP-Cre/Rosa26, a révélé que l’expression de la

BLBP est spécifique aux cellules gliales qui engainent les axones, dès la naissance des nerfs

dans la lamina propria présomptive (Murdoch and Roskams 2007). Ce profil d’expression a

été confirmé chez les souris transgéniques BLBP-GFP (Miller et al. 2010) et par la détection

de l’immunoréactivité à la BLBP (Carson et al. 2006; Murdoch and Roskams 2008). In vitro,

il a également été mis en évidence, à partir de jeunes colonies semi-adhérantes d’EO, que les

cellules mitotiques de type glioblastique exprimant la BLBP donnent exclusivement des

cellules gliales immunoréactive à la protéine S100β (Murdoch & Roskams, 2008). Ainsi la

BLBP est un marqueur précoce des OEC. La GFAP quant à elle, est connue en tant que

marqueur plus tardif des OEC au cours du développement embryonnaire et post-natal (Astic

Page 62: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

62

et al. 1998; Pellitteri et al. 2010; Valverde et al. 1992) et est décrit comme un marqueur tardif

des OEC (Astic et al. 1998).

Dans notre précédente étude in vivo, les neurones à GnRH-I en migration présentaient un

environnement glial GFAP-GFP à partir de E12,5 de la sortie du VNO jusqu’ à la jonction

naso-cérébrale (NFJ), mais l’évolution du phénotype de ces cellules gliales n’avait pas été

finement caractérisé puisque seul le marqueur tardif GFAP (via la détection de la GFP) avait

permis d’établir la cinétique de développement (Geller et al 2012). Afin de pouvoir étudier

l’implication de ces cellules gliales dans l’ontogenèse des neurones à GnRH-I il était

important de pouvoir les caractériser au cours du temps, et en particulier de suivre l’évolution

spatiale et temporelle des formes précoces et matures des OEC.

L’objectif de cette étude est de caractériser l’évolution du phénotype de

l’environnement glial des neurones à GnRH-I in vivo, au cours du développement, à l’aide

d’un marqueur précoce des OEC, la BLBP et d’un marqueur plus tardif des OEC, la GFAP en

utilisant des souris transgéniques GFAP-GFP.

Ce travail a permis de montrer la présence d’un environnement BLBP-ir associé aux

neurones à GnRH-GFP en migration dès E11,5, le long des axones voméronasaux, eux même

caractérisés par leur immunoréactivité à la périphérine. A l’aide d’animaux transgéniques

GFAP-GFP et d’immunomarquages dirigés contre la BLBP, nous caractérisons l’évolution

spatio-temporelle du phénotype des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I. Dans

cette étude nous considèrons que des cellules sont associées si la distance qui sépare les

noyaux des deux types cellulaires est inférieure ou égale à la taille d’un noyau. Nous

comparons le phénotype des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I à celui des

cellules gliales environnantes sur une surface de 155µm2

(qui correspond à un champ

d’observation au microscope confocal, avec un objectif x40). Pour mener à bien cette étude, il

a été nécessaire de réaliser des triples marquages et donc de développer un nouvel anticorps

anti-GnRH-I performant sur le tissu embryonnaire.

Page 63: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

63

Matériel et méthode

Animaux

Les lignées de souris transgéniques hémizygotes FVB/N-Tg (GFAP-GFP) ont été fournies par

le Laboratoire Jackson (USA). Les animaux ont été hébergés dans l’unité expérimentale de

physiologie animale (INRA, Tours, France) selon les conditions décrites dans l’étude

précédente (Geller et al 2012). Les souris hémizygotes FVB/N-Tg (GFAP-GFP) ont été

détectées par PCR.

Antisérum contre la GnRH-I

L’anticorps GnRH-I #517 a été obtenu après immunisation de béliers avec le peptide

EHWSYGLRPG-NH2 (GnRH-I) (Aneosystem, Groupe NSPE, France) couplé à la BSA,

selon le protocole précedemment décrit par Caraty et al 1980.

Dosage radio-immunologique

La réactivité croisée de plusieurs séquences de peptides GnRH-I (GnRH-I, GnRH-II, GnRH-

Hyp9 et GnRH-2-10) avec du GnRH-I marquée à l’Iode 125 (GnRH-I125

, Sigma L7134) sur

les anticorps GnRH-I #517 (dilué au 1 :150 000 dans du PBS glycérolé), a été testée par

radio-immunologie selon le protocole précémment décrit par Caraty et al 1980. La séquence

des acides aminés du peptide GnRH-II de poulet (Peninsula, 7210) possède une similarité de

70% avec celle du GnRH-I (Figure 1). Elle diffère principalement en Cterm, avec la présence

d’un Tryptophan en position 7 et d’une Tyrosine en position 8 au lieu d’une Leucine et d’une

proline. (Figure 1). La séquence de GnRH-HyP9 (Neosystem, SP89180C) consiste en

l’hydroxylation de la Proline en position 9. Le peptide GnRH-2-10 (NeoMPS) possède la

séquence du GnRH-I avec une délétion de l’acide glutamique (E) en position 1.

Préparation du tissu pour les études d’immunohistochimie

Pour la caractérisation de l’anticorps anti-GnRH-I #517, les souris adultes ont été anesthésiées

par injection intra-péritonéal de sodium pentobarbital (CEVA Santé Animale, France;

8mg/40g de poid corporel) avant d’être perfusées en intracardiaque avec 32ml de nitrite de

sodium 1% puis 160ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4% préparé dans 0,1M de solution

tampon phosphate (PBS, PH 7,4). Les cerveaux prélevés sont conservés dans une solution de

sucrose à 30% à 4°C puis enrobés de Tissue-Tek (Sakura-Fnetek, Europe BV, Zoeterwoude,

Page 64: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

64

The Netherlands) avant d’être congelés dans de la neige carbonique. Trois séries de coupes

frontales consécutives de l’hypothalamus (coupes flottantes de 30µm) ont été réalisées à

l’aide d’un cryostat Leica CM 3050S (Leica Biosystems, Nanterre, France) puis conservées

dans du PBS Azide 0,1% à 4°C.

Après euthanasie des femelles gestantes par dislocation cervicale, les embryons

hémizygotes FVB/N-Tg (GFAP-GFP) et sauvages FVB/N (âgés de E11,5, E12,5, E13,5 et

E15,5) ont été prélevés. Les têtes des embryons ont été fixées, puis conservés dans du PBS-

sucrose 30% avant d’être congelées selon le protocole décrit dans l’étude Geller et al 2012.

Des coupes sagittales consécutives de 20µm ont été montées sur des lames SuperforstPlus

(thermo Fisher scientific Inc, Waltham, MA, USA) puis conservées à -20°C.

Immunohistochimie

Les produits dont l’origine n’est pas précisée ont été fournis par Sigma Aldrich (Lyon,

France).

Coupes de cerveaux adultes

Les coupes flottantes de cerveaux de souris adultes homozygotes GnRH-GFP C75Bl6 (n=3)

et sauvages FVB/N (n=3) ont étés incubées 20 minutes à température ambiante dans un milieu

de blocage PBS-BSA2 (PBS avec 2% de sérum albumine bovin (BSA) et 0,3% de Triton).

Après blocage, la première série de coupes de chaque cerveau a été incubée avec l’anticorps

anti-GnRH-I #517 (fait chez le mouton) dilué au 1 : 10 000 dans du PBS-BSA2 pendant une

nuit à 4°C sous agitation. Après 3 rinçages de 10 minutes dans du PBS, les coupes ont été

incubées avec l'anticorps secondaire anti-IgG de mouton CY3 (Jackson ImmunoResaearch,

IgG H+L) dilué au 1 : 500 dans du PBS-BSA2 pendant 2h30 à température ambiante sous

agitation.

Coupes de têtes d’embryons

L’ensemble des coupes de têtes d’embryons ont été incubées 20 minutes à température

ambiante dans un milieu de blocage PBS-BSA10 (PBS avec 10% de BSA et 0,3% de Triton).

Simple marquage de l’anticorps GnRH-I #517

Pour la caractérisation de l’anticorps GnRH-I #517 fait (chez le mouton), les coupes de têtes

d’embryons de souris sauvages FVB/N âgés de E15,5 (n=2) et des coupes des souris

homozygotes GnRH-I-GFP C75Bl6 de E15,5 (n=1) ont été incubées avec l’anticorps GnRH-I

#517 fait chez le mouton dilué au 1 : 1 000 dans du PBS-BSA10 pendant une nuit à 4°C. Les

coupes des têtes d’embryons de souris GnRH-I-GFP ont également été incubées avec de

Page 65: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

65

l’anticorps anti-GFP fait chez le poulet (1:1000, Abcam ab13970). Après 3 rinçages de 10

minutes au PBS, les coupes ont été incubées avec de l’anti-IgG de mouton et de l’anti-IgY de

poulet (pour les coupes GnRH-I-GFP) dilué dans du PBS-BSA2 pendant 2h30 à température

ambiante.

Triples marquages

Les coupes d’embryons hémizygotes FVB/N-Tg (GFAP-GFP) âgés de E12,5 à E15,5 (n=11)

ont été incubées pendant une nuit à 4°C avec les anticorps primaires anti-BLBP fait chez le

lapin (1:1000, Millipore AB9558), anti-GFP fait chez le poulet (1:1000, Abcam ab13970) et

anti-GnRH-I #517 fait chez le mouton dilués dans du PBS-BSA10. Après 3 rinçages de 10

minutes au PBS, les coupes ont été incubées avec les anticorps secondaires anti-IgG-lapin

Alexa Fluor 647 (au 1 : 1000, Molecular Probes #A31573) et anti-IgG-mouton Fab Cy3 (au

1 : 500, Jackson ImmunoResearch #713-166-174) dilués dans du PBS-BSA10 pendant 2h30 à

température ambiante. Les coupes ont ensuite été rincées au PBS, 3 fois pendant 10 minutes,

puis la révélation de la GFP a été réalisée par incubation d’anticorps anti-IgY-poulet biotinylé

(1:500, Vector, BA-9010), incubées pendant 2h à température ambiante, puis après 3 rinçages

au PBS, les coupes ont été incubées avec une Streptavidine DyLight-488 (1:1000, Jackson

Immunoresearch, #016-480-084) pendant 1h à température ambiante.

Des triples marquages utilisant deux antisérums primaires de lapin ont également été

réalisés (Negoescu et al. 1994). Les coupes d’embryons sauvages FVB/N (âgés de E12,5 à

E15,5, n=9) et les coupes d’embryons homozygotes GnRH-I-GFP (âgés de E11,5, n=4) ont

été incubées respectivement avec le sérum GnRH-I #517 ou avec de l’anti-GFP. Ces coupes

ont également été incubées avec l'anticorps anti-BLBP dilué dans du PBS-BSA10 pendant

une nuit à 4°C. Après 3 rinçages de 10 minutes au PBS, les coupes ont été incubées avec les

anticorps secondaires anti-IgG-mouton Fab Cy3 ou anti-IgY-poulet FITC (1 : 1000, Jackson

ImmunoResearch 703-095-155) et anti-IgG-lapin Alexa 647, dilués dans du PBS-BSA10

pendant 2h30 à température ambiante. Les coupes ont ensuite été rincées 5 fois dans du PBS

pendant 10 minutes, puis un second blocage a été réalisé avec du sérum de lapin normal dilué

au 1:500 dans du PBS-BSA10, pendant 30 min. Après 5 rinçages dans du PBS pendant 10

minutes, une saturation des gammaglobulines de lapin a été réalisée avec des fragments Fab

d’anticorps anti-IgG-lapin non marqués (dilués au 1:500 dans du PBS avec 0,3% de Triton,

Jackson ImmunoResearch 111-007-003) pendant 1h. Après 5 rinçages au PBS pendant 10

minutes, les coupes ont été incubées avec l'anticorps primaire anti-périphérine fait chez le

lapin (1:1500 Millipore AB1530) dilué dans du PBS-BSA10 pendant une nuit à 4°C. Les

Page 66: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

66

coupes ont été rincées 3 fois au PBS pendant 10 minutes, puis incubées avec l’anticorps

secondaire anti-IgG-lapin Alexa 555 (1 : 1000, Molecular Probes A31572) ou Alexa 488 (1 :

500, Molecular Probes A21206).

Pour l’ensemble des coupes, les noyaux ont été marqués avec une solution de Hoechst

33258 à 2 µg/ml (Molecular Probes, Invitrogen) pendant 2 minutes. Les coupes ont été

montées entre lame et lamelle avec du Fluoromount (Southern Biotech, Birmingham,

Alabama, USA).

Contrôle de spécificité du marquage

Pour contrôler la spécificité de l’anticorps anti-GnRH-I #517, des tests de pré-

absorption avec du peptide GnRH-I (Sigma, L7134) ont été réalisés. Le GnRH-I a été incubé

toute la nuit à 4°C à différentes concentration (25µM et 250µM) avec l’anticorps primaire

GnRH-I #517 (dilué au 1:10 000 pour les tissus adulte ou au 1:1000 pour les tissus

embryonnaires). Puis, l’immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment, sur la

première séries de coupes de cerveaux de souris adultes sauvages FVB/N et sur des coupes de

têtes d’embryons de souris sauvages FVB/N.

Acquisition et observation

Les observations ont été faites à l’aide d’un confocal Zeiss LSM 700 et le logiciel

associé ZEN. Des piles d’images de 1024 par 1024 pixels ont été acquises séquentiellement

(la résolution du z était de 0,5µm et de 1µm) avec l’objectif à immersion x40. Des mosaïques

ont également été réalisées (image de 512 par 512 pixels) avec l’objectif x20.

Pour les comptages, les observations ont été faites à l’objectif x40 et le noyau de chaque

cellule immunoréactive à la GnRH-I a été centré sur les trois plans de l’espace x, y, z. Les

cellules immunoréactives à la BLBP et à la GFP dans chaque champ observé (de 155 µm2)

sont considérées comme étant l’environnement glial des neurones à GnRH-I. Nous

considérons une cellule associée aux neurones GnRH-I toute cellule dont la distance qui

sépare le noyau de cette cellule et le noyau du neurone à GnRH-I est inférieure ou égale à

deux fois le rayon d’un noyau de cellule gliale, soit selon les mesures réalisées dans cette

étude le diamètre de la cellule est ≤ 6,05µm. Les mesures et les comptages ont été réalisés à

l’aide du logiciel ZEN.

Page 67: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

67

Statistiques

Les tests statistiques ont été réalisés sur le logiciel statistique Prism 4.0 (GraphPad

Software Inc., La Jolla, USA). Pour chaque analyse, nous avons calculé la moyenne et l’écart

standard à la moyenne (ESM). Afin de tester la présence de différences significatives entre les

moyennes des proportions des trois phénotypes gliaux (BLBP-ir, GFP-ir et BLBP-GFP-ir ) en

fonction du stade de développement (E12,5 E13,5 et E15,5) et de la région (NS ou NFJ), une

analyse de variance à deux facteurs avec mesures répétées (Two-way ANOVA) a été réalisée.

Celle-ci nous permet également de déterminer une possible interaction entre les deux

paramètres (le stade embryonnaire et la région), pour chaque type glial. Lorsque cette dernière

était significative, une comparaison des échantillons deux à deux à l’aide d’un « posthoc » t-

tests avec une correction de Bonferroni a été réalisée.

Résultats

Afin de caractériser l’évolution phénotypique de microenvironnement glial des neurones à

GnRH-I en migration, nous avons utilisé un marqueur de progéniteurs des cellules gliales

engainantes, la BLBP, et un marqueur de cellules gliales matures, la GFAP, sur des coupes

d’embryons âgés de E11,5 à E15,5. Pour mener à bien cette étude un sérum anti-GnRH-I fait

chez le mouton (GnRH-I#517) a été développé et caractérisé

Caractérisation de la spécificité de l’anticorps GnRH#517

Analyse par dosage radio-immunologique

L’analyse par dosage radio-immunologique montre une diminution de la liaison du GnRH-I125

à l'anticorps GnRH-I #517 corrélée l’augmentation de la concentration de peptide GnRH-I

(Figure 1). Nous avons analysé la possibilité d’une réaction croisée du GnRH-I125

avec des

peptides de séquences similaires : le GnRH-2-10, le GnRH-HyP9 et le GnRH-II, sur

l'anticorps GnRH-I#517. Nous observons une inhibition minime (<1%) avec le GnRH-II de

poulet (Figure 1), qui ne présente pas les mêmes acides-aminés que le GnRH-I en position 7

et 8 en Cterm. Une légère réaction croisée (<10%) est observée avec le peptide GnRH-Hyp9

(Figure 1) qui présente une hydroxylation de la Proline en Cterm. L’augmentation de la

concentration du GnRH-2-10, qui est modifié en position Nterm, induit une diminution de la

liaison de l’anticorps au GnRH- I125

(Figure 1). Ainsi la reconnaissance de l’antigène par

l’anticorps nécessite que l’extrémité C-term de l’antigène ne soit pas modifié. Ces résultats

Page 68: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

68

Figure 1 : Courbe d’inhibition de la liaison du peptide GnRH-I et de dérivés synthétiques

à l’anticorps GnRH-I #517, obtenue par dosage radio-immunologique. (A) Une diminution

de la liaison du GnRH-I125

à l'anticorps GnRH-I #517 est observée avec l’augmentation de la

concentration (en pg/ml) du peptide GnRH-I. On observe une importante réaction croisée de

l’anticorps avec le GnRH-2-10, légère avec le GnRH-HyP9 et minime avec le GnRH-II. (B)

Comparaison des séquences des acides aminés du GnRH-I « mammalien » et du GnRH-II « de

poulet ».

Page 69: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

69

montrent donc non seulement la spécificité de l'anticorps GnRH-I #517 vis-à-vis du GnRH-I

mais également l’importance des acides aminés C-terminaux pour la liaison à l'anticorps.

Caractérisation de l’anticorps GnRH-I#517 sur tissus adulte et embryonnaire

La spécificité du marquage a été confirmée par l’absence de celui-ci lors d’un défaut

d’anticorps primaire lors de la première incubation. Les analyses immunohistochimiques

révèlent un marquage ponctiforme des corps cellulaires et des fibres immunoréactives au

GnRH-I#517, sur les tissus adulte et embryonnaire (Figure 2 et Figure 3).

L’immunomarquage de coupes frontales d’hypothalamus de souris adulte GnRH-I-GFP nous

a permis de mettre en évidence que la majorité des corps cellulaires GnRH-GFP sont

immunoréactifs au GnRH-I #517 au niveau du septum médian et des bandes diagonales de

Broca (donnée non illustrée), de l’aire pré-optique médiane et du noyau prés-optique antéro-

ventral (Figures 2A et 2F) et médian (MPOM) (donnée non illustrée). On observe, sur les

coupes rostrales de l’hypothalamus, un grand nombre de fibres immunoréactives au GnRH-I

#517 qui contiennent faibelement de la GFP (Figures 2A’’). Afin de confirmer la spécificité

du marquage observé, des tests de pré-absorption du sérum GnRH-I #517 avec des

concentrations croissantes d’antigènes GnRH-I, ont été réalisés sur des coupes frontales

d’hypothalamus de souris sauvages (Figures 2B’, 2C’, 2D’, 2E’). Lorsque le sérum GnRH-I

#517 a été pré-absorbé avec 25µM de GnRH-I, on observe une abolition du marquage des

corps cellulaires dans l’aire pré-optique (POA, Figure 2B, B’), et une diminution importante

du marquage des fibres le long du 3ème ventricule dans le noyau arqué postérieur (ArcP) et

dans l’éminence médiane EM (Figures 2C, C’). Une pré-absorption du sérum GnRH-I #517

avec 250µM de GnRH-I entraine une abolition du marquage, aussi bien des corps cellulaires

(Figures 2D, D’) que des fibres (Figures 2E, E’).

Notre étude s’intéresse aux neurones à GnRH-I en migration au cours du

développement embryonnaire, de ce fait nous avons également caractérisé cet anticorps par

immunohistochimie sur des coupes sagittales de têtes d’embryons de souris âgées de 15,5

jours (E15,5). Les marquages d’embryons de souris GnRH-GFP, montrent que les corps

cellulaires et les fibres GnRH-GFP sont immunoréactives au GnRH-I #517 dans le septum

nasal (NS) (non illustré), au niveau de la jonction naso-cérébrale (NFJ) mais également dans

le diencéphale (Die) (Figure 3A, A’). Dans le VNO, une faible proportion de cellules GnRH-

GFP est immunoréactive au GnRH-I#517 (non illustré). Des marquages avec l’anticorps

GnRH-I#517 ont également été réalisés sur des coupes d’embryons sauvages (Figure 3B-B’).

Page 70: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

70

Page 71: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

71

Figure 2 : Caractérisation immunohistochimique de l’anticorps GnRH-I #517 sur des coupes

frontales de cerveaux de souris adultes. (A-A’’) Immunoréactivité des corps cellulaires GnRH-

GFP à l’anticorps GnRH-I#517 dans l'APO. (B-E) Immunoréactivité à l’anticorps anti-GnRH-

I#517 sur des coupes consécutives de l'APO (B, B’ et D, D’) et d’EM (C, C’ et E, E’) marqués avec

l’anti-GnRH-I#517 dans des conditions témoin (CT) et après pré-absorption avec 25µM de

GnRH-I (B’, C’) et 250µM de GnRH-I (D’, E’). (F) Plan focal en Z-compilé (Z=0,5µm) illustrant

un co-marquage de corps cellulaires GnRH–GFP et GnRH-I#517-ir et correspondant à un

grossissement de l’encadré de l’image A’’. (G) Compilation de plans focaux (8µm) illustrant le

marquage ponctiforme des corps cellulaires et des fibres GnRH-I#517-ir, et correspondant au

grossissement de l’encadré de l’image B. Echelles : (A-E) : 100µm, (F, G) :10µm

Page 72: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

72

Figure 3 : Caractérisation immunohitoshimique de l’anticorps GnRH-I #517 sur des coupes

sagittales de tête d’embryons âgés de E15,5. (A-A’) Immunoréactivité à l’anticorps GnRH-I#517 des

corps cellulaires GnRH-GFP au niveau de la jonction naso-cérébrale (NFJ) et dans le Diencéphale

(Die). (B-B’) Immunoréactivité à la GnRH-I sur des coupes consécutives de têtes d’embryons

marquées avec l’anti-GnRH-I#517 dans des conditions témoins (CT-#517, B) et après pré-absorption

avec 250µM de GnRH-I (Ag-250µM, B’). OB : bulbe olfactif, NS : septum nasal, cp : lame criblée de

l’ethmoïde. Echelle : 200µm

Page 73: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

73

La pré-absorption du sérum GnRH-I #517 avec 250µM de GnRH-I sur des coupes

consécutives, abolit le marquage dans le NS (non illustré), au niveau de la NFJ et au niveau

du diencéphale (Figure 3B’).

Caractérisation de l’environnement des progéniteurs gliaux BLBP-ir des neurones à

GnRH-I en migration

Dans un premier temps, nous avons caractérisé l’environnement de progéniteurs gliaux

BLBP-ir des neurones à GnRH-I à E11,5 (n=3), E12,5 (n=4), E13,5 (n=7) et E15,5 (n=7).

A E11,5, la faible intensité de l’immunomarquage du GnRH-I réalisé à partir du sérum

GnRH-I#517 nous a obligé à utiliser des souris transgèniques GnRH-GFP. Ainsi, on observe

que la majorité des neurones à GnRH-GFP-ir sont dans le VNO (Figure 4A). Seuls les

neurones qui ont entamé la migration nasale le long d’axones périphérine-ir (Figure 4A)

présentent un environnement de progéniteurs d’OEC (pOEC) BLBP-ir (Figure 4B). A ce

stade, l’immunoréactivité de la BLBP est faible et est principalement de type fibrillaire

(Figure 4B). Les neurones GnRH-GFP détectés dans l’organe voméronasal (Figure 4A) ne

présentent pas d’environnement glial BLBP-Ir (Figure 4B).

Page 74: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

74

Figure 4 : Environnement glial BLBP-Ir des neurones à GnRH-I le long des axones

voméronasaux et du nerf terminal sur des coupes para-sagittales d’embryons âgés de E11,5 à

E15,5. (A, C, I, J) Coupes para-sagittales de têtes d’embryons illustrant les progéniteurs OEC

BLBP-ir associés aux neurones GnRH-I le long des axones périphérine-Ir (peri). (B, D-G)

Grossissements des zones encadrées sur les photographies A, C et I (Z=2,5µm). B, D, E ,F

illustrent les cellules BLBP-ir associées aux neurones à GnRH-I à la sortie du VNO à E11,5 (B) et

E12,5 (D), au niveau de la jonction naso-cérébrale (NFJ) à E12,5 (E), au niveau de la jonction

entre le télencéphale et diencéphale à E12,5 (F). F-G illustrent, dans le diencéphale, la présence

de cellules BLBP-ir à proximité de cellules GnRH-ir (tête de flèche) et le long de fibres

périphérine-ir (flèche) à E12,5 (F) et E15,5(I). Les noyaux sont colorés en bleu. OB : bulbe

olfactif, oe : épithélium olfactif, POA : aire pré- optique, Die : diencéphale, (*) : désigne les

structures présomptives. Echelles : (A, C, H, I) 200µm (B, D-G) 40µm.

Page 75: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

75

Figure 4

Page 76: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

76

Dès E12,5, nous pouvons observer le long d’axones périphérine-ir, des cellules GnRH-

I-ir associées aux cellules BLBP-ir, dans le septum nasal dès la sortie du VNO, au niveau de

la jonction naso-cérébrale (NFJ) jusqu’à la jonction entre le bulbe olfactif (OB) et le

diencéphale (die) (Figure 4C). A la sortie du VNO, le long des axones périphérine-ir (Figure

4C), les neurones immunoréactifs à la GnRH-I sont engainés par des corps cellulaires et des

fibres BLBP-ir (Figure 4D). Ainsi ces cellules BLBP-ir semblent former des « rails » dans le

septum nasal (Figures 4D, 4C). Au niveau de la jonction naso-cérébrale (NFJ), on peut

observer une masse cellulaire BLBP-ir dans laquelle sont détectées des grappes de neurones

immunoréactifs à la GnRH-I (Figures 4C, E). En quantité moindre, on observe également des

corps cellulaires BLBP-ir jusqu’au niveau de la jonction entre la vésicule du télencéphale et la

partie proximale du diencéphale (Figures 4C, 4F). En effet, au niveau de la partie ventrale du

bulbe olfactif, on observe la présence de quelques corps cellulaires BLBP-ir le long de fibres

périphérine-ir (Figure 4F). La morphologie fusiforme de ces cellules BLBP-ir s’apparente à

celle observée dans le système olfactif périphérique (Figure 4F versus Figure 4D). Les

neurones GnRH-I-ir détectés dans cette région sont également associés à des corps cellulaires

BLBP-ir (tête de flèche, Figure 4F) et des fibres BLBP-ir (Figure 4F).

A E13,5 et E15,5, on observe également la présence de cellules BLBP-ir , le long des

axones périphérine-ir dans le septum nasal (Figure 4H et 4I), dès la sortie du VNO (Figure

4H et 4I, Figure 5A, 5C), ainsi qu’au niveau de la NFJ (Figure 4H et 4I, Figure 5E) et le

long des axones qui longent la partie ventrale du OB (Figure 4I, Figure 5G). A E13,5 dans le

septum nasal, on constate une association étroite entre les cellules BLBP-ir et les corps

cellulaires GnRH-ir (Figure 5B, B’) et avec leurs prolongements cytoplasmiques (Flèche,

Figure 5B). Cette proximité est également observée dans les trois plans de l’espace, au niveau

de la NFJ, entre les corps cellulaires GnRH-ir et les corps cellulaires BLBL-ir et/ou les fibres

BLBP-ir (Figure 5F, F’). A E15,5 on peut observer dans le NS (Figure 5D, D’) et au niveau

de la NFJ (non illustré) un manchon de cellules BLBP-ir engainant les corps cellulaires

GnRH-Ir. Les grappes de neurones immunoréactifs à la GnRH-I qui migrent dorsalement au

OB sont également associées à des cellules BLBP-ir, jusqu’à la jonction avec le diencéphale

(Figure 5G, G’). A ce stade, dans le diencéphale, on peut observer la présence de cellules

fusiformes BLBP-ir le long de prolongements périphérine-ir (Flèche, Figure 4G), mais

également à proximité de neurones GnRH-I (Tête de flèche, Figure 4G).

Page 77: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

77

Ainsi, on observe un environnement BLBP-ir des neurones à GnRH-I dès E11,5 à la

sortie du VNO. Entre E12,5 et E15,5 une association étroite des deux types cellulaires se met

en place le long des axones du VNO jusqu’à la jonction entre le bulbe olfactif et le

diencéphale.

Caractérisation de l’évolution spatio-temporelle du phénotype des cellules gliales

associées aux neurones à GnRH-I

Pour caractériser l’évolution du phénotype des cellules gliales associées aux neurones

à GnRH-I en migration, nous avons utilisé un marqueur de progéniteurs des OEC : la BLBP,

et un marqueur d’OEC tardif : la GFAP. Nous avons distingué deux régions d’intérêt : i) la

voie de migration olfactive qui correspond à la zone de migration rostrale des neurones à

GnRH-I i.e. le septum nasal (NS) délimité par le VNO et la lame criblée de l’ethmoïde; ii) la

zone de transition entre le septum nasal et le diencéphale, où les neurones à GnRH-I

s’orientent ventralement avant d’entamer leur migration tangentielle dans le système nerveux

central. Cette zone comprend donc la jonction entre le septum nasal et la vésicule

télencéphalique (NFJ) ainsi que le passage à travers cette vésicule, qui se différenciera en

bulbe olfactif (OB).

Figure 5 : Evolution spatio-temporelle du phénotype de l’environnement glial des

neurones à GnRH-I en migration dans le septum nasal (NS) et au niveau de la jonction

(NFJ-BO*) de E12,5 à E15,5. (A, C, E, G) compilation de plans focaux illustrant

l’environnement glial BLBP-ir et GFAP-GFP-ir des neurones GnRH-I-ir dans le NS à E13,5

(A) et E15,5 (C), au niveau de la jonction naso-cérébrale (NFJ) à E13,5 (E), et au niveau de la

jonction entre le bulbe olfactif (BO) et le diencéphale (Die) à E15,5 (G). (B-B’’, D-D’’, F, H)

Représentation en 3D (Z-stack) des grossissements des zones encadrées en A, C, E, G. Les

noyaux sont colorés en bleu. Echelles : (A, C, E, G) : 50µm, (B-B’’, D-D’’, F, H) : 10µm. (I,

J) Histogramme représentant la proportion des cellules BLBP-ir , BLBP-GFP-ir et GFP-ir

associées aux neurones à GnRH-I (I) et environnantes aux neurones à GnRH-I, sur une surface

de 155µm2 (J) au niveau du NS et de la zone comprenant la NFJ et le OB à E12,5 (n=3), E13,5

(n=5) et E15,5 (n=4). Les différences statistiques inter-régions sont désignées par des étoiles :

(*) pour les cellules BLBP-ir, (**) pour les cellules BLBP-GFP-ir. Les différences statistiques

inter-stades

Page 78: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

78

Figure 5

Page 79: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

79

Contrairement à l’immunofluorescence de la BLBP qui est détectée à E11,5, celle de

la GFAP-GFP est détectée dans le septum nasal à partir de E13,5 (Figures 5A et 5I). A E13,5,

seule une faible proportion de cellules GFAP-GFP simplement marquées est associée aux

neurones à GnRH-I dans le septum nasal (7,7±3,7% Figure 5B’’, 5I). Dans cette région,

15±4,8% des cellules GFAP-GFP-ir associées aux neurones à GnRH-I co-expriment la BLBP

(Figure 5B et 5I). Au niveau de la NFJ-OB une faible proportion de cellules GFAP-GFP-ir

simplement marquées et doublement marquées, avec la BLBP, est mise en évidence

(5,7±2,5% versus 3,3±1,7, Figure 5E, 5F, 5I). Les cellules BLBP simplement marquées

représentent la glie majoritairement associée aux neurones à GnRH-I dans le NS (77,4±7,6%,

Figures 5A-B’, 5I) et dans la NFJ-OB (91±3,6%, Figures 5E, 5F, 5I).

A E15,5, on détecte un grand nombre de cellules GFAP-GFP-ir dans le septum nasal

(Figure 5C). La majorité de ces cellules GFAP-GFP associées aux neurones à GnRH-I sont

doublement marquées à la BLBP (46,4±5,3%, Figures 5D et 5I). Les cellules GFAP-GFP

simplement marquées représentent 6,5±1,7% des cellules gliales associées à ces neurones

(Figure 5D’’, 5I). Au niveau de la NFJ-OB, les cellules BLBP simplement marquées

représentent 89,8±5,06% des cellules gliales associées aux neurones immunoréactifs à la

GnRH-I (Figure 5H, 5I). 8,3±5,1% des cellules gliales associées à ces neurones sont

doublement-immunoréactives à la GFP et à la BLBP (Figures 5H, 5I).

Ainsi, entre E12,5 et E15,5, nous observons une différence significative de la

proportion de cellules doublement immunoréactives, à la GFAP-GFP et à la BLBP, entre les

stades (p≤ 0,001), mais également entre les deux régions analysées, le septum nasal et la

jonction nasao-cérébrale (p≤ 0,001). Une différence significative de la proportion de cellules

mono-marquées à la BLBP est également mise en évidence entre les stades (p≤ 0,002) et entre

ces deux régions (two way ANOVA, p≤ 0,001). En ce qui concerne les cellules mono-

marquées GFAP-GFP-ir, nous n’observons pas de différence significative entre les stades et

les régions. L’ANOVA a deux variables nous permet de mettre en évidence une interaction

entre les deux facteurs (régions et stades de développement) pour les deux premiers types

cellulaires, à p≤ 0,01 pour les cellules BLBP-ir et à p≤0.0005 pour les cellules doublement

immunoréactives. Ainsi l’évolution du phénotype des cellules gliales associées aux neurones

à GnRH-I au cours du développement embryonnaire (entre E12,5 et E13,5) dépend de leur

localisation (entre le NS et la NFJ-OB). De même, les différences de phénotypes présents

dans ces 2 régions dépendent du stade de développement.

Page 80: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

80

Afin d’identifier les groupes intéressés par ces différences statistiques, nous avons entrepris

des analyses deux à deux (Figure 5E). Nous avons comparé les différences de proportion de

chaque phénotype antigénique glial entre les deux régions d’intérêt. A E13,5 on observe, une

proportion de cellules BLBP-ir qui tend à diminuer (p=0,08) entre le NS et la NFJ-OB. Cette

diminution est corrélée avec une augmentation significative de la proportion de cellules

doublement-ir (BLBP-ir et GFP-ir) dans le septum nasal (Figure 5I). A E15,5, on observe une

diminution significative de la proportion de cellules BLBP-ir entre le NS et le NFJ-OB

(Figure 5I) et une augmentation significative de la proportion de cellules doublement-ir

(BLBP-ir et GFP-ir ) (Figure 5I). Nous nous sommes intéressés aux différences de

proportions de chaque phénotype antigénique glial en fonction du stade de développement

pour chaque région. Dans le septum nasal, on observe une diminution significative du nombre

de cellules BLBP-ir entre E12,5 et E13,5 (Figure 5I) et entre E13,5 et E15,5 (Figure 5I).

Cette diminution de la proportion de cellules BLBP-ir est corrélée avec une augmentation du

nombre de cellules qui co-expriment la GFAP (Figure 5I). Au niveau de la NFJ-OB, la

proportion de cellules gliales simplement marquées (BLBP-ir) et doublement marquées

associées aux neurones à GnRH-I, ne présentent pas de différences significatives entre les

trois stades de développement, bien que l’on commence à détecter des cellules GFP-ir à partir

de E13,5. Ces résultats montrent donc que le phénotype des cellules gliales associées aux

neurones à GnRH-I évolue différemment en fonction de la région. Au cours du

développement, la population de cellules exprimant la GFAP devient plus importante dans le

septum nasal qu’au niveau de la zone de transition entre la lame criblée de l’ethmoïde et le

diencéphale. Ces résultats suggèrent également que le phénotype des cellules gliales

engainant ces neurones à GnRH-I dans le septum nasal change entre E12.5 et E15.5 en

favorisant l’expression de la GFAP.

Quantification du microenvironnement glial BLBP-ir et/ou GFAP-GFP-ir associé aux

neurones à GnRH-I en migration

Nous avons vérifié si les changements du phénotype antigénique des cellules gliales

associées aux neurones à GnRH-I impliquaient une variation de la proportion de cellule gliale

associée à ces neurones en fonction de la région et du stade de développement. Nous avons

donc quantifié le microenvironnement glial pour chaque neurone à GnRH-I et l'avons

comparé en fonction des régions et du stade de développement (Tableau 1). Nous avons mis

en évidence qu’en moyenne 65,5±2 % des cellules (non GnRH-I) associées aux neurones à

Page 81: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

81

GnRH-I sont des cellules gliales BLBP-ir et/ou GFP-ir. On observe également que ce

pourcentage de cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I reste constant (entre 60% et

70%) aux différents stades de développement et dans les deux régions étudiées (Tableau 1).

Nous avons également mis en évidence qu’en moyenne 91,9±1,7% des neurones à GnRH-I

sont associés à au moins une cellule gliale BLBP-ir et/ou GFAP-GFP-ir quelle que soit la

région (NS et NFJ-OB) et le stade (de E12.5 à E15.5). Cette association reste constante (±

90%) entre les stades et les régions (Tableau 1). Parmi les 8% de neurones à GnRH-I non

associés à au moins une cellule gliale, 5,8% sont associés à des neurones à GnRH-I dont

3%±0,76 sont associés à au moins une cellule gliale.

Ces résultats montrent l’importance du microenvironnement glial associé aux neurones

à GnRH-I. Cet environnement concerne non seulement plus de 90% des neurones à GnRH-I-

ir, mais il compose également le microenvironnement principal (>60%) de ces neurones, aux

trois stades de développement et dans les deux régions étudiées.

Caractérisation de l’évolution spatio-temporelle du phénotype de l’environnement glial

des neurones à GnRH-I

Nous avons vérifié si la répartition des différents phénotypes est spécifique aux cellules

qui sont associées aux neurones à GnRH-I ou si elle reflète l’environnement glial qui colonise

ces régions à ces stades de développement. Nous avons donc quantifié le nombre de cellules

GFP-ir , BLBP-ir et BLBP-GFP-ir dans les deux régions d’intérêts (NS et NFJ-OB) à ces trois

stades sur une surface de 155µm2 centrée sur les neurones à GnRH-I (Figure 5J).

A E13,5, nous observons une augmentation statistiquement significative de la proportion de

cellules BLBP simplement marquées entre le NS et NFJ-OB (69,1±8% versus 92,9±3,6%,

(Figure 5J), contrairement à la tendance observée pour les cellules gliales associées aux

neurones à GnRH.

La même observation est faite à E15,5 (43,7±6% versus 84,04±8,2%, (Figure 5J). Dans le

NS, la proportion de cellules BLBP-ir diminue significativement entre E12,5, E13,5

(69,1±8%) et E15,5 (43,7±6%) (Figure 5J). Cette diminution est corrélée avec

l’augmentation significative de cellules BLBP-ir et GFAP-GFP-ir entre E13,5 (20,2±6,7%) et

E15,5 (46,8±6,3%) (Figure 5J). Une faible proportion de cellules doublement positives est

détectée dans le NFJ-OB à chaque stade : 2,7±1,5% à E13,5 et 13±8,3% à E15,5 (Figure 5J).

Page 82: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

82

Stades de développement embryonnaire

E12,5 E13,5 E15,5

Régions NS NFJ-OB NS NFJ-OB NS NFJ-OB % de cellules gliales

associées par neurone à

GnRH-I

65,8±4,6 62,5±5,4 61,8±6,7 73,8±8,7 61,3±1,6 66,8±1,8

% de neurones à GnRH-I

associés à au moins une

cellule gliale

90,3±5,7 86±0,74 91±6,03 93±4,5 96,3±2,2 93±1,6

Tableau 1 : Tableau représentant l’importance quantitative du microenvironnement gliale des

neurones à GnRH-I en migration dans le septum nasal (NS) et au niveau de la jonction naso-

cérébrale (NFJ-OB) de E12,5 et E15,5. Représentation en Moyenne ± ESM

Page 83: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

83

Cette proportion de cellules doublement marquée est significativement moins importante au

niveau de NFJ-OB que dans la NS à E13,5 et E15,5 (Figure 5J).

Discussion

Afin d’étudier l’implication des cellules gliales olfactives engainantes dans

l’ontogenèse des neurones à GnRH-I, il est important de pouvoir les caractériser au cours du

temps. Or l’évolution spatiale et temporelle des formes précoces et matures de ces cellules

gliales n’ont pas encore été caractérisées. Dans cette étude nous mettons en évidence un

changement net du phénotype des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I entre

E11,5 et E15,5 dans le septum nasal avec une diminution significative de la détection de la

BLBP et une augmentation significative de la détection de la GFAP-GFP. Les cellules BLBP-

ir représentent la population gliale majoritairement détectée aux trois stades de

développement au niveau de la jonction naso-cérébrale et du bulbe olfactif.

Les neurones à GnRH-I sont associés à des cellules gliales immatures de la sortie de

l’organe voméronasal à l’entré du diencéphale

Dans cette étude, nous décrivons pour la première fois la répartition de progéniteurs de

cellules olfactives engainantes (pOEC) BLBP-immunoréactives dans le système olfactif

accessoire au cours du développement embryonnaire de souris âgées de E11,5 à E15,5. Nous

nous sommes tout particulièrement intéressés au trajet migratoire des neurones à GnRH-I,

c'est-à-dire : i) des nerfs voméronasaux qui proviennent de l’organe voméronasal et qui

passent ventro-dorsalement et médialement au bulbe olfactif principal (Farbman et Squinto et

al 1985) ii) et du nerf terminal qui se projette de la sortie de l’épithélium du VNO jusqu’au

diencéphale, en passant au niveau de la surface ventro-mediale du bulbe olfactif et en

traversant la région olfactive rostrale et le septum ((Wirsig-Wiechmann and Oka 2002)-

Wiechmann 2002). Le profil d’expression de la BLBP a été décrit au cours du développement

dans le système olfactif principal (Anthony et al., 2004; Murdoch and Roskams 2007, (Miller

et al. 2010) (Carson et al., 2006; Murdoch & Roskams 2008) ; partie latéral du système

olfactif et qui comprend l’épithélium olfactif, les axones olfactifs et la couche des nerfs

olfactifs (ONL) .

Dans l’épithélium du VNO, nous ne détectons pas de pOEC BLBP-ir de E11,5 à E15,5. Cette

observation est en accord avec les données de Murdoch et Roskams (2007, 2008) qui ne

mettent pas en évidence de progéniteurs des cellules gliales engainantes exprimant la BLBP

Page 84: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

84

dans l’épithélium olfactif et dans l’épithélium de VNO chez la souris à E10,5 et E13,5. En

effet seules des cellules multipotentes de type glie radiaire (RGPL), positives à la nestine, sont

retrouvées dans ce tissu au cours du développement embryonnaire (Murdoch and Roskams

2007; Murdoch and Roskams 2008).

Dans le septum nasal (SN) et au niveau de la jonction naso-cérébrale (NFJ), nous observons la

présence de pOEC BLBP-ir le long des axones dès E11,5, dans les nerf voméronasaux et/ou le

nerf terminal. Ces pOEC engainent les neurones à GnRH-I dans le SN dès E11,5 et dans le

NFJ dès E12,5. La présence de pOEC BLBP-ir, est décrite dans le système olfactif principal,

aux stades précoces de développement, le long des axones olfactifs (Murdoch et Roskams

2007, Murdoch et Roskams 2008, Miller 2010)(Carson et al. 2006) (Ritcher et Roskams

2007) et au niveau de l’ONL (Blanchart et al 2011). Nous observons donc au cours du

développement embryonnaire une similarité de la répartition des pOEC entre les systèmes

olfactifs accessoire et principal.

Dans la vésicule télencéphalique (bulbe olfactif présomptif) nous détectons également des

pOEC BLBP-ir engainants les neurones à GnRH-I le long des axones. De nombreuses études

de microscopie électronique et d’immunohistochimie suggèrent que les OEC pénètrent dans la

vésicule télencéphalique au cours du développement embryonnaire et chez l’adulte (Gong et

al, 1994, Ubink et Hokfelt, 2000)(Marin-Padilla 1989; Valverde et al. 1992)(Lopez-

Mascaraqua 1991). Récemment une étude de traçage, par injection de rétrovirus GFP dans la

fosse olfactive, a mis en évidence la présence de cellules BLBP-ir et GFAP au niveau de la

couche externe du BO (Blanchart et al. 2011). Parmi les études citées ci-dessus, certaines

suggèrent que ces cellules occupent la capsule des glomérules olfactifs (Marin-Padilla et

1989, Valverde et Lopez-Mascaraqua 1991, Valverde et al, 1992). Dans notre étude, nous

détectons des cellules BLBP-ir le long des axones, sans doute du nerf terminal, qui traversent

le BO jusqu’au début du diencéphale. Une étude menée par Zheng et Jourdan, (1988a) a mis

en évidence par microscopie électronique un environnement glial engainant le nerf terminal

au niveau de la surface bulbaire, qui s’étend ventro-caudalement jusqu’au ganglion terminal

principal chez le rat adulte (Zheng and Jourdan 1988). Cette donnée en accord avec nos

observations nous conforte dans l’idée que les neurones à GnRH-I sont associés à des pOEC

dans le télencéphale. Elle nous laisse également supposer que ces neurones présentent ce

microenvironnement glial au cours de leur migration dans le diencéphale, du fait que le nerf

Page 85: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

85

terminal se projet jusque dans le septum et que nous observons dans le cerveau quelques

cellules BLBP-ir morphologiquement apparentées aux pOEC le long d’axones immunoréactif

à la périphérine.

Les OEC du système olfactif accessoire maturent rostralement pendant la période de

migration des neurones à GnRH-I

Dans cette étude nous avons distingué les cellules gliales qui sont associées aux

neurones à GnRH-I et qui pourraient du fait de leur proximité atteindre et réguler la migration

des neurones à GnRH-I de l’ensemble des cellules gliales qui colonisent le système olfactif

accessoire (AOS). Cependant notre étude ne met pas en évidence de différence dans

l’évolution du phénotype entre ces cellules gliales engainantes. Pour l’ensemble des OEC qui

colonisent le système olfactif accessoire, nous détectons une immunoréactivité à la BLBP un

jour avant l’immunoréactivité à la GFAP-GFP. Dans le système nerveux central la BLBP est

également exprimée avant la GFAP-GFP (GFP sous le contrôle du promoteur humain de la

Gfap) dans la glie radiaire (Anthony et al. 2004). Une étude de Malatesta met en évidence que

la co-expression des deux marqueurs, BLBP-GFP et GFAP-GFP, est corrélée avec leur

différenciation (Malatesta 2008). Dans le système olfactif périphérique la BLBP est décrit

comme un marqueur de progéniteurs des OEC (Murdoch & Roskams, 2007) et la GFAP un

marqueur des OEC matures (Astic et al. 1998).

Dans le septum nasal médian, la quantification des cellules gliales associées aux neurones à

GnRH-I nous a permis de mettre en évidence une augmentation de la proportion de cellules

gliales GFAP-GFP-ir et une diminution de la proportion de cellules BLBP-ir, entre E12,5 et

E15,5. Dans une précédente étude, nous avions observé une augmentation de cellules GFAP-

GFP-ir au cours du développement in vivo entre E12,5 et E15,5 et in vitro sur des cultures

d’explants de placodes olfactives entre 3 jours et 10 jours de cultures (Geller et al. 2013). Nos

résultats suggèrent donc que les cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I maturent au

cours du développement dans le septum nasal médian. Le changement de phénotype des OEC

au cours du développement et de leur maturation a été décrite dans la littérature (pour revue

Ramon-Cueto et Avila 1997). Dans le système olfactif principal, la détection de marquage

S100β (marqueur des OEC en cours de maturation) a été mise en évidence plus précocement

que le marquage GFAP dans le septum nasal de rat (Astic 1998). Cette étude décrit également

Page 86: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

86

une augmentation du marquage de la GFAP le long des axones voméronasaux et olfactifs au

cours du développement embryonnaire (Astic 1998).

Au niveau de la partie médiane de la jonction naso-cérébrale (NFJ) et au niveau ventro-

médian du bulbe olfactif nous observons un faible pourcentage de cellules exprimant la GFAP

par apport aux cellules qui colonisent le septum nasal médian. Au niveau du système olfactif

principal, de nombreuses études mettent en évidence un faible marquage de la GFAP, voire

un marquage inexistant, dans la couche de nerfs olfactifs (ONL) par apport aux cellules qui

colonisent le septum nasal (Astic 1998, Valverbe 1992, Carson 2006, Wang 2002, Blanchart

2011, Barnett 1993, Franceschnini et al 1996, Reinhard et al 1998).

Dans la NFJ-OB nous observons cependant une légère augmentation, non significative, de

l’expression de la GFAP corrélée avec une légère diminution de cellules BLBP-ir entre E13,5

et E15,5. Il est donc difficile de conclure quant à une possible maturation tardive des OEC

colonisant cette région. Dans l’ONL, une légère augmentation de marquage GFAP a

également été décrite au cours développement embryonnaire tardif et post-natal chez (Carson

2006, Wang 2002, Astic 1998). L’étude de Astic et al. (1998) qui montre une augmentation de

marquage de la GFAP entre E16-E18 dans le septum nasal et entre P1-P5 au niveau de l’ONL

conclut à un gradient de maturation rostro-caudale des OEC du système olfactif principal.

Selon notre étude nous pouvons conclure que l’on observe une maturation rostrale des OEC à

partir de E13,5 et que la majorité des neurones à GnRH-I en migration dans le NFJ-OB sont

associés à des pOEC BLBP-ir jusqu'à leur entrée dans le diencéphale. Nous pouvons

expliquer la différence de réparation des phénotypes des OEC entre le SN et NFJ soit par :

i) une migration des OEC du SN vers le NFJ-OB qui est plus lente pour les OEC

exprimant la GFAP que pour les pOEC, sachant que chez la souris les premiers pOEC

qui composent la masse migratoire quittent l’EO vers E10,5 et arrivent à la base de la

vésicule télencéphalique un jour plus tard (Marin Pedilla et Amieva 1989, Valverbe

1992)

ii) un délai de maturation différent entre deux sous-populations d’OEC, une qui occupe

le NS et l’autre le NJF. En effet on peut supposer que les cellules en cours de

maturation, GFAP-GFP-ir et BLBP-ir, arrêtent de migrer et colonisent le septum

nasal ; en effet, selon Astic et al. (1998) la GFAP augmenterait la rigidité du

Page 87: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

87

cytosquelette. Ainsi seuls les progéniteurs des OEC migreraient et accompagneraient

les neurones à GnRH-I jusqu’au télencéphale, la BLBP étant décrite comme un

modulateur de la migration neuronale (Liv 2010).

L’environnement cellulaire des neurones à GnRH-I en migration

Dans cette étude nous mettons en évidence que l’environnement glial concerne une

grande majorité des neurones à GnRH-I et que celui est également quantitativement

majoritaire.

En effet, plus de 90% des neurones sont associés à des cellules gliales (BLBP-ir et/ou

hGFAP-GFP-ir) aux trois stades étudiés et au niveau des deux régions d’intérêts. Parmi les

8% restant, 6% sont des neurones à GnRH-I associés à d’autres neurones à GnRH-I, ce que

l’on explique par le fait que ces neurones migrent en grappes (Wray et al 1989, Schwanzel-

Fukuda 1989).

Nous mettons également en évidence que plus de 60% des cellules associées aux neurones à

GnRH-I sont des cellules gliales (BLBP-ir et/ou hGFAP-GFP-ir). Nous pouvons supposer que

les 40% de cellules associées à ces neurones pourraient être des cellules qui composent la

masse migratoire. En effet les OEC et les neurones à GnRH-I ne sont pas les seules cellules

qui proviennent de la fosse nasale et qui migrent vers le télencéphale au cours du

développement embryonnaire (Valverde et al 1992). Plusieurs types de cellules composent

cette masse et pourraient être associées aux neurones à GnRH-I en migration.

Les cellules OMP-ir (Olfactory Maker Protein), qui sont décrites pour migrer principalement

le long de la partie latérale du système olfactif et ventro-rostralement au télencéphale (De

Carlos et al 1995, De Carlos 1996, Pellier et Astic 1994, Farbman et al 1993, Valverbe et al

1993, Terrazo et al 1995), ont également été mises en évidence en association étroite avec des

neurones à GnRH-I en migration, dans le cerveau d’opossum (Terrazo et al 1995).

Les cellules immunoréactives à l’acetylcholinesterase (AChE), qui migrent à travers le

septum nasal antérieurement par rapport aux neurones à GnRH-I (DeCarlos et al 1995), sont

également connus pour composer le nerf terminal (Caldani 1987, Wirsig et Gatchell 1986,

Schwanzele-Fukuda et Silverman 1980, Schwanzele-Fukuda 1987, Zheng 1988b). Elles

pourraient de ce fait, faire partie du microenvironnement cellulaire des neurones à GnRH-I en

migration.

Il est également mis en évidence une migration de cellules catécholaminergiques (CA)

immunoréactives à la tyrosine hydroxylase (TH), le long du septum nasal chez le mouton

Page 88: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

88

(Izvolskaia et al 2006) le rat (Izvolskaia et al 2009) et l’humain (Verney 1996). Il a été mis en

évidence, une proximité étroite des cellules TH-ir et des neurones à GnRH-I dans le cerveau

d’embryon humain (Verney 1996) et une apposition étroite entre les neurones à GnRH-I et les

fibres CA à l’entrée du cerveau chez le rat (Izvolskaia et al 2009). Cette dernière étude met

également en évidence chez les fœtus de rats déficient en CA, une augmentation du nombre

de cellules GnRH-ir dans le septum nasal suggérant un rôle des CA dans la migration des

neurones à GnRH-I (Izvolskaia et al 2009).

Enfin le nerf terminal serait également composé de neurones « like » NPY (pour revue

Wirsig-Wiechmann 2002) qui seraient en relation étroite avec les neurones à GnRH-I chez la

chauve souris (Oelschlager H.A.1998). Le fait que le NPY soit également exprimé par les

OEC (Ublink et Hokfely 2000) ne nous permet pas d’exclure que certaines de ces cellule sont

des cellules NPY+ gliales engainantes.

En conclusion, cette étude met en évidence que les neurones à GnRH-I sont associés

aux progéniteurs des cellules olfactives engainantes de la sortie du voméronasal à la jonction

entre le bulbe olfactif et le diencéphale. La maturation des cellules gliales est mise en

évidence dans la partie proximale du système olfactif accessoire pendant la période de

migration des neurones à GnRH-I entre 12,5 et 13,5 jours de développement embryonnaire.

Les cellules gliales qui accompagnent les neurones à GnRH-I dans le cerveau sont quand à

elles immatures. De plus less cellules gliales immaturent forment le microenvironnement

majoritaire de ces neurones en migration.

Page 89: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

89

Remerciement

Les auteurs tiennent à remercier Marine Cirot, Déborah Crespin et Claude Cahier de l'unité

expérimentale de l'INRA, Centre de Tours (UE-PAO), pour prendre soin des animaux. Ce

travail a été soutenu par des subventions du «Agence Nationale pour la Recherche" (ANR-

NÉCESSITÉ: effets neuroendocrines des perturbateurs endocriniens) et de la "Région Centre"

(programme ToxEmergenCe). Sarah Geller a reçu une subvention doctorat de l'"Ministère de

l'Enseignement Supérieur et de la Recherche". Les auteurs n'ont pas de conflit d'intérêt à

declarer

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Page 91: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

91

IV. Conclusion du chapitre I

Les résultats présentés dans ce chapitre permettent d’affirmer que les neurones à GnRH-I

en migration présentent un environnement glial. Ces cellules gliales et/ou progéniteurs gliaux

sont présents dès le début de la migration neuronale aussi bien in vitro (dès 3jours de cultures)

que in vivo (dès 11,5 jours de développement embryonnaire). Elles sont présentent tout le

long de la route migratoire des neurones à GnRH-I, du VNO à l’entrée du diencéphale, et sont

étroitement associées à ces neurones. Elles représentent le microenvironnement cellulaire

majoritaire des neurones à GnRH-I en migration et expriment des marqueurs connus pour être

impliqués dans la migration de ces neurones. Toutes ces données suggèrent un rôle de ces

cellules gliales dans la migration de ces neurones.

La caractérisation phénotypique de ces cellules gliales nous a permis de les identifier en tant

que cellules gliales olfactives engainantes (OEC). Ces cellules gliales présentent une grande

variabilité phénotypique In vivo, cette variabilité se traduit par une évolution du phénotype

distincte entre les cellules colonisant le septum nasal, et celles qui colonisent la jonction entre

ce septum et le cerveau. Une maturation rostrale des cellules gliales associées aux neurones à

GnRH-I au cours du développement embryonnaire est mise en évidence. Cette variabilité du

phénotype expliquerait le fait que nous n’arrivons pas à déterminer si ces cellules gliales

migrent jusque dans l’hypothalamus. Cependant in vitro nous mettons en évidence que ces

cellules gliales parcourent une distance de migration plus importante que les neurones à

GnRH-I. De plus, nous observons dans ce même modèle, la formation d’un réseau neuro-glial

après une semaine de culture, soit à la période de maturation du profil de sécrétion.

Page 92: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

92

Chapitre 2 : Le transcriptome des cellules gliales olfactives associées aux

neurones à GnRH-I est-il modulé par les Perturbateurs

Endocriniens ?

I. Contexte scientifique

Le développement et la régulation du réseau neuroendocrine à GnRH-I est dépendant des

hormones stéroïdiennes (Clarke 2011; Herbison 1998; Parhar et al. 2012) et constitue donc

une cible privilégiée pour des perturbateurs endocriniens (PE) à activité oestrogénique ou

anti-oestrogénique (pour revue Gore 2010, Dickerson et Gore 2007). Ces dernières années,

des études ont mis en évidence l’effet d’un PE à activité oestrogéno-mimétique, le 17-α-

éthinyloestradiol (EE2) sur le développement des neurones à GnRH-I chez la souris (Pillon et

al. 2012; Vosges et al. 2012). Cet analogue synthétique du 17-oestradiol est utilisé dans les

pilules contraceptives et les traitements hormonaux substitutifs. Ainsi, ce perturbateur

endocrinien se fixerait avec une affinité élevée sur les récepteurs nucléaires aux œstrogènes

ERα et ERβ (Shyu et al. 2011; Vosges et al. 2012) mais les études mentionnées ci-dessus ne

permettent pas d’affirmer que le mode d’action est direct sur les neurones à GnRH-I. En effet,

les études menées à partir de souris ERα KO et ERβ KO ont permis de mettre en évidence que

les régulations physiologiques de l’oestradiol sur l’activité des neurones à GnRH-I lors des

rétro-contrôles négatifs et positifs, impliquent principalement le récepteur ERα, puisque seule

une déficience de ERα conduit à une dérégulation importante du phénotype endocrinien

(Beauvillain 2008; Clarke 2011). Cependant la majorité des études s’accorde à dire que les

neurones à GnRH-I n’exprimeraient pas le récepteur nucléaire ERα (Herbison and Pape 2001,

Petersen et al 2003) et suggère que l’effet des œstrogènes sur les neurones à GnRH-I serait

transmis indirectement par des cellules gliales ou endothéliales (Rage et al 1997, Smith and

Jennes 2001, Prevot 2002, Petersen et al 2003). Dans ce troisième chapitre nous mettons en

évidence l’expression des gènes codant pour les récepteurs nucléaires aux œstrogènes, ERα,

ERβ dans les cellules gliales olfactives GFAP-GFP associées aux neurones à GnRH-I. Ces

résultats nous ont conduits à émettre l’hypothèse que l’action de l’EE2 sur l’ontogenèse

et/ou l’activité des neurones à GnRH-I passerait par les cellules gliales en se fixant sur

les récepteurs nucléaires aux œstrogènes. Le mécanisme classique de l’activation des

récepteurs nucléaires après liaison de l’hormone implique la translocation nucléaire et la

fixation sur une séquence d’ADN spécifique (Elément de réponse aux hormones) en amont de

Page 93: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

93

promoteurs de gènes cibles. Cette fixation régule l’expression de ces gènes. Ainsi l'ojectif de

ce chapitre est d’étudier l’effet d’une dose environnementale d’EE2 sur l’expression des

gènes codant des cellules gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I, à partir de

culture d’explants de placodes olfactives. Afin de pouvoir détecter et isoler les cellules

gliales associées aux neurones à GnRH-I, nous avons réalisé des cultures de placodes

olfactives de souris transgéniques GFAP-GFP (présentation de la lignée dans l’introduction

du Chapitre 1).

Page 94: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

94

Figure 13 : Schéma général des études menées dans le chapitre 3

Page 95: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

95

II. Matériel et Méthode

Les dissections des placodes olfactives à partir de souris transgéniques FVB/N-Tg(GFAP-

GFP), le génotypage des embryons, le maintien en cultures de ces placodes, le tri par FACS

des cellules [GFP+] et l’extraction de l’ARN, sont décrits dans le chapitre I.

II.1. Cultures de placodes olfactives GFAP-GFP et traitements au 17-α-

éthinyloestradiol

Les explants de placodes olfactives ont été cultivés dans le milieu de culture classique

(SFM, cf chapitre 1) en absence d’inhibiteur de la prolifération cellulaire (5' fluoro 2-

deoxyuridine) et dans un milieu appauvri en agents oestrogéniques (F12 sans en rouge

phénol). Les placodes olfactives transgéniques [GFP+] ont été identifiées par génotypage (cf

chapitre 1), et confirmées par épifluorescence après 6 jours de cultures. Plusieurs séries de

dissections d’explants de placodes olfactives ont été réalisées pour chaque type de traitement

(Tableau 1). Le nombre d’explants de placodes olfactives utilisé par expérience et par

traitement est répertorié dans le Tableau 1.

Deux protocoles expérimentaux ont été réalisés :

Pour le premier protocole expérimental, les placodes olfactives [GFP+] des quatre

séries de dissections ont été traitées avec 17nM d’EE2 pendant 48h (Sigma Aldric), entre le 8

ème et 10 ème jour de culture (Figure 1). L’EE2 a été dissout dans de l’éthanol à une

concentration de 1mg/ml, puis dilué dans le milieu de culture SFM à une concentration finale

de 5ng/ml (concentration finale d’éthanol de 0,0005%). Pour chaque série de dissection la

moitié des cultures [GFP+] étaient cultivées en condition contrôle (T, Figure 1), c'est-à-dire

dans du SFM avec une concentration finale d’éthanol à 0,0005%.

Pour le second protocole expérimental les placodes olfactives ont été traitées pendant

10 jours, dès leurs mises en cultures :

- soit avec 17nM d’EE2,

- soit avec 100nM de 17-β-œstradiol (E2),

- soit en condition témoin (T) (Figure 1).

Page 96: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

96

Tableau 3 Quantité et qualité du matériel biologique utilisé pour étudié l’effet du 17-α

éthinyloestradiol sur le transcriptome des cellules gliales olfactives [GFP+]. Les cultures

d’explants de placodes olfactives ont été traitées avec 17nM de 17-α éthinyloestradiol pendant

48h, EE2(48h) et pendant 10 jours EE2(10j), mais aussi avec 100nM d’œstradiol pendant 10

jours E2(10jours). T(48h) et T(10j) désignent les conditions témoins. (R.I.N) : RNA

Integrity Number. Les chiffres (1-4) en indice désignent les numéros de série de dissections

Tableau 4 : Séquences des amorces de RT-PCR des gènes codant pour les récepteurs aux

œstrogènes

Traitement Nb de Femelles

gestantes Nb de PO [GFP+]

nb de cellules

[GFP+]

ARN

(pg/µl) R.I.N

EE2(48h)1 4

8 59 000 1,00.10+3

8.3

T(48h)1 7 30 800 1,55.10+3

8.7

EE2(48h)2 4

7 47 020 1,00.10+3

8.7

T(48h)2 7 47 000 8,17.10+2

8.1

EE2(48h)3 3

7 38 140 1,66.10+3

8.7

T(48h)3 6 32 200 9,29.10+2

9.1

EE2(48h)4 3

8 25 940 4,09.10+3

8.9

T(48h)4 6 28 670 1,82.10+3

9.1

EE2(10j)1 4 26 252 350 1,24.10+4

9,6

EE2(10j)2 5 23 184 000 1,70.10+4

9,5

T(10j)1 4 26 80 290 2,71.10+4

9,9

T(10j)2 4 30 58 510 2,50.10+4

9,2

E2(10j)1 4 20 203 300 5,76.10+3

8,9

E2(10j)2 2 6 52 480 1,85.10+4

8,3

Protéine Gène cible

(num d’accession)

sens Séquence (5’-3’) Tm

(°C)

Taille du

produit

ERα Esr1

(NM_007956.4)

S AATGAAATGGGTGCTTCAGG 54 302pb

AS AGGTGGACCTGATCATGGAG

ERβ

Esr2

(NM_010157.3)

(NM_207707.1)

S AGAGTAGCCGGAAGCTGA

56 218pb AS CTCCAGCAGCAGGTCGTA

GPR30 Gpr30

(NM_029771.3)

S AAGCCAGGGTGTCATTTCTG 54 827pb

AS CGCTAGGTACCTGTCGAAGC

Page 97: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

97

L’E2 a été dissout à 13,6mg/ml dans de l’éthanol puis dilué dans le milieu de culture SFM à

une concentration finale de 27,2ng/ml (concentration finale d’éthanol de 0,0002%).

Pour les deux protocoles expérimentaux, les placodes olfactives [GFP+] ont été regroupées

après 10 jours de culture, et les cellules [GFP+] ont été triées et isolées par FACS (cf Article

1, Figure 1).

II.2. Analyse par RT-PCR de l’expression des gènes codants pour les

récepteurs aux œstrogènes en condition contrôle

Les RT-PCR ont été réalisées à partir d’ARN extrait de cellules [GFP+] isolées par FACS

à partir de cultures de placodes olfactives GFAP-GFP âgées de 10 jours (cf Article 1). Trois

gènes d’intérêts ont été ciblés :

- le gène Esr1 (Estrogen receptor 1) qui code pour ERα,

- le gène Esr2 (Estrogen receptor 2) qui code pour ERβ

- le gène Gpr30 qui code pour le récepteur membranaire aux œstrogènes.

Les séquences des amorces et les conditions de RT-PCR utilisées sont répertoriées dans le

tableau 2. La Gapdh a été ciblée comme gène de référence (les séquences et conditions de

RT-PCR sont répertoriées dans article 1).

II.3. Procédure de puces à ADN

II. 3. a. Extraction et analyse de l’ARN

L’extraction de l’ARN total a été faite au Tryzol® (cf article 1). La concentration

d’ARN (en pg/µL) a été déterminée par spectrophotométrie Nanodrop® ND-1000

spectrophotomètre (Nyxor Biotech, Paris, France). La qualité et l’intégrité de l’ARN (R.I.N :

RNA Integrity Number) ont été analysées par Bioanalyseur 2100 à l’aide de RNA 6000 Pico

Kit (Agilent Technologies). Les valeurs sont listées dans le tableau 1.

Pour réaliser les puces à ADN une quantité minimale de 50ng est nécessaire et une bonne

qualité de l’ARN est essentielle. Le RIN, "RNA Integrity Number", permet d’estimer

l’intégrité de l’ARN total des échantillons. Le principe de cette technique de « laboratoire sur

puce » est de faire migrer sur gel des molécules d’ARN liées à un marqueur fluorescent.

Page 98: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

98

Figure 14 : Segments d'un électrophérogramme (Scroeder 2006)

Page 99: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

99

L’appareil mesure en temps réel l’intensité de la fluorescence émise en fonction du temps de

rétention de l’échantillon. Ces données sont validées par rapport à un marqueur de poids

moléculaire (Marker, Figure 2) et permet d’estimer la pureté de l’échantillon et une

éventuelle dégradation des acides nucléiques en mesurant :

- Le rapport de la superficie du pic du 18S et 28S sur l’aire totale de la courbe qui reflète la

proportion de grosses molécules (18S et 28S) par rapport aux plus petites (détectées entre le

pic du 5S et le pic du 18S, Figure 2).

- La hauteur du pic 28S par apport à celui du 18s. Le pic du 28S disparaît plus vite que le pic

du 18S lorsque l’ARN est en cours de dégradation.

Les valeurs du RIN sont comprises entre 10 (pour l’ARN intact) et 1 (pour l’ARN très

dégradé). Les analyses de puces à ADN sont réalisées à partir d’ARN présentant un RIN ≥

6,5.

II.1. Conception des puces à ADN

La conception et l’analyse des puces à ADN ont été réalisées par la Plateforme Puces à

ADN U915-IFR26 à Nantes.

II. 1. a. Le principe de la technique de puces à ADN

Le principe de cette technique est de marquer des ADNc provenant de conditions

différentes avec deux fluorochromes différents : un rouge pour la première condition (par

exemple les cultures témoins) et un vert pour la deuxième condition (par exemple les cultures

traitées à l’EE2). Les ADNC provenant des deux échantillons sont placés sur une matrice

d’ADN simple brin (la sonde). Les ADNc fluorescents vont ainsi s’hybrider sur les sondes.

Après excitation par un laser, la fluorescence émise par les ADNc hybridés est récupérée via

un photomultiplicateur couplé à un microscope confocal. On obtient alors deux images dont le

niveau de gris représente l'intensité de la fluorescence lue. Si on remplace les niveaux de gris

par des fausses couleurs (rouge pour la première condition et vert pour la seconde) on obtient

en superposant les images des spots allant du rouge (ADNc de la première condition fixée) au

vert (ADNc de la seconde condition fixée) en passant par le jaune (ADNc des deux conditions

fixées en quantité égale). Pour déterminer le niveau d’expression différentiel des gènes entre

nos conditions, nous supposons que la quantité d'ADNc fluorescent fixée est proportionnelle à

la quantité d'ARNm du départ. Si le ratio de la fluorescence rouge / la fluorescence verte est

Page 100: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

100

supérieur à 1 (rouge sur l'image), le gène est sur-exprimé dans la condition contrôle ; si ce

ratio est inférieur à 1 (vert sur l'image), le gène est sur-exprimé dans la seconde condition.

II. 1. b. La conception des puces à ADN

L’ARN a été amplifié et l’ADN complémentaire (ADNc) de chaque échantillon a été

préparé selon le protocole du fabricant (Pseudo-MonoCouleur) et hybridé sur le génome de

souris entier 4x44K Microarray (Agilent Technologies). Deux échantillons ont été hybridés

sur chaque puce 4x44K, un échantillon marqué avec la cyanine 3 et un échantillon marqué

avec la cyanine 5. Afin de valider les puces à ADN, des échantillons ont été étiquetés

alternativement par cyanine 3 ou 5. Après hybridation, les puces à ADN ont été lavées et

numérisées à l'aide d'Agilent Scanner. Les résultats ont été extraits en utilisant la fonction

9.5.1 logiciel d'extraction (Agilent Technologies).

II.2. Analyse des puces à ADN

II. 2. a. Principes des analyses des résultats de puces à ADN

1. L’analyse globale de « Clustering » hiérarchique

Le « clustering hiérarchique » permet de visualiser l’ensemble des données représentées

en « matrice de sondes différentiellement exprimées» (Figure 6B). Cette matrice est

représentée par les sondes en ligne et les échantillons en colonne (Figure 6B). Elle permet de

visualiser les gènes induits (en rouge) et les gènes réprimés (en vert) pour chaque échantillon

(Figure 6B). Les échantillons sont classés selon leur profil d’expression sur l’ensemble de la

puce. Ce classement, représenté sous forme d’arbre ou dendogramme (Figure 6A) permet de

vérifier le regroupement des conditions expérimentales entre-elles et d’identifier des

conditions ayant un profil similaire. L’analyse par « clustering » est une méthode de

classification non supervisée et automatique. Il s'agit pour un logiciel de diviser un groupe

hétérogène de données, en sous-groupes de manière à ce que les données considérées comme

les plus similaires soient associées au sein d'un groupe homogène (ou clusters) et qu'au

contraire les données considérées comme différentes se retrouvent dans d'autres groupes

distincts. L'objectif est de permettre une extraction de connaissance organisée à partir de ces

données.

2. Extraction et annotations des « clusters »

Pour chaque sonde un test statistique (test de student) est effectué par question binaire

posée : La sonde est-elle différentiellement exprimée dans notre condition témoin par rapport

Page 101: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

101

à notre condition traitement à l’EE2 ? Une p-value est attribuée à chaque sonde et sera

ordonnée selon le « clustering » et rapportée sur un graphique selon la formule -log10 (p-

value) (points violets, Figure 6C). Une moyenne mobile est calculée (en orange, Figure 6C)

afin de lisser la courbe. Ce type de représentation graphique nous permet d’observer des pics

ou « des signatures de gènes » (encadrés, Figure 6C) qui distinguent les groupes de gènes ou

cluster répondant à la question du test. Ainsi, un cluster correspond à un groupe de gènes dont

l’expression varie dans le même sens et pouvant être associé à une ou plusieurs fonctions

différentes.

Des annotations de voies de signalisations biochimiques (ou pathway) et des annotations

fonctionnelles peuvent être associées aux clusters, en utilisant la base de données KEGG

(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) et GO (GeneOntonlogy). « KEGG pathway »

permet d’identifier les voix biochimiques qui pourraient être perturbées dans le contexte

biologique étudié, en analysant les réseaux d’interactions moléculaires à partir de données

bibliographiques. « GeneOntology » est le regroupement de plusieurs banques de données

génomiques visant à construire une ontologie générique, c'est-à-dire un vocabulaire contrôlé

et structuré applicable à toute espèce. Le GO décrit : les fonctions moléculaires (tâches

réalisées par les produits de gènes), les processus biologiques (processus dans lesquels les

gènes sont impliqués) et les composants cellulaires (où ces gènes agissent).

La pertinence des regroupements des gènes par voie de signalisation biochimique et par

fonction (annotation KEGG et annotation GO) dans un cluster est évaluée grâce à plusieurs

critères : la significativité (p-value) et l’enrichissement.

- La significativité ou p-value est calculée pour chaque annotation, par un test de

Fisher, en fonction du nombre de gènes du cluster associé à cette annotation et du

nombre de gènes de la matrice associé à cette annotation. Ainsi la p-value permet de

déterminer des listes d’annotations significativement enrichies.

- L’enrichissement de chaque annotation est calculé par un rapport de fréquences du

nombre total de gènes du cluster n’ayant pas d’association avec cette annotation et du

nombre total de gènes de la matrice n’ayant pas d’association avec cette annotation.

Ainsi l’enrichissement permet de mettre en évidence les annotations qui sont sur-

représentées dans la liste de gènes.

Les annotations les plus spécifiques du cluster sont celles qui auront la p-value la plus petites

(p-value <0,05) et l’enrichissement le plus grande (Enr >1,6).

Page 102: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

102

3. L’analyse différentielle par gène et annotation fonctionnelles des gènes

Le principe est de rechercher des gènes différentiellement exprimés entre deux conditions.

Une comparaison de la moyenne d’expression de chaque sonde est réalisée entre les deux

conditions par un test de student. Une analyse de significativité des puces est réalisé à partir

de la p-value (<0,05) et de l’estimation du taux d’erreur. Une annotation fonctionnelle des

gènes différentiellement exprimés a été réalisée en utilisant la base de données GO.

II. 2. b. Méthodes des analyses des résultats de puces à ADN

Les différentes étapes d’analyses des puces à ADN sont listées dans l’organigramme

en Figure 3. Les données d’expression brutes ont été normalisées selon la méthode de

LOWESS (normalisation non linéaire). Les sondes de faible intensité ont été éliminées après

filtrage des données. Le filtrage utilisé admet qu’environ la moitié des gènes ne sont pas

exprimé dans le système étudié. Les sondes conservées sont celles qui dépassent le seuil dans

au moins 50% des échantillons d’une condition expérimentale. Ainsi 28574 sur 43379 sondes

ont été conservées pour les échantillons traités pendant 10 jours et 23242 sur 43379 sondes

ont été conservées pour les échantillons traités pendant 48h.

Les profils d'expressions géniques ont été utilisés afin de classer les gènes. Les échantillons

biologiques ont été classés par un procédé d'analyse hiérarchique en utilisant un logiciel de

« clustering ». Les résultats de l'analyse de classification hiérarchique ont été visualisés en

utilisant le Programme TreeView. Un test t de Student a été appliqué pour déterminer les

gènes différentiellement exprimés, avec une signification statistique seuil (p-value) de 0,05.

Les annotations des vois biochimiques (Pathway) et les fonctions ont été effectuées à l'aide du

logiciel David (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) et GoMiner (http://discover.nci.nih.gov/). Une

annotation est considérées comme statiquement régulés lorsqu’elle présente un enrichissement

de 1.6 et une p-value de 0.05. L’ontologie et la définition de chaque annotation KEGG et de

chaque annotation GO ont été respectivement obtenues sur

http://www.genome.jp/kegg/pathway.html et sur http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/.

Page 103: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

103

Figure 15 : Etapes d’analyses primaires des puces à ADN

Page 104: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

104

III. Résultats

III.1. Les cellules gliales olfactives [GFP+] expriment les gènes codant pour les

récepteurs aux œstrogènes

Dans un premier temps nous avons vérifié si les cellules gliales olfactives [GFP+], isolées

par FACS à partir de cultures de PO, exprimaient les gènes codant pour les récepteurs aux

œstrogènes. Nous observons que les cellules [GFP+] expriment fortement le gène qui code

pour le récepteur membranaire aux œstrogènes, le GPR30 (ADNc dilué au 1/10, Figure 4).

Ces cellules gliales expriment également les gènes codant ERβ (Esr2) et ERα (Esr1) (ADNc

dilué au 1/1, Figure 16).

Les cellules gliales olfactives GFAP-GFP associées aux neurones à GnRH-I expriment les

trois récepteurs aux œstrogènes dont les récepteurs nucléaires ERα et ERβ. Ainsi les cellules

gliales olfactives peuvent être une cible des dérivés oestrogénomimétiques.

III.2. Effet d’un traitement de 17-α-éthinyloestradiol sur la survie cellulaire des

explants et sur le pourcentage de cellules gliales [GFP+] : Analyse par

FACS

Afin d’évaluer l’effet d’un traitement aigu et chronique de 17nM d’EE2 (48h et 10

jours) sur le transcriptome des cellules gliales associées aux neurones à GnRH-I, nous avons

dans un premier temps isoler les cellules gliales [GFP+) des explants par FACS.

Le FACS nous permet de mesurer et d’évaluer des paramètres cellulaires. En effet la

lumière diffractée mesurée en face du rayon laser (paramètre FS Lin, Figure 17A) permet

d’évaluer la taille des cellules. La lumière diffractée, mesurée à 90° (paramètre SS log,

Figure 17A) donne une mesure de la granulosité de la cellule. Ces paramètres permettent de

distinguer les débris cellulaires, des cellules vivantes (Figure 17A) et ainsi de déterminer le

pourcentage de survie cellulaire ou de viabilité. Parmi les cellules vivantes nos cellules

d’intérêt sont détectées grâce à la fluorescence émise par le GFP endogène après excitation

(Figure 17B), avant d’être isolées. Ainsi on peut évaluer le pourcentage de cellules [GFP+],

parmi les cellules vivantes, selon nos conditions de cultures.

Page 105: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

105

Figure 16 Expression des gènes codant pour les récepteurs aux œstrogènes par les cellules gliales

olfactives GFAP-GFP. RT-PCR qui illustre l’expression d’Esr1 (ERα), d’Esr2 (ERβ) et Gpr30 par

les cellules [GFP+] isolées par FACS, à partir des cultures de placodes olfactives GFAP-GFP (PO).

(n=3, groupement de ~20 PO pour les 3 FACS). L’ADNc a été utilisé à différentes dilutions : (a) 1/1,

(b) 1/10, (c) 1/50.

Figure 17 : Analyses des cultures d’explants de placodes olfactives par FACS. (A-B) Diagrammes

de dispersion (Dot Plot) qui représentent l’isolation de cellules vivantes des débris cellulaires (A) et

l’isolation des cellules [GFP+] des cellules [GFP-] (B). (C-D) Graphiques qui représentent le

pourcentage de survie cellulaire des cultures d’explants de placodes olfactives (PO) (C) et le

pourcentage de cellules [GFP+] isolées à partir de ces cultures (D). Chaque échantillon est représenté

par un point et la moyenne des échantillons est représentée par un trait. Les cultures ont soit été

traitées à l’EE2 pendant 48h EE2(48h) ou pendant 10jours EE2(10j) ; soit traitées à l’œstradiol pendant

10 jours E2(10j). T(48h) et T(10j) représentent les témoins respectifs

Page 106: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

106

Nous avons donc analysé l’effet d’un traitement de 48h d’EE2 sur la survie cellulaire

globale des cultures d’explants de placodes olfactives (Figure 17C) et sur le pourcentage de

cellules [GFP+] (Figure 17D). Nous n’observons pas d’effet significatif du traitement sur la

survie cellulaire des placodes olfactives ; avec une médiane (25% Percentile-75% Percentile)

de 26,89 (19,26-38,12) pour les lots témoins et de 27,68 (22,43-33,44) pour les lots traités

(test de Mann-Whitney). De même, nous n’observons pas d’effet de ce traitement sur le

pourcentage de cellules [GFP+] détectées (4,2 (3,4-5) pour le lot EE2 versus 4 (3-5,3) pour le

lot témoin.

A titre indicatif nous avons également représenté sur les graphiques de nuages de points

les résultats obtenus pour les cellules traitées pendant 10 jours à l’EE2 et l’E2 (Figure 17C,

D). En effet, le faible nombre d’échantillons (N=2) ne nous permet pas de comparer

statistiquement les effets des traitements sur les deux paramètres cités. Cependant, on observe

en moyenne un pourcentage de survie cellulaire compris entre 20% et 30%, quelles que soient

les conditions de cultures (Figure 17C). En ce qui concerne le pourcentage de cellules

[GFP+] détectées, on observe une grande variabilité entre les témoins des cellules traitées

pendant 48h (4%) et les témoins des cellules traitées pendant 10 jours (8%) (Figure 17D).

Nous pouvons l’expliquer par le fait que les traitements de 10 jours ont été réalisés à partir

d’embryons de souris homozygote et hétérozygotes et les traitements de 48h ont été réalisés à

partir d’embryons de souris hétérozygotes. Il est donc difficile de conclure sur le faible

pourcentage de cellules [GFP+] détecté dans les cultures d’explants traités à l’œstradiol

pendant 10 jours par apport aux pourcentages détectés dans les cultures d’explants traitées à

l’EE2 ou cultivées en milieu témoin.

III.3. Effet d’un traitement de 17-α-éthinyloestradiol (EE2) sur le transcriptome

des cellules gliales [GFP+]

Afin d’évaluer l’effet d’un traitement aigu et chronique de 17nM d’EE2 (48h et 10

jours) sur le transcriptome des cellules gliales [GFP+] associées aux neurones à GnRH-I, nous

avons utilisé une analyse globale de recherche de « Cluster » ainsi qu’une analyse par gènes

(analyse différentielle).

Page 107: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

107

III. 3. a. Effet d’un traitement de 48h à l’EE2 sur le transcriptome des

cellules gliales [GFP+]

Nous avons comparé le profil d’expression des cellules gliales [GFP+] isolées à partir de

cultures de PO cultivées en condition contrôle (T(48h), N=4) avec le profil des cellules

traitées pendant 48h avec 17nM d’EE2 (EE2(48h) N=3) (Figure 18.

1. Analyse globale de « Clustering » et annotations des « clusters »

La classification des échantillons montre un regroupement des échantillons témoins, et un

groupement des 2/3 des échantillons traités à l’EE2 (Figure 18A) ; l’effet du traitement de

l’EE2 sur le transciptome des cellules gliales [GFP+] est reproductible. La comparaison du

profil d’expression des deux conditions T(48h) versus EE2(48h) met en évidence deux

« clusters » différentiellement exprimés : i) un premier cluster dont l’expression des gènes

diminue en condition traitée (vert, Cluster 1, Figure 18), ii) un second cluster dont

l’expression des gènes augmente en condition traitée à l’EE2 (rouge, Cluster 2, Figure 18). La

liste de gènes associés à ces clusters est listée en annexe II.

a. Annotations associées au Cluster 1 de gènes réprimés en conditions traitées à

l’EE2

Le cluster 1 est caractérisé par une répression de 272 gènes dont 45,9% de ces gènes

codent pour des phosphoprotéines (p=0,3.10-4 et Enr=1,33). Plusieurs annotations de

signalisations biochimiques (Tableau 5 et d’annotations fonctionnelles (Tableau 6 associées

à ce cluster ont été mises en évidence (p-value <0,05 et Enr>1,6). La liste des gènes associés à

ces annotations et la définition de celles-ci sont listées en annexe I.

Tout d’abord nous nous sommes intéressés aux annotations concernant des processus

biologiques « généraux ». Nous mettons en évidence que la voie de signalisation p53

(mmu04115, Tableau 5) impliquée dans l’apoptose cellulaire et l’arrêt du cycle cellulaire

(Annexe II), est très enrichie. Deux processus biologiques associés à ces phénomènes sont

détectés (tableau 4) : l’arrêt du cycle cellulaire (GO:0007050) et la régulation de l’activité des

caspases (GO:0007050). Nous remarquons un enrichissement des annotations impliquées

dans le catabolisme et le métabolisme des protéines : la protéolyse médiée par l’ubiquitination

(mmu04120, tableau 3) et la régulation de la traduction (GO:0006417, Tableau 5), mais

également dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes (GO:0010608,

Tableau 5).

Page 108: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

108

Figure 18 : :Matrice de sondes illustrant le différentiel d’expression des échantillons de cellules

gliales [GFP+] traitées pendant 48h à l’EE2 par apport aux échantillons témoins. (A) Arbre de

classification des échantillons selon leur profil d’expression génique. (B) Matrice de sondes

représentées par les sondes en ligne et les échantillons en colonne. En rouge les sondes sur-exprimées

et en vert les sondes sous-exprimées. (C) Représentation en nuage de points de –log10 (p-value) de

chaque sonde différentiellement exprimée entre les témoins T(48h) et les traitées EE2(48h). Une

moyenne mobile est représentée en orange. Cluster 1 : cluster de gènes sur-exprimès en condition

témoin, Cluster 2 : cluster de gènes sur-exprimès en condition taités l’EE2.

Page 109: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

109

KEGG Catégorie Annotation % gènes p.value Enr

mmu04115 p53 signaling pathway 2,94 2,99.10-4 6,02

mmu04120 Ubiquitin mediated proteolysis 2,94 1,60.10-2 2,99

mmu04520 Adherens junction 2,21 1,65.10-2 3,96

mmu04310 Wnt signaling pathway 2,94 2,70.10-2 2,70

mmu04510 Focal adhesion 3,31 3,96.10-2 2,29 Tableau 5 : Tableau des annotations des signalisations biochimiques sous-exprimées dans les

cellules [GFP+] traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement

GO Catégorie Ontologie Annotation % gènes p.value Enr

GO:0043281 Processus

Biologique Regulation of caspase activity 3,67 1,00.10-4 4,55

GO:0007050 Processus

Biologique cell cycle arrest 4,78 1,00.10-4 3,68

GO:0006417 Processus

Biologique Regulation of translation 2,21 1,57.10-2 4,07

GO:0010608 Processus

Biologique Post-transcriptional regulation of

gene expression 2,57 2,03.10-2 3,26

GO:0006984 Processus

Biologique ER-nuclear signaling pathway 1,47 5,93.10-3 10,63

GO:0035097 Composant

cellulaire Histone methyltransferase

complex 2,57 3,00.10-4 5,41

GO:0034708 Composant

cellulaire Methyltransferase complex 2,57 3,00.10-4 5,41

GO:0071339 Composant

cellulaire MLL1 complex 1,84 2,00.10-4 8,59

Tableau 6 : Tableau des annotations fonctionnelles sous-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement

Page 110: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

110

Nous mettons en évidence trois annotations qui désignent les lieux d’action des gènes

associés à ce cluster (Composant cellulaire, Tableau 4). Ces trois annotations sont impliquées

dans la méthylation des histones : GO:0035097, GO:0034708, GO:0071339 (Tableau 6); le

complexe MML1 (Mixed Lineage Complex leukemia protein-1) étant un membre de la

famille des histones lysine N-méthyltransferase (Annexe II).

En ce qui concerne les annotations plus « spécifiques », nous mettons en évidence que

l’annotation fonctionnelle de la voie de signalisation des récepteurs nucléaires aux œstrogènes

est très enrichie (GO:0006984, Tableau 6). Deux annotations de signalisations en rapport

avec le développement sont détectées : i) la voie de signalisation des morphogènes Wnt

(mmu04310, Tableau 5), impliqués dans la prolifération des progéniteurs cellulaires et le

contrôle de la division asymétrique (annexe I), ii) l’adhésion focale (mmu04510, Tableau 5)

qui joue un rôle essentiel dans la motilité, la prolifération, la différentiation et la survie

cellulaire (annexe II). Nous détectons un enrichissement de l’annotation des jonctions

d’adhésions intercellulaires (mmu04520), qui implique les CAM (cell adhesion molecule,

annexe I).

b. Annotations associées au Cluster 2 de gènes induits en conditions traitées à

l’EE2

Le cluster 2 est caractérisé par une induction de 269 gènes dont 49,4% codent pour des

phosphoprotéines (p=0,9.10-7 et Enr=1,44). La liste des gènes associés aux annotations de

signalisations biochimiques (Tableau 7) et fonctionnelles (Tableau 8) ainsi que la définition

de ces annotations sont listées en annexe II.

Nous mettons en évidence deux processus biologiques impliqués dans la progression du

cycle cellulaire (GO:0022402 et GO:0007049, Tableau 8). Nous remarquons un

enrichissement des annotations impliquées dans le catabolisme et le métabolisme des

protéines :

- la protéolyse médiée par l’ubiquitinisation (mmu04120, Tableau 7), qui implique une

activité ligase (GO:0004842, Tableau 8) ;

- la dégradation des ARN (mmu03018, Tableau 7) ;

Page 111: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

111

Tableau 7 : Tableau des annotations fonctionnelles sur-exprimées dans les cellules [GFP+] traitées

pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement

Tableau 8 : Tableau des annotations des signalisations biochimiques sur-exprimées dans les cellules

[GFP+] traitées pendant 48h à 17nM d’EE2. Enr : Enrichissement

GO Catégorie Ontologie Annotation % gènes p.value Enr

GO:0004842 Fonction

moléculaire ubiquitin-protein ligase activity 4,09 1,70.10-6 7,56

GO:0022613 Processus

Biologique

ribonucleoprotein complex

biogenesis 2,97 3,51.10-3 4,06

GO:0042254 Processus

Biologique ribosome biogenesis 2,60 5,23.10-3 4,37

GO:0007017 Processus

Biologique microtubule-based process 2,97 3,75.10-2 2,55

GO:0022402 Processus

Biologique cell cycle process 5,58 2,23.10-3 2,55

GO:0007049 Processus

Biologique cell cycle 7,06 4,26.10-3 2,08

KEGG Catégorie Annotation % gènes p.value Enr

mmu04120 Ubiquitin mediated proteolysis 4,08 3,8E0-5 5,2

mmu03010 Ribosome 2,6 1,00.10-3 5,4

mmu03018 RNA degradation 1,48 5,00.10-2 4,4

Page 112: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

112

- les processus cellulaires qui permettent la biosynthèse des macromolécules à partir de

complexes ribosomaux (mmu03010, Tableau 7 et GO:0022613, GO:0022613,

GO:0042254, Tableau 8).

Nous détectons également un processus biologique, significativement enrichie, impliqué dans

les phénomènes cellulaires qui dépendent ou qui modifient le cytosquelette microtubulaire

(GO:0007017, Tableau 8).

2. L’analyse différentielle par gène et annotation fonctionnelles des gènes

Nous n’avons pas mis en évidence de gènes différentiellement exprimés entre nos deux

conditions (p<0,05).

III. 3. b. Effet d’un traitement de 10 jours à l’œstradiol et à l’EE2 sur le

transcriptome des cellules gliales [GFP+]

Nous avons comparé le profil d’expression des cellules gliales [GFP+] isolées à partir

de cultures de PO cultivées en condition témoin (T(10j), N=2) avec le profil des cellules

traitées pendant 10 jours avec 17nM d’EE2 (EE2(10j) N=2). Comme témoin positif nous avons

comparé le profil d’expression des cellules [GFP+] isolées à partir de cultures de PO cultivées

en condition témoin (T(10j), N=2) avec le profil de cellules cultivées avec 100nM de β-

œstradiol ((E2(10j), N=2) (Figure 19).

1. Analyse globale de « Clustering » et annotations des « clusters »

La classification des échantillons sur l’ensemble de la matrice montre un

regroupement des échantillons témoins entre eux et des échantillons traités à l’EE2 (10j) entre

eux (Figure 7A). Cette classification permet de mettre en évidence un profil similaire de

l’expression des gènes entre les cellules traitées avec de l’EE2 et les cellules traitées à l’E

(Figure 7A). En effet on observe des signatures de gènes similaires entre les cellules [GFP+]

traitées à l’E2 (Figure 19B) et à l’EE2, (Figure 19C). Cependant seules les cellules traitées à

l’E présentent deux clusters d’expressions différentiellement exprimés (Figure 19A, 19D) :

un cluster de gènes réprimés (Cluster 1) et un cluster de gènes induits (Cluster 2) (Figure

19D). La définition de chaque annotation associée à ces deux clusters est listée en annexe II.

Page 113: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

113

Figure 19 : Matrice de sondes illustrant le différentiel d’expression des échantillons de cellules gliales

[GFP+] traitées pendant 10 jours à l’EE2 et à l’E2 par apport aux échantillons témoins A) Arbre de

classification des échantillons selon leur profil d’expression génique sur l’ensemble de la matrice de

sondes représenté par les sondes en ligne et les échantillons en colonne. En rouge les sondes sur-

exprimées et en vert les sondes sous-exprimées. (B-C) Représentation en nuage de points de –log10

(p-value) de chaque sonde différentiellement exprimée entre les témoins (T) et les traitées E2(10j) (B)

et entre les témoins (T) et les traitées EE2(10j) (C). Une moyenne mobile est représentée en orange.

(D) Extraction des clusters différentiellement exprimés entre les témoins (T) et les traitées E2(10j) :

(Cluster 1) cluster de gènes sur-exprimés en condition témoin à gauche de l’image, (Cluster 2) cluster

de gènes sur-exprimés en condition traitées l’EE2 à droite de l’image.

Page 114: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

114

a. Annotations associées au Cluster 1 de gènes réprimés en conditions traitées à

100nM l’œstradiol

L’annotation fonctionnelle du cluster 1 de gènes réprimés permet de mettre en évidence

un enrichissement des processus biologique impliqués dans :

- La prolifération cellulaire, plus particulièrement dans le cycle cellulaire mitotique

(GO:0000278) et dans l’organisation des chromosomes (GO:0051276) (Tableau 9) ;

- Le métabolisme et le catabolisme cellulaires : GO:0006397, GO:0019941, GO:0019941

GO:0044085, GO:0051603 (Tableau 9) ;

- L’organisation des microtubules du cytosquelette GO:0070507, GO:0031109,

GO:0032886 (Tableau 9).

a. Annotations associées au Cluster 2 de gènes induits en conditions traitées à

100nM l’oestradiol

L’annotation fonctionnelle du cluster 2 de gènes induits permet de mettre en évidence

un enrichissement des processus biologiques impliqués dans le métabolisme

cellulaire permettant la formation de protéine (Go:0042254, Go:0042254, Go:0042254,

Tableau 10) mais également dans l’activation de ces molécules (Go:0043038, Go:0043038,

Go:0043038, Tableau 10). Nous détectons également un processus biologique,

significativement enrichi, qui est impliqué dans le traitement des ARN non codant

(Go:0034470, Tableau 10).

2. L’analyse différentielle par gène et annotation fonctionnelles des gènes

Nous n’avons pas mis en évidence de gènes différentiellement exprimés entre nos

conditions contrôles et nos conditions traitées soit à l’EE2, soit à l’E2 (p<0,05).

Page 115: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

115

Tableau 9 : Tableau des annotations fonctionnelles sous-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 10jours à 100nM d’E2.

GO Catégorie Ontologie Annotation gènes p.value Enr

Go:0034470 Processus

Biologique Non coding RNA processing 28 8,77.10-4 1,8

Go:0042254 Processus

Biologique Ribosome biogenesis 22 1,42.10-3 2

Go:0042254 Processus

Biologique

Cellular amino acid and derivative metabolic

process 48 2,15.10-4 1,7

Go:0042254 Processus

Biologique Translation 83 2,64.10-16 2,51

Go:0043038 Processus

Biologique Amino acid activation 17 2,27.10-6 3,4

Go:0043038 Processus

Biologique Protein folding 26 3,22.10-4 2

Go:0043038 Fonction

moléculaire Structural molecule activity 56 1,48.10-5 1,8

Tableau 10 : Tableau des annotations fonctionnelles sur-exprimées dans les cellules [GFP+]

traitées pendant 10jours à 100nM d’E2.

GO Catégorie Ontologie Annotation gènes p.value Enr

GO:0000278 Processus

Biologique Mitotic cell cycle 35 8,76.10-5 2

GO:0051276 Processus

Biologique Chromosome organization 43 8,16.10-5 1,8

GO:0006397 Processus

Biologique mRNA processing 34 1,79.10-4 1,9

GO:0019941 Processus

Biologique Modification dependent protein catabolic

process 56 1,56.10-4 1,6

GO:0019941 Processus

Biologique Cellular macromolecular complex assembly 29 9,09.10-5 2,1

GO:0044085 Processus

Biologique Cellular component biogenesis 57 7,89.10-5 1,7

GO:0051603 Processus

Biologique Proteolysis involved in cellular protein

catabolic process 57 1,67.10-4 1,6

GO:0070507 Processus

Biologique Regulation of microtubule cytoskeleton

organization 8 8,08.10-5 5

GO:0031109 Processus

Biologique Microtubule polymerization or

depolymerization 8 3,24.10-5 5,6

GO:0032886 Processus

Biologique Regulation of microtubule-based process 10 4,67.10-5 34,4

Page 116: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

116

IV. Discussion du chapitre III

Nous avons émis l’hypothèse que l’impact de l’EE2 sur le développement et l’activité des

neurones à GnRH-I pourraient être médiés par les cellules gliales olfactives. Dans un premier

temps, nous avons montré que les cellules gliales olfactives GFAP-GFP isolées par FACS

expriment des gènes codant pour les récepteurs nucléaires à l’œstradiol, ERα et ERβ. L’étude

de l’effet d’un traitement aigu d’EE2 de 48h et d'un traitement chronique d’EE2 de 10 jours,

sur le transcriptome des cellules gliales olfactives [GFP+] ne permet pas de mettre en

évidence de gènes différentiellement exprimés entre nos conditions traitées à l’EE2 et nos

conditions témoins. Une analyse par clustering hiérarchique nous a permis d’extraire des

groupes de gènes dont l’expression varie dans le même sens lorsque l’on compare le

transcriptome des cellules gliales traitées pendant 48h à l’EE2 avec celui des cellules cultivées

en condition témoin. Un traitement de 10 jours à l’EE2 n’affectant pas le transcriptome des

cellules gliales, nous avons étudié l’effet d’un traitement de 10 jours de 100nM de 17-β-

œstradiol sur le transcriptome de ces cellules gliales.

IV.1. Les cellules gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I sont une

potentielle cible des œstrogènes et des xéno-œstrogènes

In vitro, l’EE2 est plus puissant que l’oestradiol pour activer les récepteurs aux

oestrogènes dans différents modèles cellulaires de mammifères et de poissons (Cosnefroy et

al. 2009; Legler et al. 2002). In vivo chez les poissons zébres une étude a montré que l’effet de

l’EE2 sur l’ontogénèse des neurones à GnRH-III est médié par les récepteurs aux œstrogènes

ERα ou ERβ. En effet, l’effet de ce PE sur l’ontogénèse des neurones à GnRH-I est aboli en

présence d’un antagoniste des récepteurs nucléaires aux œstradiols (Vosges et al 2011).

Partant de l’hypothèse que les effets de l’EE2 sur les neurones à GnRH-I seraient médiés en

partie par les cellules gliales, non avons dans un premier temps étudié si les cellules olfactives

engainantes expriment les récepteurs aux œstrogènes. En effet, l’expression des récepteurs

aux œstrogènes par les cellules gliales du SNC est bien documentée (pour revue Jung-Tesyas

1998), cependant très peu de données existent quant à l’expression des récepteurs aux

œstrogènes par les cellules gliales olfactives engainantes. Une étude menée par Gudino-

Cabrera met en évidence que les OEC du bulbe olfactif (BO) sont immunoréactives à l’ERβ

(Gudino-Cabrera 1999). Dans cette revue, les auteurs citent également des données publiées

dans un journal espagnol qui montreraient que ces OEC du BO, seraient également

Page 117: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

117

immunoréactives à l’ERα. Cependant une étude de cartographie des récepteurs à l’œstradiol

ne montre pas de cellules ERα immunopositives dans la couche glomérulaire du bulbe olfactif

(Mitra et al 2003). Seules des cellules ERβ immunoréactives sont détectées dans cette couche

du BO (Mitra et al 2003) qui est colonisée par les OEC (Marin-Padilla et al 1989).

L’expression des gènes codant les ERβ par les cellules peuplant cette couche a également été

confirmée par hybridation in situ (Shima et al 2003). Jusqu’alors, les résultats étaient donc

contradictoires et ne concernaient pas les OEC engainants les axones olfactifs et

voméronasaux du septum nasal. Dans notre étude nous montrons que les cellules gliales

olfactives engainantes associées aux neurones à GnRH-I dans les cultures d’explants de

placodes olfactives expriment les gènes codant pour les récepteurs nucléaires aux œstrogènes,

ERα et ERβ, mais également le récepteur membranaire, GPR30. Dans la littérature, à notre

connaissance, aucune donnée n’a été publiée quant à l’expression et/ou la production du

récepteur membranaire GPR30 par les OEC.

IV.2. Impact d’un traitement d’EE2 et d’E2 sur le transcriptome des cellules

gliales associées aux neurones à GnRH

Nous avons émis l’hypothèse que l’impact de l’EE2 sur l’activité des neurones à GnRH-I

pourrait être médié par les cellules gliales olfactives. Nous avons donc traités des cultures de

placodes olfactives entre le 8ème

et 10 ème

jour de cultures avec 17nM d’EE2 afin d’étudier

l’effet sur le transcriptome des cellules gliales olfactives [GFP+]. Dans cette étude nous ne

mettons pas en évidence de gènes différentiellement exprimés entre nos conditions témoins et

nos échantillons traités. La difficulté de mettre en évidence des gènes différentiellement

exprimés peut s’expliquer par nos conditions expérimentales. En effet, la faible quantité de

matériel biologique (compris entre 8,17.10-2

pg/µL et 2,71.10-4

pg/µL), le faible nombre de

réplicats (2 à 4 par conditions) ainsi que le regroupement des PO, peuvent niveler les

différences d’expressions géniques. Cependant nous mettons en évidence des groupes de

gènes (ou cluster) dont l’expression varie dans le même sens, après un traitement aigu d’EE2.

Bien entendu il est difficile d’interpréter les effets de l’EE2 sur les cellules gliales à partir de

ces données de « clustering ». Ces résultats sont à prendre avec précaution et nécessitent une

confirmation par RT-qPCR des tendances des diminutions ou des augmentations de

l’expression des gènes associés à ces annotations biochimiques et fonctionnelles. Cependant

cette analyse par « clustering » nous donne des « pistes » d’études biochimiques et/ou

Page 118: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

118

fonctionnelles afin de déterminer les effets globaux de l’EE2 sur ces cellules gliales associées

aux neurones à GnRH.

IV. 2. a. Effet de l’E2 et l’EE2 sur le cytosquelette et les jonctions d’adhésions des cellules

gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I

Dans notre étude nous mettons en évidence qu’un traitement de 17nM d’EE2 pendant

48h, réprime des « clusters de gènes » impliqués dans la signalisation des morphogènes Wnt,

dans l’adhésion focale (points d’adhésions) et dans les jonctions d’adhésions intercellulaires.

Les Jonctions adhérentes cellulaires sont des adhérences intercellulaires importantes pour le

maintien de l'architecture tissulaire. Elles comprennent les molécules d’adhésion cellulaire

(CAM), tel que les complexes cadhérine-caténine (selon la définition KEGG, Annexe I). Ce

complexe est régulé positivement pas la signalisation Wnt par inhibition de la dégradation de

la bêta-caténine ; ce qui conduit au remodelage du cytosquelette et à des changements dans

l'adhésion cellulaire et la motilité (selon la définition KEGG, Annexe I). Selon la définition

KEGG (Annexe II), les points d’adhésions correspondent à des points de contact cellule-

matrice extracellulaire, où des faisceaux de filaments d'actine sont ancrés à des récepteurs

transmembranaires de la famille des intégrines par un complexe multi-moléculaire de

protéines de plaque de jonction. Certains des constituants d'adhérences focales participent au

lien structurel entre les récepteurs membranaires et le cytosquelette d'actine, tandis que

d'autres sont des molécules de signalisation, tels que les protéines kinases et phosphatases.

Ces événements de signalisation aboutissent à la réorganisation du cytosquelette d'actine,

induisant des changements de morphologie cellulaire.

De manière intéressante nous montrons qu’un traitement à l’EE2 induit l’expression de

« clusters » de gènes impliqués dans le processus cellulaire qui dépend ou modifie le

cytosquelette microtubulaire.

L’ensemble de ces résultats suggèrent donc qu’un traitement aigu d’EE2 pourrait

affecter la réorganisation du cytosquelette, c’est à dire la morphologie des cellules gliales

olfactives associées aux neurones à GnRH-I ; et plus spécifiquement pourrait avoir un impact

sur « l’architecture tissulaire » en agissant sur les jonctions intercellulaires et les interactions

cellules-matrices extracellulaires et cellules-cellules. En présence d’un traitement chronique

de 17-β-oestradiol (E2), une répression des groupes de gènes impliqués dans la régulation et

l’organisation du cytosquelette microtubulaire a été détectée ; ce qui suggère également un

effet de l’E2 sur la morphologie des cellules gliales olfactives.

Page 119: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

119

L’œstradiol est décrit dans la littérature en tant que modulateur de la morphologie

astrocytaire (Parguez et al 1993, Micevych et al, 2010, Arevala et al, 2010). En effet cette

morphologie varie dans l’APO avec le niveau d’œstradiol au cours du développement

(Amateau et Mc Carthy 2002) mais également au cours du cycle sexuel chez l’adulte (Parduez

1993). L’œstradiol induit une augmentation du nombre de processus primaire astrocytaire (ou

branchements) en contact avec les neurones in vivo et in vitro (Mc Carthy 2002, Olmos et al

1989, Torres-Aleman 1992, Yokusuka 2008, Murashov et al 2004). Les niveaux d’œstradiol

modulent l’engainement des neurones par les cellules gliales GFAP en agissant également sur

une molécule d’adhésion la PSA-NCAM (Parkash Kaur 2005, Parkash Kaur2007). Celle-ci

lie les cellules gliales astrocytaires avec les prolongements et/ou les corps cellulaires des

neurones à GnRH-I dans la couche externe de l’EM (Parkash Kaur &, 2005) et dans l’APO

(Parkash Kaur et, 2007), mais on retrouve également ce lien entre les OEC et les neurones à

GnRH-I dans les cultures de placodes olfactives de souris (Franceschini et al 2012).

En ce qui concerne les effets de xéno-oestrogènes, des études menées sur des cultures

primaires d’astrocytes hypothalamiques mettent en évidence une augmentation de la surface

GFAP positive en présence de nonylphenol à des doses allant de 10nM à 100nM (Yokosuka

2008). Des changements d’intensité de l’immunoréactivité à la GFAP en réponse à différentes

concentrations de BPA allant de 10pM à 1µm ont également été décrits (Miyataka 2006).

Nos résultats sont donc en accord avec les données bibliographiques qui montrent un

effet des substances œstrogèniques sur la morphologie des cellules gliales, en réorganisant le

cytosquelette, mais également sur l’architecture tissulaire, en touchant les jonctions

cellulaires. Bien entendu il est indispensable de confirmer nos données de « clustering » en

menant des études morphométriques sur les OEC associées aux neurones à GnRH-I dans

notre système de culture en présence et en absence d’EE2, en analysant les effets sur la GFAP-

ir, la GnRH-ir et potentiellement la PSA-NCAM-ir.

Page 120: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

120

IV. 2. b. Effet de l’E2 et de l’EE2 sur l’apoptose et la prolifération des cellules gliales

olfactives associées aux neurones à GnRH-I

Dans notre étude nous montrons qu’un traitement aigu d’EE2, de 17nM pendant 48h,

entraîne une répression de groupes de gènes impliqués dans l’apoptose cellulaire, en touchant

la voie de signalisation p53 et la voie de régulation des caspases. Il est admis que les

œstrogènes préviennent ou initient la mort cellulaire d’origine naturelle (pour revue Mc

Carthy et al 2009). Les œstrogènes sont connus pour exercer des effets neuro-protecteurs

(Behl 2002; Brann et al. 2007; Garcia-Segura et al. 2001). Par exemple, l’oestradiol favorise

la survie neuronale (Ormerod et al. 2004) et prévient l’apoptose neuronale (Linford and Dorsa

2002) via les cellules gliales (Dhandapani et Brann 2007). In vitro, il a été montré en

condition ischémique que l’œstradiol (10nM de 17-β-oestradiol pendant 48h) à des effets

protecteur sur les cellules gliales astrocytaires corticales médiés par les récepteurs ERα et/ou

ERβ (Guo et al 2012). En effet en présence d’un inhibiteur des récepteurs nucléaires aux

œstrogènes l’effet protecteur de l’E2 est abolit (Guo et al 2012).

Selon notre étude, un traitement de 17nM d’EE2 pendant 48h réprime les gènes

impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire et au contraire induit l’expression de groupe de

gènes impliqués dans la mitose cellulaire. Tandis qu’un traitement chronique de 100nM de

17-β-estradiol réprime les gènes impliqués dans la mitose. Une étude de Garcia-Segura a mis

en évidence que les estrogènes natifs régulent négativement la prolifération astrocytaire après

lésion cérébrale (Garcia-Segura 1993). De même une étude menée sur des souris

ovariectomisées, met en évidence qu’une supplémentation avec des faibles doses d’oestradiol

réduit significativement la prolifération cellulaire au niveau du bulbe olfactif accessoire,

tandis qu’une supplémentation avec des fortes doses induit un effet sur la survie cellulaire

(Hoyk et al 2006). De nombreuses études mettent en évidence une augmentation de la

prolifération des cellules gliales en présence d’œstradiol (Jung testas 1992, Jacobson 1981,

Koehler 2005, Wang 2003, Soto 1991 et Krishnon 1993). De même, les xéno-estrogènes, telle

que le Nonylphenol et le Bisphenol A, promeuvent la prolifération cellulaire et l’activité

transcriptomique (Soto 199, Krishnon 1993).

Les effets opposés des œstrogènes en fonction de la région et des concentrations sont

bien décrites dans la littérature (pour revue Mc Carthy 2009). Nos résultats de clustering nous

amènent à la conclusion qu’un traitement aigu d’EE2 induit une survie cellulaire et une

prolifération des OEC, tandis qu’un traitement chronique d’E2 réprime la mitose. Cependant

Page 121: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

121

les analyses réalisées par FACS ne montrent pas d’effet de l’EE2 après 48h sur la survie

cellulaire et le pourcentage de cellules gliales. On peut donc supposer que l’effet de l’EE2 sur

la survie ou la prolifération cellulaire des OEC est minime et ne peut être détecté par cette

approche. Si cet effet ne concerne pas l’ensemble des cellules qui composent l’explant, il peut

être difficile de détecter une action sur 6%des cellules qui composent cette culture, et après

seulement 48h d’incubation. Il serait donc nécessaire d’évaluer l’effet de l’EE2 sur

l’apopotose des OEC par un test de Tunnel et sur la prolifération cellulaire des OEC en

utilisant des traitements aux BrDU à partir de cultures traitées avec des cinétiques de

traitements croissantes.

IV. 2. c. Impact génomique des voies biochimiques impliquées dans la régulation post-

traductionnelle des cellules gliales olfactives associées aux neurones à GnRH-I

par un traitement aigu d’EE2

1. Régulation post-traductionnelle et répression de la régulation transcriptionnelle médiée

par les récepteurs nucléaires aux estrogènes

Dans notre étude nous mettons en évidence qu’un traitement de 17nM d’EE2 pendant

48h révèle deux « clusters de gènes » qui codent majoritairement pour des phosphoprotéines.

Ces résultats suggèrent un effet post-traductionnel de l’EE2 par addition d’un groupe

fonctionnel de phosphate. L’annotation des voies biochimiques et l’annotation fonctionnelle

des deux clusters montrent un enrichissement de la voie de l’ubiquitination. Cette

modification post-traductionnelle biochimique consiste à additionner des groupes de

protéines, ce qui entraine une dégradation des protéines par le protéosome. On détecte

également une répression des gènes impliqués dans les modifications post-transcriptionnelles

et dans la dégradation des ARN. De plus on observe une répression de la voie biochimique

des récepteurs à l’œstradiol. Selon la définition GO cette voie biochimique concerne « Toute

série de signaux moléculaires qui transmet de l'information à partir du réticulum

endoplasmique vers le noyau, et qui entraîne un changement dans la régulation

transcriptionnelle ». Ces résultats suggèrent donc qu’un traitement aigu d’EE2 entraine une

diminution de la régulation transcriptionnelle médiée par les récepteurs nucléaires aux

œstrogènes.

L’ensemble de ces résultats suggèrent que l’impact d’un traitement de 48h avec 17nM

d’EE2 réprime ou induit majoritairement des groupes de gènes codant pour des protéines

Page 122: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

122

impliquées dans des voix biochimiques de régulation post-traductionnelle et est corrélée avec

une répression des groupes de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle. Dans la

littérature les études décrivent des effets des xénoestrogènes sur l’expression de gènes dont le

produit est directement impliqué dans la fonction étudiée (action génomique) et/ou sur une

action non génomique (pour revue Silva 2010, Sam De Coster 2012, Watson 2007). Ce

second mécanisme concerne les interactions avec des signaux de transductions moléculaires

en mobilisant le calcium intracellulaire ou en stimulant entre autre des kinases (tel que la

PI3K et la PKB) et la cascade Src/Ras/Erk (Pour revue Sam De Coster, pour revue Silva

2010). Cette action non génomique de l’œstradiol et des dérivés synthétiques n’exclut pas la

possibilité d’une influence indirecte sur l’expression des gènes (pour revue Silva 2010). Bien

que des études traitent des réactions croisées entre ces voies génomiques et non génomiques

(Pour revue Sam De Coster 2012, pour revue Silva 2010), aucune ne s’intéresse à un effet

génomique des perturbateurs endocriniens dont l’impact physiologique serait médié

principalement par des modifications post-traductionnelles.

2. Régulations épigènétiques

On détecte également un effet de l’EE2 sur la répression des gènes impliqués dans la

méthylation des histones. La méthylation des histones est une modification post-

traductionnelle qui à pour conséquence une répression transcriptionnelle des gènes (pour

revue Gore et al 2008, Muller et al 2012). Ce phénomène moléculaire régule l’expression des

gènes sans altérer la séquence nucléotidique (pour revue Anway 2006, Bernal et al 2010) en

modifiant chimiquement l’ADN et les histones qui compactent l’ADN dans le noyau (Bernal

et al 2010). Ce système de régulation non génomique (pour revue Gore et al 2010) est

dénommé régulation épigénétique (pour revue Anway 2006, Bernal et al 2010). Si cette

empreinte génétique touche les cellules germinales elle est héréditaire (Crews et al 2008). Elle

touche également des cellules mitotiques non germinales, comme dans notre étude, ce qui

induit un polymorphisme phénotypique appelé également « plasticité phénotypique » (Crews

et al 2008). Des études ont déjà mis en évidence l’impact de perturbateurs endocriniens sur le

développement et le bon fonctionnement de systèmes neuroendocrines par une régulation

épigénétique cependant les gènes ciblés n’ont pas encore été mis en évidence (Pour revue

Crews et al 2008, Gore et al 2008).

Dans notre étude nous détectons une répression de groupe de gènes impliqués dans le

complexe MLL1, mixed-lineage leukemia histone methylases. Ce complexe multi-protéique

Page 123: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

123

méthyle les histones et joue un rôle crucial dans l’activation des gènes (Dou et al 2006). Il a

été montré sur des souris adultes qu’une déficience en MLL1 favorise la différenciation gliale

des cellules souches neurales de la zone sous ventriculaire et altère gravement la

différenciation neuronale (Lin et al 2009). Récemment il a été mis en évidence qu’en présence

de 17-β-estradiol le complexe MLL1 pouvait être recruté par les ER et régulerait l’activité

transcriptomique des gènes (Khair ul et al 2013).

Ces résultats donnent pour le long terme des pistes de mode d’action d’un traitement

aigu d’EE2 sur les cellules gliales olfactives dans notre système de culture. En effet si l’on

confirme une action de l’EE2 sur les différents processus biologiques cités ci-dessus, il

pourrait être intéressant d’étudier si ces effets sont principalement dus à des régulations post-

traductionnelles et épigénétiques.

V. Conclusion

Notre étude ne nous permet pas de conclure de l’effet de l’EE2 sur le transcriptome de ces

cellules gliales. En effet nous ne détectons pas de gènes différentiellement exprimés entre nos

conditions traitées et notre condition contrôle. Cependant, nous mettons en évidence des

groupes de gènes dont l’expression varie dans le même sens lorsque l’on traite les cultures de

PO à l’EE2 pendant 48h. Les annotations des voies biochimiques et les annotations

fonctionnelles associées à ces groupes de gènes donnent des pistes d’études. Ainsi il serait

intéressant d’étudier les effets de l’EE2 sur: i) la morphologie des cellules gliales et leurs

capacité d’engainer les neurones à GnRH-I, ii) la suivie et la prolifération de ces cellules

gliales, iii) les régulations post-traductionnelles et épigénétique qui pourraient être mises en

jeux. Il est donc indispensable de confirmer ces donnés de « clustering » associées « aux

pathways » par des études fonctionnelles, cependant nous pouvons supposer que si ces voix

biochimiques sont effectivement altérées, cela pourrait avoir un impact sur le développement

et la régulation des neurones à GnRH-I ; sujet que nous développerons dans la partie

discussion de ce manuscrit.

Page 124: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

124

DISCUSSION

Page 125: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

125

Nous avons mis en évidence que les neurones à GnRH-I possèdent un environnement glial au

cours de leur migration. La caractérisation de ces cellules nous ont permis de les identifier

autant que des cellules gliales olfactives engainantes (OEC). Ces cellules sont caractérisées

dans la littérature par leurs répertoires d’expressions de marqueurs antigéniques mixtes

d’astrocytes et de cellules de Schwann mais également par leur capacité à engainer les axones.

I. Les neurones à GnRH-I possèdent-il un environnement glial avant d’entamer leur

migration nasale ?

Dans le second article présenté dans le chapitre I de cette thèse, nous ne mettons pas en

évidence de progéniteurs pluripotent de ces cellules gliales BLBP immuno-réactives dans

l’organe voméronasal (VNO). Cette observation est en accord avec les données de Murdoch

et Roskams (2007, 2008) qui ne mettent pas en évidence de progéniteurs BLBP positif dans

l’épithélium du VNO chez la souris à E10,5 et E13,5. En effet seules des cellules

multipotentes de type glie radiaire (RGPL), sont retrouvées dans ces tissus au cours du

développement embryonnaire (Murdoch et Roskams 2007 et Murdoch et Roskams 2008). En

effet, à ces stades précoces du développement, l’épithélium olfactif et voméronasal contient

des progéniteurs en prolifération, n’exprimant pas d'antigène de lignée neuronale ou gliale

mais exprime la Nestin (Murdoch 2007). Dans notre première étude nous mettons en évidence

des cellules hGFAP-GFP dans l’épithélium voméronasal à partir de E13,5. Cependant nous ne

pouvons pas affirmer que ces cellules soient des cellules gliales et non des RGPL. En effet

dans cette étude nous avons utilisé une lignée de souris transgénique exprimant le GFP sous le

contrôle du promoteur humain de la GFAP, connus pour être exprimé dans le cerveau par la

glie radiaire mutipotentes, contrairement au promoteur souris de la GFAP, et dans les cellules

gliales maturent (Nolte et al 2001,(Morita et al. 1997)Wang et Bordey 2008,(Brenner and

Messing 1996) Ikenaka, 1997). Cependant il n’existe pas de donnée(s) sur l’expression du

promoteur de la GFAP humaine dans le système olfactif en développement. Il serait donc

nécessaire de vérifier si les cellules hGFAP-GFP que nous détectons dans le VNO sont des

ces cellules multipotentes RGPL. Nous pouvons également nous interroger sur le devenir

phénotypique des RGPL du voméronasal ; pourraient-elles se différencier en neurones à

GnRH-I et en cellules gliales ? Les études récemment publiées sur l’origine des neurones à

GnRH-I et des OEC (Barraud et al. 2010; Forni et al. 2011b; Katoh et al. 2011) nous laissent

supposer que cela concernerait qu’une très faible proportion des neurones à GNRH-I. En effet

seulement 30% des neurones à GnRH-I proviennent de la crête neurale, région dont sont

Page 126: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

126

originaire la globalité des OEC (Forni et al 2011b). Le fait que Forni et al. (2011b) ne mettent

pas en évidence de cellules exprimant de marqueurs gliaux originaire de la PO dans le septum

nasal, signifie que les progéniteurs des neurones à GnRH-I provenant de la placode olfactive

ne fourniraient que des cellules neuronales.

II. Les cellules gliales olfactives engainantes accompagnent-elles les neurones à

GnRH-I dans l’APO et l’hypothalamus ?

Nous avons mis en évidence que les neurones à GnRH-I possèdent un environnement glial

tout au long de leur migration nasale, en immunomarquant la BLBP et la GFP exprimé sous le

contrôle de la GFAP ; mais aussi dans le télencéphale, à l’aide de l’immunomarquage de la

BLBP. Quelques études de microscopie électronique mettent en évidence la présence de

cellules gliales autours des nerfs voméronasaux chez le rat au cours du développement

embryonnaire (Fraher 1982) post-natal (Ichikawa and Osada 1995) et chez l’adulte (Raisman

1985), mais aussi le long de la partie télencéphalique du nerf terminal (Zheng et Jourdan

1993). Mais qu’en est-il de la partie diencéphalique du nerf terminal? En effet nous mettons

en évidence dans dans le diencéphale, l’existence de cellules BLBP immunoréactives,

apposées aux axones périphérines immunorécatifs, de morphologie similaire aux OEC.

Cependant la BLBP étant également exprimé par la glie radiaire dans le cerveau en

développement (Feng et al., 1994; Anthony et al., 2004; Anthony & Heintz, 2007), nous ne

pouvons pas affirmer que ces cellule soient des OEC. Afin de déterminer si des cellules

gliales provenant de la crête neurale migrent dans l’hypothalamus, deux méthodes le lignage

des progéniteurs peuvent être utilisés : soit en injectant un traceur rétroviral dans la fosse

nasale (Joyner et Zervas 2006) à E10,5, avant le début de migration des progéniteurs des OEC

(Miller et al 2010). On pourrais également utiliser des souris transgéniques ROSA, chez

lesquels la cartographie du destin cellulaire est faite en utilisant les promoteurs spécifiques

des progéniteurs à l’aide d’un site de recombinase Cre.

Récemment, Blanchart et al (2011) ont utilisé un rétrovirus eGFP in utéro au niveau de la

fosse nasale chez des souris à partir du 11ème

jour de gestation, cependant l’étude ne détecte à

E18 et P30 la présence de cellules eGFP au-delà de la couche externe du BO. Ce pendant les

marquages dirigé contre la GnRH-I sur des coupes de têtes d’embryons âgés de 15 jours in

utéro, ne détecte pas la présence de cellules GnRH-ir et eGFP positive, ce qui suggère que

l’injection du rétrovirus pourrait être fait latéralement, ne permettant pas au virus d’infecter

les progéniteurs neuronaux et gliaux qui proviennent de la partie médiale de la fosse nasale.

Page 127: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

127

Quelques mois plutôt, Forni et al (2011b), ont utilisés une lignée de souris transgénique

permettant de tracer les cellules provenant de la crête neurale (souris transgénique Wnt1Cre-

βGal). Ils mettent clairement en évidence à E16,5 la présence de cellules β-Gal dans le

cerveau doublement-marqués à la GnRH-I. On peut observer sur cette figure du marquage

βGAL à proximité de ces neurones mais n’étant pas immuno-réactif à la GnRH-I. L’étude ne

caractérise pas le phénotype de ces cellules et n’en fais pas mention dans le papier. Il serait

intéressant de vérifier si ces cellules expriment des marqueurs gliaux, et de vérifier leur trajet

de migration en suivant la migration des cellules wnt1cre en « time lapses » sur des tranches

de cerveaux d’embryons de souris (Giacobini et al. 2008).

III. Les cellules gliales olfactives engainantes permettent-elles la migration des

neurones à GnRH-I ?

Comme nous l’avons mis en évidence dans le premier papier de cette thèse, les cellules gliales

[GFP+], qui forment le microenvironnement des neurones à GnRH-I, expriment des facteurs

connus pour intervenir dans la migration neuronale telle que Nelf et la Sémaphorine 4D. Les

OEC expriment également la sémaphorine 3A (Schwarting et al 2000) les éphrines (St John et

al 2002) et les NCAM (Miragall 1989, 1988) connus pour intervenir dans la migration des

neurones à GnRH-I (pour revue Wray 2002, Wierman 2010, Wray 2010).

La majorité de ces facteurs sont indispensable dans l’extension des axones

olfactifs/voméronasaux, comme l’illustre le syndrome de Kallmann qui présente pour

phénotype un défaut de migration des neurones à GnRH-I et un défaut d’extension des axones

voméronaux et olfactifs (pour revue Pitteloup et al 2010). Les OEC sont indispensable à la

mise en place des axones olfactifs/voméronasaux (Nieto-Sampedro and Ramon-Cueto 1993,

Ramon Cueto and Nietosampedro 1994) ; on peut en déduire qu’indirectement ces cellules

interviennent dans la migration de ces neurones.

Les cellules gliales [GFP+] que nous avons caractérisé dans le premier chapitre de cette thèse,

expriment la sémaphorine 4D, nécessaire à la migration des neurones à GnRH-I ; et ne semble

pas intervenir dans la migration des axones voméronasaux. En effet, l’absence d’expression

de ce facteur, chez les souris KO, entraine un défaut de migration des neurones à GnRH-I au

cours du développement embryonnaire (Giacobini et al. 2008). Ces observations suggèrent

donc que les axones ne sont pas suffisant pour la migration des neurones à GnRH-I et

renforce notre hypothèse quand à l’importance des OEC dans la migration de ces neurones.

Page 128: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

128

Afin de pouvoir tester notre hypothèse il serait nécessaire dans un premier temps de vérifier si

les OEC sont suffisantes à la migration de ces neurones. Pour se faire on pourrait utiliser une

lignée cellulaire de neurones à GnRH-I qui possèdent la capacité de migrer, les Gn11 ; que

l’on co-cultiverais avec des cultures primaire d’OEC ou du milieu conditionné d’OEC. Cette

première approche nous permettrait de distinguer l’implication de ces cellules gliales dans la

migration de ces neurones via des molécules d’adhésion ou via des facteurs diffusibles. Afin

de pouvoir vérifier que ces cellules gliales soient indispensables à la migration de ces

neurones plusieurs modèles animaux pourraient être utilisé :

-1) une lignée de souris transgéniques permettant l’ablation des cellules gliales, tel que les

souris Gfap-Tk (Bush et al 1999), qui nous permet d’induire l’ablation des cellules gliales en

prolifération. Cependant ce type de lignée risque de toucher l’ensemble des cellules qui

expriment la Gfap à des stades immatures, ce qui concerne également les cellules

multipotentes RGPL.

-2) une lignée de souris transgéniques qui nous permet d’induire un défaut d’expression d’un

facteur indispensable à la migration de ces neurones et non pas pour la mise en place des

axones voméronasaux, tel que la Sémaphorine 4D, sous le contrôle de la BLBP.

Ces deux types de lignée permettraient d’étudier la migration précoce des neurones à GnRH-I

dans le septum nasal. En effet pour les deux modèles on risque de toucher des cellules gliales

du cerveau. Il est donc indispensable de mettre en évidence un marqueur spécifique de ces

cellules gliales à l’aide par exemple, d’une analyse différentielle du transcriptome des OEC et

d’astrocytes hypothalamiques. Nous pouvons également, à partir de nos données de

transcriptome des cellules gliales [GFP+] cultivées en condition témoin nous pouvons réaliser

une méta-analyse avec des données de transcriptome d’astrocytes déjà publiées (ref).

IV. Les cellules gliales olfactives engainantes permettent-elles la différenciation et la

régulation de l’activité des neurones à GnRH-I ?

Nous mettons en évidence une corrélation entre la formation d’un réseau neuro-glial (Geller

et al 2012) et l’acquisition et la maturation de l’activité sécrétrice des neurones à GnRH-I in

vitro sur les cultures de PO après 10 jours de cultures (Constantin et al 2009). Au cours de ma

thèse j’ai participé à une étude qui permet de mettre en évidence dans des cultures de PO âgés

de 7 à 10 jours, le rôle des cellules gliales de type OEC dans la régulation de la sécrétion

épisodique de GnRH-I, en impliquant des communications directes entre-elles composé de

connexine 43 (Annexe II). Cette étude nous conforte dans l’idée que les cellules gliales

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129

olfactives OEC feraient partie du microenvironnement hypothalamique des neurones à

GnRH-I, comme nous l’avions développée dans la partie II de cette discussion. Récemment il

a été mis en évidence sous forme de présentation affichée au congrès de la SNE de 2012, la

présence de cellules gliales de morphologie astrocytaire et de phénotypes immatures à

proximité des neurones à GnRH- I dans l’APO de souris (Sharif 2012), qui pourraient

s’apparenter à des cellules gliales olfactives. Cependant il ne faut pas oublier que les OEC

possèdent des caractéristiques communes avec des astrocytes existants dans l’environnement

des neurones à GnRH-I in vivo. De plus, une revue publié en 1999 décrit les ressemblances

frappantes entre les OEC et les tanycytes qui bordent le troisième ventricule (porurevue

Gudino-Cabera 1999), connus pour leurs implication dans la régulation de l’activité des

neurones à GnRH-I au niveau de l’éminence médiane (pour revue Prevot et al 2010). Les

deux types cellulaires présentent un profil de cellules gliales immatures, par le profil

antigénique (en produisant le récepteur p75NTR, l’antigène O4, les protéines GFAP, la PSA-

NCAM) et par leur capacité de proliférer à partir de tissus adultes. De plus elles induisent la

croissance des neurites, et guident et engainent les neurites en croissances. Ainsi ils

considèrent ces cellules, avec également les cellules gliales de la glande pinéale, les cellules

de la rétine de Müller, et les cellules gliales de Bergmann, comme un groupe distinct de

cellules gliales permettant la croissance du système nerveux central, qu’ils nomment

« macroglia aldynoglia ».

Ainsi même si les OEC ne migrent pas dans le diencéphale, elles possèdent des

caractéristiques communes avec les tancytes et avec les astrocytes, et pourraient donc recréer

dans ce modèle in vitro un type de régulation hypothalamique

V. Ce système est-il dérégulé en présence d’un pertubateur endocrien ?

. Notre étude de transcriptome montre que lorsque l’on implique un traitement de 48h d’EE2,

nous mettons en évidence des « pathways » impliqués dans la réorganisation du cytosquelette,

et des jonctions d’adhérences cellulaires (NCAM). La PSA-NCAM est connue pour intervenir

dans la migration des neurones à GnRH-I le long des axones (Franceschini et al. 2010) mais

également dans la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I au niveau hypothalamique

(Franceschini et al. 2010). Comme nous l’avons vu dans cette discussion, les OEC sont PSA-

NCAM-immunoréactives. Au sein de notre équipe, il a été mis en évidence dans les cultures

d’explants de placodes olfactives une association étroite entre les cellules gliales GFAP-

immunorécative et les neurones à GnRH-I exprimant toutes les deux la PSA-NCAM

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130

(Franceschini et al. 2010). Il serait donc intéressant d’étudier l’effet de l’EE2 sur le marquage

PSA-NCAM des neurones à GnRH-I et des cellules gliales qui leurs sont associées dans notre

système de culture. Cette analyse devrait être réalisée sur des cultures âgées de 0 à 6 jours de

développement in vitro, à la période de migration des neurones à GnRH-I. Elle pourrait être

également plus tardivement, au moment de la maturation du profil de sécrétion de ces

neurones.

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131

CONCLUSION

Au cours de cette thèse nous avons mis en évidence la présence d’un environnement

glial associé aux neurones à GnRH-I en migration. La caractérisation de ces cellules gliales

nous a permis de les identifier en tant que cellules gliales olfactives engainantes (OEC). Les

études que nous avons menées in vivo révèlent la plasticité du phénotype au cours de leur

migration. De manière intéressante elles expriment des molécules d’adhésion mais également

des facteurs diffusibles nécessaires à la migration de ces neurones. De plus, la communication

de ces cellules gliales par jonctions communicantes régule l’activité du réseau neuronal de

GnRH-I. Cependant plusieurs questions restent à élucider : Ces cellules gliales sont-elles

indispensables et suffisantes à la migration de ces neurones ? Forment-elles une partie du

microenvironnement gliale hypothalamique de ces neurones à l’âge adulte ? Régulen t-elles in

vivo l’activité des neurones à GnRH-I chez l’adulte ?

En ce qui concerne le travail réalisé sur les PE, à ce stade de l’étude il est difficile de conclure

de l’effet de l’EE2 sur le transcriptome de ces cellules gliales, cependant nos résultats

préliminaires, nous intéroge quant à la possibilité qu’un traitemnt de 48h d’EE2 module

l’activité des neurones à GnRH-I et leur migration en altérant leur association via des

molécules d’adhésion cellulaire.

Les résultats obtenue au cours de cette thèse nous permettent de conclure que les neurones à

GnRH-I possédent un environnement glial tout au long de leur migration, et suggère

l’implication des cellules gliales olfactives engainantes dans l’ontogenèse de ces neurones et

dans leur régulation.

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Page 140: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

140

ANNEXE

Page 141: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

141

ANNEXE I: Liste des gènes et définitions en anglais des annotations

Cluster 1 de gènes sous-exprimés dans les cellules [GFP+] traitées pendant 48h avec 17nM d’éthinyloestradiol

Catégorie Annotation Nom des

gènes Définition des annotations

mmu04115 p53 signaling

pathway

CCND1

CDKN2A

SIAH1B

CYCS

MDM2

MDM4

THBS1

SESN1

p53 activation is induced by a number of stress signals, including DNA damage, oxidative stress and activated oncogenes.

The p53 protein is employed as a transcriptional activator of p53-regulated genes. This results in three major outputs; cell

cycle arrest, cellular senescence or apoptosis. Other p53-regulated gene functions communicate with adjacent cells, repair

the damaged DNA or set up positive and negative feedback loops that enhance or attenuate the functions of the p53

protein and integrate these stress responses with other signal transduction pathways

mmu04120 Ubiquitin mediated

proteolysis

UBE2A

SIAH1B

KLHL9

UBR5

MDM2

HERC4

UBE2L3

UBE2B

Protein ubiquitination plays an important role in eukaryotic cellular processes. It mainly functions as a signal for 26S

proteasome dependent protein degradation. The addition of ubiquitin to proteins being degraded is performed by a

reaction cascade consisting of three enzymes, named E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin conjugating

enzyme), and E3 (ubiquitin ligase). Each E3 has specificity to its substrate, or proteins to be targeted by ubiquitination.

Many E3s are discovered in eukaryotes and they are classified into four types: HECT type, U-box type, single RING-

finger type, and multi-subunit RING-finger type. Multi-subunit RING-finger E3s are exemplified by cullin-Rbx E3s and

APC/C. They consist of a RING-finger-containing subunit (RBX1 or RBX2) that functions to bind E2s, a scaffold-like

cullin molecule, adaptor proteins, and a target recognizing subunit that binds substrates.

mmu04520 Adherens junction

ACTB

CSNK2A1

FYN

PVRL3

CSNK2B

MLLT4

Cell-cell adherens junctions (AJs), the most common type of intercellular adhesions, are important for maintaining tissue

architecture and cell polarity and can limit cell movement and proliferation. At AJs, E-cadherin serves as an essential cell

adhesion molecules (CAMs). The cytoplasmic tail binds beta-catenin, which in turn binds alpha-catenin. Alpha-catenin is

associated with F-actin bundles directly and indirectly. The integrity of the cadherin-catenin complex is negatively

regulated by phosphorylation of beta-catenin by receptor tyrosine kinases (RTKs) and cytoplasmic tyrosine kinases (Fer,

Fyn, Yes, and Src), which leads to dissociation of the cadherin-catenin complex. Integrity of this complex is positively

regulated by beta -catenin phosphorylation by casein kinase II, and dephosphorylation by protein tyrosine phosphatases.

Changes in the phosphorylation state of beta-catenin affect cell-cell adhesion, cell migration and the level of signaling

beta-catenin. Wnt signaling acts as a positive regulator of beta-catenin by inhibiting beta-catenin degradation, which

stabilizes beta-catenin, and causes its accumulation. Cadherin may acts as a negative regulator of signaling beta-catenin as

it binds beta-catenin at the cell surface and thereby sequesters it from the nucleus. Nectins also function as CAMs at AJs,

but are more highly concentrated at AJs than E-cadherin. Nectins transduce signals through Cdc42 and Rac, which

reorganize the actin cytoskeleton, regulate the formation of AJs, and strengthen cell-cell adhesion.

Page 142: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

142

mmu04310 Wnt signaling

pathway

TBL1XR1

CCND1

CSNK2A1

SIAH1B

CSNK2B

MAPK8

PPP2R5E

APC

Wnt proteins are secreted morphogens that are required for basic developmental processes, such as cell-fate specification,

progenitor-cell proliferation and the control of asymmetric cell division, in many different species and organs. There are

at least three different Wnt pathways: the canonical pathway, the planar cell polarity (PCP) pathway and the Wnt/Ca2+

pathway. In the canonical Wnt pathway, the major effect of Wnt ligand binding to its receptor is the stabilization of

cytoplasmic beta-catenin through inhibition of the bea-catenin degradation complex. Beta-catenin is then free to enter the

nucleus and activate Wnt-regulated genes through its interaction with TCF (T-cell factor) family transcription factors and

concomitant recruitment of coactivators. Planar cell polarity (PCP) signaling leads to the activation of the small GTPases

RHOA (RAS homologue gene-family member A) and RAC1, which activate the stress kinase JNK (Jun N-terminal

kinase) and ROCK (RHO-associated coiled-coil-containing protein kinase 1) and leads to remodelling of the cytoskeleton

and changes in cell adhesion and motility. WNT-Ca2+ signalling is mediated through G proteins and phospholipases and

leads to transient increases in cytoplasmic free calcium that subsequently activate the kinase PKC (protein kinase C) and

CAMKII (calcium calmodulin mediated kinase II) and the phosphatase calcineurin.

mmu04510 Focal adhesion

ACTB

PDPK1

CCND1

FYN

PPP1R12

A MAPK8

COL2A1

THBS1

PIK3R1

Cell-matrix adhesions play essential roles in important biological processes including cell motility, cell proliferation, cell

differentiation, regulation of gene expression and cell survival. At the cell-extracellular matrix contact points, specialized

structures are formed and termed focal adhesions, where bundles of actin filaments are anchored to transmembrane

receptors of the integrin family through a multi-molecular complex of junctional plaque proteins. Some of the constituents

of focal adhesions participate in the structural link between membrane receptors and the actin cytoskeleton, while others

are signalling molecules, including different protein kinases and phosphatases, their substrates, and various adapter

proteins. Integrin signaling is dependent upon the non-receptor tyrosine kinase activities of the FAK and src proteins as

well as the adaptor protein functions of FAK, src and Shc to initiate downstream signaling events. These signalling events

culminate in reorganization of the actin cytoskeleton; a prerequisite for changes in cell shape and motility, and gene

expression. Similar morphological alterations and modulation of gene expression are initiated by the binding of growth

factors to their respective receptors, emphasizing the considerable crosstalk between adhesion- and growth factor-

mediated signalling.

GO:0043281 Regulation of caspase

activity

TRIAP1

CIB1

CYCS

MDM2

GPI1

THBS1

UACA

CDKN2D

BAX

CDKN2A

Any process that modulates the activity of a cysteine-type endopeptidase involved in apoptosis

Page 143: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

143

GO:0007050 Cell cycle arrest

CDKN1B

PTPN11

MDM2

SMC1A

APC

CYP27B1

A regulatory process that halts progression through the cell cycle during one of the normal phases (G1, S, G2, M).

GO:0006417 Regulation of

translation

NCBP2

EIF4G1

RBM8A

PAIP1

IREB2

PPP1R15B

PSMG2M

DM4

SESN1

THBS1

CCND1

CDKN2D

CDKN2A

Any process that modulates the frequency, rate or extent of the chemical reactions and pathways resulting in the formation

of proteins by the translation of mRNA.

GO:0010608

Posttranscriptional

regulation of gene

expression

NCBP2

EIF4G1

CDKN2A

RBM8A

PAIP1

IREB2

PPP1R15B

Any process that modulates the frequency, rate or extent of gene expression after the production of an RNA transcript

GO:0006984 ER-nuclear signaling

pathway

CCND1

DERL1

ERO1L

PPP1R15B

Any series of molecular signals that conveys information from the endoplasmic reticulum to the nucleus, usually resulting

in a change in transcriptional regulation

GO:0035097

Histone

methyltransferase

complex

TAF7

INO80C

TAF1

LAS1L

MCRS1

ACTB

SETD1A

A multimeric complex that is able to catalyze the addition of methyl groups to histone proteins.

Page 144: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

144

GO:0034708 Methyltransferase

complex

INO80C

TAF7

TAF1

LAS1L

MCRS1

ACTB

SETD1A

A protein complex that possesses methyltransferase activity

GO:0071339 MLL1 complex

INO80C

TAF7

TAF1

LAS1L

MCRS1

A protein complex that can methylate lysine-4 of histone H3. MLL1/MLL is the catalytic methyltransferase subunit, and

the complex also contains the core components ASH2L, HCFC1/HCF1 WDR5 and RBBP5.

Page 145: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

145

Cluster 2 de gènes sur-exprimés dans les cellules [GFP+] traitées pendant 48h avec 17nM d’éthinyloestradiol

Catégorie Annotation Nom des

gènes Définition de l’annotation

mmu04120 Ubiquitin mediated

proteolysis

ANAPC2

UBE2D2

CUL4A

UBE2K

UBA1

PIAS3

UBE2G2

SAE1

TCEB1

UBE2E2

UBE2R2

Protein ubiquitination plays an important role in eukaryotic cellular processes. It mainly functions as a signal for 26S

proteasome dependent protein degradation. The addition of ubiquitin to proteins being degraded is performed by a

reaction cascade consisting of three enzymes, named E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin conjugating

enzyme), and E3 (ubiquitin ligase). Each E3 has specificity to its substrate, or proteins to be targeted by ubiquitination.

Many E3s are discovered in eukaryotes and they are classified into four types: HECT type, U-box type, single RING-

finger type, and multi-subunit RING-finger type. Multi-subunit RING-finger E3s are exemplified by cullin-Rbx E3s and

APC/C. They consist of a RING-finger-containing subunit (RBX1 or RBX2) that functions to bind E2s, a scaffold-like

cullin molecule, adaptor proteins, and a target recognizing subunit that binds substrates.

mmu03010 Ribosome

RPL13

RPLP0

RPL8

UBC

RPLP2

RPS2

KPNA2

Translation

mmu03018 RNA degradation

EXOSC9

CNOT8

WDR61

CNOT1

The correct processing, quality control and turnover of cellular RNA molecules are critical to many aspects in the

expression of genetic information. In eukaryotes, two major pathways of mRNA decay exist and both pathways are

initiated by poly(A) shortening of the mRNA. In the 5' to 3' pathway, this is followed by decapping which then permits

the 5' to 3' exonucleolytic degradation of transcripts. In the 3' to 5' pathway, the exosome, a large multisubunit complex,

plays a key role. The exosome exists in archaeal cells, too. In bacteria, endoribonuclease E, a key enzyme involved in

RNA decay and processing, organizes a protein complex called degradosome. RNase E or R interacts with the phosphate-

dependent exoribonuclease polynucleotide phosphorylase, DEAD-box helicases, and additional factors in the RNA-

degrading complex.

Page 146: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

146

GO:0004842 ubiquitin-protein

ligase activity

MIB1

UBE2D2

UBE2K

UBE2G2

UBR2

UBR1

CBLL1

FEM1A

RBBP6

UBE2E2

UBE2R2

Catalysis of the reaction: ATP + ubiquitin + protein lysine = AMP + diphosphate + protein N-ubiquityllysine.

GO:0022613 ribonucleoprotein

complex biogenesis

KRR1

EXOSC9

SURF6

RPLP0

DICER1

NPM1

FTSJ1

FTSJ3

A cellular process that results in the biosynthesis of constituent macromolecules, assembly, and arrangement of

constituent parts of a complex containing RNA and proteins. Includes the biosynthesis of the constituent RNA and protein

molecules, and those macromolecular modifications that are involved in synthesis or assembly of the ribonucleoprotein

complex.

GO:0042254 ribosome biogenesis

KRR1

EXOSC9

SURF6

RPLP0

NPM1

FTSJ1

FTSJ3

A cellular process that results in the biosynthesis of constituent macromolecules, assembly, and arrangement of

constituent parts of ribosome subunits; includes transport to the sites of protein synthesis

GO:0007017 microtubule-based

process

SS18

KIF5B

TUBA3A

CNTROB

NPM1

KIF20B

ACTR10

Any cellular process that depends upon or alters the microtubule cytoskeleton, that part of the cytoskeleton comprising

microtubules and their associated proteins.

Page 147: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

147

GO:0022402 cell cycle process

ANAPC2

TSG101

USP9X

CETN2

UBR2

EHMT2

ITGB1

RASSF1

NPM1

TBRG1

CNTROB

KIF20B

ERN2

NUP37

TXNL4A

A cellular process that is involved in the progression of biochemical and morphological phases and events that occur in a

cell during successive cell replication or nuclear replication events

GO:0007049 cell cycle

ANAPC2

TSG101

USP9X

CETN2

UBR2

CDC5L

EHMT2

ITGB1

MCM8

RASSF1

CNTROB

NPM1

TBRG1

KIF20B

ERN2

TLK1

NUP37

TXNL4A

CALM1

The progression of biochemical and morphological phases and events that occur in a cell during successive cell

replication or nuclear replication events. Canonically, the cell cycle comprises the replication and segregation of genetic

material followed by the division of the cell, but in endocycles or syncytial cells nuclear replication or nuclear division

may not be followed by cell division

Page 148: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

148

Cluster 1 de gènes sous-exprimés dans les cellules [GFP+] traitées pendant 10jours avec 100nM d’oestradiol

Catégorie Annotation Définition de l'annotation

GO:0000278 Mitotic cell cycle

Progression through the phases of the mitotic cell cycle, the most common eukaryotic cell cycle, which canonically

comprises four successive phases called G1, S, G2, and M and includes replication of the genome and the subsequent

segregation of chromosomes into daughter cells. In some variant cell cycles nuclear replication or nuclear division

may not be followed by cell division, or G1 and G2 phases may be absent

GO:0051276 Chromosome organization

A process that is carried out at the cellular level that results in the assembly, arrangement of constituent parts, or

disassembly of chromosomes, structures composed of a very long molecule of DNA and associated proteins that

carries hereditary information.

GO:0006397 mRNA processing Any process involved in the conversion of a primary mRNA transcript into one or more mature mRNA(s) prior to

translation into polypeptide

GO:0019941 Modification dependent protein

catabolic process

The chemical reactions and pathways resulting in the breakdown of a protein or peptide by hydrolysis of its peptide

bonds, initiated by the covalent modification of the target protein.

GO:0019941 Cellular macromolecular complex

assembly

The aggregation, arrangement and bonding together of a set of macromolecules to form a complex, carried out at the

cellular level

GO:0044085 Cellular component biogenesis The aggregation, arrangement and bonding together of a cellular component

GO:0051603 Proteolysis involved in cellular

protein catabolic process

The hydrolysis of a peptide bond or bonds within a protein as part of the chemical reactions and pathways resulting

in the breakdown of a protein by individual cells

GO:0070507 Regulation of microtubule

cytoskeleton organization

Any process that modulates the frequency, rate or extent of the formation, arrangement of constituent parts, or

disassembly of cytoskeletal structures comprising microtubules and their associated proteins.

GO:0031109 Microtubule polymerization or

depolymerization Assembly or disassembly of microtubules by the addition or removal of tubulin heterodimers from a microtubule

GO:0032886 Regulation of microtubule-based

process

Any process that modulates the frequency, rate or extent of any cellular process that depends upon or alters the

microtubule cytoskeleton

Page 149: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

149

Cluster 2 de gènes sur-exprimés chez les cellules [GFP+] traitées pendant 10jours avec 100nM d’oestradiol

Catégorie Annotation Définition de l'annotation

Go:0034470 Non coding RNA processing The chemical reactions and pathways involving non-coding RNA transcripts (ncRNAs).

Go:0042254 Ribosome biogenesis A cellular process that results in the biosynthesis of constituent macromolecules, assembly, and arrangement of

constituent parts of ribosome subunits; includes transport to the sites of protein synthesis.

Go:0006519 Cellular amino acid and derivative

metabolic process

The chemical reactions and pathways involving amino acids, carboxylic acids containing one or more amino groups,

as carried out by individual cells.

GO:0006412 Translation

The cellular metabolic process in which a protein is formed, using the sequence of a mature mRNA molecule to

specify the sequence of amino acids in a polypeptide chain. Translation is mediated by the ribosome, and begins with

the formation of a ternary complex between aminoacylated initiator methionine tRNA, GTP, and initiation factor 2,

which subsequently associates with the small subunit of the ribosome and an mRNA. Translation ends with the

release of a polypeptide chain from the ribosome.

GO:0043038 Amino acid activation The modification of an amino acid to an active form, for incorporation into a peptide, protein or other macromolecule

Go:0006457 Protein folding The process of assisting in the covalent and noncovalent assembly of single chain polypeptides or multisubunit

complexes into the correct tertiary structure

Go:0005198 Structural molecule activity The action of a molecule that contributes to the structural integrity of a complex or assembly within or outside a cell

Page 150: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

150

Page 151: Caractérisation des cellules gliales olfactives associées aux

151

Sarah GELLER

Caractérisation des cellules gliales olfactives

associées aux neurones à GnRH-I : Rôle dans

le développement de ces neurones

Résumé

Chez le mammifère la fonction de reproduction est sous le contrôle des neurones hypothalamiques à GnRH-I.

Au cours du développement embryonnaire ces neurones migrent de la fosse nasale vers le cerveau. De

nombreuses études s’intéressent aux facteurs impliqués dans leur migration, mais l’influence de leur

environnement cellulaire est très peu étudiée. Nous avons émis l’hypothèse que les neurones à GnRH-I

d’origine extra-cérébrale possèdent un environnement gliale nécessaire à leur migration, connaissant le rôle de

ces cellules dans l’ontogenèse neuronale du cerveau. Nos résultats montrent que 1) les neurones à GnRH-I sont

associés à des cellules gliales au cours de leurs migrations nasale et télencéphalique 2) ces cellules gliales

sont des progéniteurs des cellules gliales olfactives engainantes qui se différencient dans les régions rostrales

au cours de la migration neuronale. 3) ces cellules expriment des gènes codant pour des facteurs impliqués

dans la migration de ces neurones. 4) le transcriptome de ces cellules gliales est perturbé en présence d’un

perturbateur endocrinien œstrogèno-mimétique, et touche des familles de gènes impliquées dans les molécules

d’adhésions cellulaires nécessaire à la migration et à la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I.

Mots clefs : neurones à GnRH-I, cellules gliales olfactives engainantes, migration, perturbateur endocrinien

Abstract

GnRH-I cells control reproduction functions in mammals. These cells are extra cerebral since they come from

the nasal pit and migrate to the forebrain during embryonic development. Numerous studies have described the

influence of different molecules on the migration of GnRH-1 neurons, however, the role of microenvironment

cells remains poorly understood. Considering the role of glial cells in the forebrain’s neuronal migration, we

had hypothesized that extra-cerebral GnRH-I neurons possess a glial environment necessary for their migration

from the nose to the brain. Our results demonstrated that 1) GnRH-I neurons are associated with glial cells

during their migration in the nasal septum and forebrain 2) These glial cells are progenitors of olfactory

ensheathing cells, and differentiated within the rostral regions during neuronal migration. 3) These cells

express genes encoding factors involved in GnRH-I neurons migration 4) Glial cells transcriptome are

disrupted with estrogen-mimicking endocrine disruptor, and affects gene families involved in cell adhesion

molecules necessary for migration and activity regulation of GnRH-I neurons

Keywords : GnRH-I neurons, glial olfactory ensheathing cells, migration, endocrine disruptor