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Complémentarités de la spectroscopie Infrarouge et Raman La spectroscopie infrarouge, moyen et proche, est largement utilisée dans l’industrie depuis des années. Plus récemment, la spectroscopie Raman a fait son apparition et rencontre un succès important car elle combine des avantages du moyen et du proche infrarouge. Si de prime abord, cette technique semble avoir le potentiel pour supplanter l’infrarouge, elle doit en réalité être considérée comme complémentaire. Le Raman est en effet caractérisé par des règles de sélection différentes et souffre par ailleurs de ses propres limitations.

Spectroscopie moyen et proche infrarouge

Si la région UV et Visible du spectre électromagnétique permet d’observer les transitions électroniques des atomes, la région infrarouge est le siège des transitions vibrationnelles des liaisons chimiques. L’infrarouge moyen couvrant la plage spectrale 2500 à 25000 nm est la zone d’apparition des transitions fondamentales. Les transitions harmoniques de ces fondamentales apparaissent dans la zone du proche infrarouge s’étendant de 700 (limites du visible) à 2500 nm (frontière de l’infrarouge moyen).

Figure 1 : techniques spectroscopique en fonction du spectre électromagnétique

Une transition fondamentale observée donc dans le moyen infrarouge correspond au passage de l’état énergétique stable de la liaison à son état énergétique vibrationnelle +1. Les harmoniques étudiées en proche infrarouge reflètent quant à elles le passage de l’état stable à des niveaux vibrationnelles supérieurs. La 1ère harmonique traduit la transition vers l’état excité +2, la 2ème harmonique vers l’état +3, ... Le proche infrarouge fait également apparaitre des bandes de combinaison, résultantes de résonances entre deux vibrations fondamentales voisines. Ces bandes sont observées dans la plage 2200 – 2500 nm du proche infrarouge à des fréquences légèrement inférieurs à la somme des deux fréquences initiales.

Figure 2 : diagramme de Jablonski et transitions vibrationnelles

La forte probabilité d’apparition des transitions fondamentales confèrent des coefficients d’absorption très importants dans l’infrarouge moyen. Pour éviter une absorption totale du faisceau, la dilution de l’échantillon avec un produit non absorbant (typiquement KBr) ou l’utilisation d’un cristal pour mesurer l’onde évanescente (technique ATR) est indispensable. Cette contrainte du moyen infrarouge impose donc un échantillonnage et limite son utilisation à des analyses au Laboratoire (contrôle qualité off-line). Les transitions harmoniques et les combinaisons ont des probabilités d’apparition beaucoup plus faibles que les fondamentales. Les faibles

coefficients d’absorption ainsi observés dans le proche infrarouge pourraient intuitivement apparaitre comme un inconvénient de cette technique mais en font en réalité un de ses avantages majeurs. En effet, les échantillons peuvent être directement mesurés en NIR sans la préparation préalable nécessaire en moyen infrarouge pour éviter une absorption totale du faisceau. Les autres avantages majeurs du NIR sont directement liés à la relation de Planck-Einstein entre l’énergie des photons et leur longueur d’onde :

𝐸 = ℎ. 𝑐𝜆⁄ .

L’énergie importante des photons en NIR autorise l’utilisation de fibres optiques pour délocaliser le point de collecte du spectromètre. Contrairement à l’infrarouge moyen, le NIR permet ainsi de s’affranchir de tout échantillonnage en immergeant une sonde de mesure directement dans le produit. Le caractère énergétique des photons leur permet par ailleurs de traverser davantage la matière. Même si la profondeur de pénétration en réflexion diffuse ne peut pas être définie précisément (car dépendante des caractéristiques physiques, optiques, morphologiques,... de chaque échantillon), elle est généralement estimée à quelques millimètres. Dans ces conditions, il devient alors possible d’enregistrer l’empreinte spectrale NIR d’une substance à travers une fine sache polymérique alors que l’infrarouge moyen conduira à la signature du polymère. Malgré ces nombreux avantages, le NIR peine parfois à s’implémenter dans l’industrie. En effet, en raison de la faible résolution des bandes d’absorption et de leur multiplicité pour un même mode de vibration, les spectres NIR sont sujets à de nombreux chevauchements. L’interprétation directe des spectres est donc impossible la plupart du temps et le recours à l’analyse multivariée devient indispensable pour extraire l’information utile. Cette approche empirique a deux effets préjudiciables : le besoin de disposer de connaissances en chimiométrie et la nécessité de disposer de bases de données d’apprentissage abondantes pour construire des modèles robustes.

Spectroscopie Raman

Le Raman est une technique de spectroscopie vibrationnelle mais ne repose pas, contrairement à l’infrarouge moyen et proche, sur l’absorbance d’un échantillon mais sur sa capacité à diffuser de manière inélastique la lumière. Lors de l’excitation par une puissante onde monochromatique (typiquement Laser), le faisceau est dans sa quasi-totalité transmis alors qu’une infime partie de la lumière est diffusée (changement de direction de propagation des photons sans se conformer aux règles classiques de l’optique géométrique). Parmi la diffusion de la lumière, on distingue 2 types de signaux. Le signal majoritaire Rayleigh représente la diffusion élastique de la lumière. Autrement dit, les photons diffusés dans toutes les directions de l’espace possèdent la même énergie (et donc la même fréquence) que les photons incidents. La diffusion inélastique, photons diffusés avec changement de fréquence, est minoritaire et correspond à l’effet Raman. Lorsque l’échantillon a absorbé une partie de l’énergie lumineuse, les photons sont alors diffusés avec une énergie moindre que celle des photons incidents et on parle alors d’effet Raman Stockes. En opposition, l’effet Raman anti-Stockes représente les photons diffusés avec plus d’énergie que ceux du Laser. Comme ce phénomène présuppose que la molécule soit dans un état énergétique excité pour céder de l’énergie aux photons, ce type de diffusion est donc le moins probable selon la loi de Maxwell-Boltzmann.

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Figure 3 : illustration de la diffusion Rayleigh et Raman et des échanges d’énergie.

Comme illustré sur la figure ci-dessus, après irradiation par le Laser, la molécule transite dans un état énergétique virtuel puis redescend très rapidement sur un niveau réel. Seules les transitions +/-1 étant observées en Raman, cette technique de spectroscopie sonde les transitions vibrationnelles fondamentales des liaisons chimiques et est donc caractérisée par une excellente résolution spectrale, supérieure même à celle de l’infrarouge moyen. Les Laser utilisés en Raman ont généralement une longueur d’onde dans l’ultraviolet, le visible ou le proche infrarouge pour émettre des photons suffisamment énergétique pour assurer le passage de la liaison à un état virtuel. A l’instar du NIR, l’utilisation de fibres optiques se prête donc parfaitement au Raman. Enfin, la diffusion Raman étant un phénomène rare (1 photon diffusé inélastiquement sur 10 millions de photons incidents), cette méthode ne s’adapte pas à l’analyse de trace. Elle est donc généralement considérée comme peu sensible même si certaines techniques d’exaltation du signal Raman existent aujourd’hui (SERS par exemple). Cette caractéristique représente une des limitations du Raman mais permet néanmoins d’analyser les échantillons purs, sans dilution préalable. La spectroscopie Raman possède donc la sélectivité de l’infrarouge moyen (résolution) et la praticité du proche infrarouge (fibre optique et mesure directe) mais compte des limitations qui lui sont propres. Sur la quasi-totalité des spectromètres Raman commercialisés, l’analyse d’échantillons hétérogènes est impossible car la faible taille du faisceau d’illumination Laser confère une faible représentativité de l’échantillon. Le système Orbital Raster Scan intégré exclusivement sur les spectromètres Mira de Metrohm permet de s’affranchir de cet inconvénient en réalisant un balayage orbital de l’échantillon pour enregistrer un spectre représentatif.

Figure 4 : illustration de la technologie ORS qui concilie résolution et représentativité.

Le Raman peut également être perturbé par les phénomènes de fluorescence. Des prétraitements de la ligne de base des spectres, comme la Piecewise linear baseline correction, permettent la plupart du temps d’extraire l’effet Raman pour assurer l’identification d’une substance. Mais si le signal d’intérêt est complètement masqué par la fluorescence, l’utilisation d’un laser à 1064 nm, comme sur le Mira M-2 de Metrohm, devient indispensable pour enregistrer une empreinte spectrale exploitable. A noter que cette alternative se fait au détriment de la sensibilité de l’instrument car la probabilité de diffusion de l’effet Raman est inversement

proportionnelle à la longueur d’onde d’excitation : 𝑃𝑑𝑖𝑓𝑓𝑢𝑠𝑖𝑜𝑛 ∝𝐼0

𝜆4⁄ .

Enfin, cette technique faisant appel à un Laser, puissante source lumineuse monochromatique, des risques d’échauffement ou de photo décomposition de l’échantillon existent. L’utilisation d’un Laser faible puissance (<100 mW) sur les Mira M-1 de Metrohm réduisent au maximum les risques de dégradation de l’échantillon. En effet, la technologie ORS, en plus d’améliorer la représentativité de l’échantillon, exalte aussi le signal car l‘intensité d’une raie Raman est proportionnelle au nombre de molécules vues par le spectromètre.

Règles de sélection en Infrarouge et Raman

La différence principale entre l’infrarouge (proche et moyen) et le Raman réside dans la nature des règles de sélection pour permettre une transition vibrationnelle. Pour que cette transition ait lieu par absorption en infrarouge, la vibration doit engendrer une variation du moment dipolaire permanent de la molécule. Ainsi, les liaisons polaires pourvues d’un fort moment dipolaire, comme O-H, N-H, C-H, ... présenteront une forte absorption dans l’infrarouge. Dans le cas de l’effet Raman, la vibration doit provoquer une variation du moment dipolaire induit de la molécule, autrement dit une modification de la polarisabilité de la molécule. Cette notion de polarisabilité représente la facilité avec laquelle le nuage électronique de la molécule peut se distordre sous l’effet d’un champ électrique appliqué. Une façon simple d’évaluer si la polarisabilité change au cours d’une vibration est d’estimer si le volume moléculaire évolue au cours de la vibration. Les liaisons covalentes, a priori plus polarisables, conduiront donc à des raies Raman intenses. Ces règles de sélection ont également une conséquence directe sur le choix de la technique adaptée en fonction du solvant rencontré. Les solutions aqueuses par exemple ne pourront pas faire l’objet de mesure en moyen infrarouge (possible en NIR sous certaines conditions) mais seront très facilement étudiées en Raman. En effet, la molécule d’eau, en raison de sa polarité extrême, entraine une absorption totale du faisceau IR alors qu’en spectroscopie Raman, elle conduit à des raies très faibles et peu nombreuses. L’infrarouge est donc sensible aux liaisons σ des groupements fonctionnels (polaires et peu polarisables) alors que la diffusion Raman représente davantage les liaisons π du squelette carboné (où les électrons peuvent se délocaliser facilement). Une vibration très active en Raman engendrera un signal faible en infrarouge et inversement. Les spectres Raman et infrarouge d'une molécule complexe représentent donc chacun une partie seulement de son histoire vibrationnelle.

Figure 5 : illustration de la symétrie d’un spectre Infrarouge (rouge) et Raman (bleu) Cette complémentarité est parfaitement illustrée pour les molécules centrosymétriques. Dans ces conditions, les vibrations symétriques seront actives en Raman mais inactives en infrarouge alors que le phénomène inverse sera observé pour les modes de vibrations asymétriques. On parle alors de règle d’exclusion mutuelle.

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Figure 6 : illustration de la règle d’exclusion mutuelle avec la molécule CO2

Conclusions

La spectroscopie infrarouge (proche et moyen) et Raman sont aujourd’hui largement utilisées dans l’industrie car elles présentent des avantages considérables en analyse de routine. Ces méthodes sont en effet considérées comme rapides (résultat analytique en moins de 30 secondes), non destructives (possibilité de conserver l’échantillon après mesure), écologiques (pas de solvant, réactif ou déchet) et économiques (cout d’une analyse faible). Le NIR et le Raman présentent d’autres avantages par rapport à l’infrarouge moyen. Ces techniques garantissent la mesure de l’échantillon tel quel sans préparation préalable, et peuvent même, dans certaines conditions, analyser une substance à travers son emballage (ce dernier optiquement transparent le cas échéant). Au regard de ces dernières caractéristiques, ces 2 méthodes apparaissent comme très attractives pour l’identification des matières premières entrantes, notamment dans le secteur pharmaceutique où les Bonnes Pratiques de Fabrication imposent aux industriels ce type de contrôle sur la totalité de leur réception. Comme le seul moyen d'examiner le comportement vibrationnel complet d'une molécule est d'étudier à la fois son spectre infrarouge (moyen ou proche) et son spectre Raman, l’idéal est de disposer de ces 2 technologies. Dans ces conditions, le proche infrarouge pourra analyser la majorité des matières entrantes car la plupart des substances délivrent une empreinte marquée dans cette plage spectrale. Les quelques matières présentant une trop faible signature dans cette région spectrale pourront alors être aisément analysées en spectroscopie Raman. C’est notamment le cas des sels ioniques polyatomiques comme le carbonate de calcium ou le sulfate de magnésium qui ont une absorbance trop faible en NIR pour générer un spectre exploitable. S’il n’est pas envisageable de s’équiper de ces deux technologies, le choix de l’instrument devra se faire en fonction de la nature des échantillons à analyser, du mode d’utilisation en routine de l’instrument, des applications envisagées, ... en gardant toujours à l’esprit les propriétés propres à chaque technique de spectroscopie :

Tableau 1 : comparaison du moyen infrarouge, du proche infrarouge et du Raman

A noter enfin que si le Raman possède une haute sélectivité comme l’infrarouge moyen et ne nécessite en théorie qu’un spectre pour le calcul de similarité (r² ou HQI), la SFSTP préconise néanmoins d’appliquer la même méthodologie que le proche infrarouge pour la construction des librairies. Dans le cadre de l’implémentation en routine d’une méthode d’identification par Raman, cette commission recommande en effet d’utiliser plusieurs lots pour la bibliothèque d’apprentissage. Pour chacun d’entre eux, plusieurs prélèvements pourront être réalisés (différents containers de préférence) et plusieurs spectres enregistrés pour chaque prélèvement. La bibliothèque de validation devra bien sûr contenir des échantillons indépendants (nouveaux lots) mais aussi des échantillons négatifs (substances non inclues dans la bibliothèque). Si les préconisations de la SFTSP sont respectées, le temps d’implémentation d’une méthode d’identification par Raman est alors comparable au NIR car il dépend avant tout de la fréquence de réception des matières entrantes.

Mathieu Jourdain Spectroscopy Product Manager

Metrohm France