Contribution à l'étude de l'acide ribonucléique de la levure

Bull. SOC. Chim. Belg., 55, pp. 5-37, 14 fig., 1946

Contribution ii 1’Btude de l’acide Tibonuclkique de la levure

par

H. CHANTRENNE (LiPge), aspirant F. N. R. S.

R%sud. - Dans la prenii&re parlie de ce travail, nous montrons qu’il est possible d’isoler d’une prBparation d’acide nuclhique de la levure, une fraction A qui prkipite dans des conditions parfaitement reproductibles. Les preparations commerciales contiennent cet acide A en proportions trBs variables.

L’6tude Blectrophorbtique d’une pr6paration de nucleate A a mon- tr6 qu’elle contenait plus de 91 % d’une substance bien definie et parfaitement seperable par BJectrophorBse. I

L’electrotitration du nucleate. A, de la partie soluble B et d’un nucleate commercial a fourni les resultats suivants :

L’acide A contient des fonctions rdpondant aux pK suivants : 3,7 - 4,2 - 6,2 - 8,6 - 10,l - 10,2. I1 se distingue donc de l’acide B par la pr6- sence d’une fonction suppldmentaire de pK 8,6 et u n petit dhplacement de la fonction dont le pK est voisin de 6. De plus il est possible qu’il ne posshde pas la fonction dont le pK est voisin de 2,3.

Le produit B posshde dans la region BtudiBe, des fonctions ionisables dont les pK sont voisins de 2,3 - 3,7 - 4,2 - 6,O - 10,l - 10,2.

I1 possede une fonction correspondant ?i chacun des dits pK par quatre atomes de phosphore. La courbe de titration est conforme B la courbe thborique de Levene dans toute la region Btudike, soit de pH 2,6 A pH 10’0.

L’acide commercial de Boehringer qui est un melange des acides A et B fournit une courbe de titration intermediaire.

Par I’Btude electrotitrimetrique de I’acide nuclCique dhsamind, nous mans montrh que lea regions d’ionisation des fonctions NH, sont bien celles qu’,admet Levene : leurs pK se situent donc entre 2,3 et 4,2. L’Btude de I’acide nucleique dhsamine nous a permis en outre de montrer que les conclusions que Allen et Eiler, Makino, Bredereck tirent des resultats de Ieurs dosages acidimktriques sont errondes et nous avons remis en question le problBme du nombre des fonctions acide phosphorique primaire de l’acide nucleique. La formule cyclique de Takahashi-Makino perd ainsi les principaux de ses fondements exphimentaux.

6 A. CHANTRENNE

Isolement, purification et titration de I’acide ribonuclhique (’)

I. INTRODUCTION

Les acides nucleiques sont des substances naturelles com- munes Zi tous les Qtres vivants. On peut les isoler sous la forme d’une poudre blanchltre amorphe insoluble dans les solvants organiques. 11s consistent en une combinaison d’acide ortho- phosphorique, d’un sucre & 5 carbones et d’hbtbrocycliques appartenant aux groupes des purines (adbnine, guanine) et des pyrimidines (cytosine, uracile, thymine) .

On distingue deux classes d’acides nuclbiques d’aprBs la nature de leur constituant glucidique :

Les acides dksoxyribonuclkiques contiennent du d-d6soxy- ribose, ils sont localises dans les noyaux cellulaires et ils ont pour type l’acide thymonucl6ique, qu’on extrait du thymus de veau ; les acides ribonuclkiques contiennent au contraire du d-ribose ; ils se trouvent, essentiellement dans le cytoplasme de toutes les cellules (‘. ’).

Depuis quelques annbes, les acides ribonuclbiques retien- nent l’attention des biologistes car on a des raisons de penser qu’ils interviennent de quelque fagon dans l’bdification des pro- tbines par les &re vivants (’* ’).

L’analyse de leur fonction physiologique se heurte mal- heureusement & l’insuffisance des connaissances actuelles de leurs propribtea physico-chimiques et de la structure de leurs mol6cules.

L’btude que nous prbsentons est le point de depart d’une skrie de recherches entreprises au laboratoire de chimie de l’Universit6 de LiBge, et qui sont consacrdes & l’btude des propribtbs physico-chimiques de l’acide nuclhique de la levure ou acide zymonuclbique, qui est le type des acides ribonuclbiques.

La structure chimique de l’acide zymonuclhique reste tr&s imparfaitement connue, en dbpit des nombreux travaux qui furent consacrbs & son btude. Lorsque Levene (‘) Btablit que

( l ) Dans la redaction de ce memoire, nous n’avons pu tenir compte que d’un seul travail paru pendant la guerre dans les periodiques anglo- Saxons, celui de Allen et Eiler.

(’) J. BRA=, Archives de biologic, 53, 207 (1941). (*) CABPERWON, LANDSTR~M-HYDFA et AQUILONIIJS, Chromosoma, B 2,

(9 LEVENE, Biochern. Z., 47, 120 (1909). 111 (1941).

ACIDE RIBONUCLBIQUE DE LA LEVURE 7

l’acide nucl6ique est form6 par l’union de quatre nuclCotides en proportions BquimolBculaires, le problkme de sa structure fut ramen6 A celui du mode de liaison des quatre nuclBotides entre eux; tous les travaux consacrBs depuis lors B l’acide nucl6ique par Levene, Thannhauser, Jones, Bredereck, Taka- hashi, Makino, Galland, F.-G. Fischer et leurs collaborateurs, sont autant de tentatives plus ou* moins fructueuses de rbsolu- tion de ce probkme. Les conclusions auxquelles parvinrent ces chercheurs furent souvent contradictoires. De l’examen atten- tif des rBsultats expdrimentaux qu’ils ont accumul6s, il res- sort (’) qu’on peut consid6rer comme bien Btablis les faits suivants : l’acide zymonucl6ique est form6 par la combinaison de quatre mononucl6otides en proportions BquimoMcu- laires; la rupture de la molQule en mononuclBotides s’ac- compagne de l’apparition de quatre fonctions acides ; une sur quatre des liaisons auxquelles participe l’acide phosphorique se comporte differemment des autres.

On ne posshde actuellement du poids mol6culaire de l’acide nucleique aucune valeur certaine : les chiffres proposBs se situent entre 1.300 (‘) et 17.000 (*). Nous montrerons d’ail- leurs dam une publication ultbrieure qu’ils sont d6pourvus de signification.

OH I

I I O=P-Ri bosc- Adthine

OH 0 I

0=P-Ribose-Uracile I I

OH 0 I I 1

OH 0 I

I

O=P-Ribose-Guanine

O=P-Ri bose-Cytosine

OH

FIG. 1. - Formule de structure de Levene.

(I) H. CHAWTRENNE, thkse, Liege (1946). (’) MYRBACK et JORPES, 2. Physiol. Chem., 237, 169 (1936). ( 8 ) LORING, J . B . C., 130, 251 (1939).

8 H. CHANTRENNE

On ne doit donc considerer les formules de structure pro- pos6es par Levene (’) (fig. 1) ou par Takahashi (’) (fig. 2) -

OH I

Cytosine --Ribose-- 0-P-0- Ribose-Adenine I 0

I 0

II 0

I O=P-OH

I HO-P=O

I 0 0

i 0

I II I I

G uanine-Ribose-0-P-0-Hi bose- Uracile

OH FIG. 2. - Formule de structure de Takahashi.

pour ne citer que les plus classiques - que comme des repre- sentations approch6es et provisoires. Elles n’en r6sument pas moins un ensemble remarquable d’acquisitions precieuses.

* * * A la lecture de tous les travaux consacres & 1’6tude de la

structure de l’acide nucleique, nous avons 6th frappe par le fait qu’aucun effort n’a 6t6 fait dans le but d’obtenir une substance homogene & proprietes definies, formhe d’une seule esphce mol6culaire.

Or, l’acide nucleique s’extrait de la levure en milieu fortement alcalin et on sait que le s6jour prolong6 de l’acide nuclbique dans un tel milieu, conduit & son hydrolyse en nucleotides (ou nucldosides). On a donc des raisons de craindre - comme le firent remarquer trks justement Johnson et Har- kina (*) et plus tard Fischer (’) - que l’acide nucleique ne soit dej& partiellement degrade au cours de l’extraction.

I1 apparatt donc comme tres probable que les Bchantillons d’acide nucleique dtudiBs jusqu’ici n’etaient pas des substances pures, mais plutbt des melanges contenant des produits d6jh plus ou moins hydrolyshs ; il eat certain aussi que les Bchantil-

( l ) LEVENE, J. B. C., 48, 119 (1921). p) TAXAHASHI, J. Biochem., i6, 463 (1932). (”) JOHNSON et HARKINS, J . A . C. S., Ui, 1779 (1929). (’) F.-G. FIBCHW, Natunuissenschaften, 30, 377 (1942).


lons htudihs par les differents chercheurs n’avaient pas des proprihtes iden tiques.

Notre premier but fut de combler cette lacune ; nous nous sommes efforce d’isoler un acide nucl6ique aussi peu degrade que possible et form6 essentiellement d’une seule espece mole- culaire proprihtes physiques bien ddfinies.

11. Isolement d’un acide nucl6ique d6fini

L’acide nucl6ique fut extrait de la levure selon la methode de Johnson et Harkins (I) dont nous avons leghrement modifih la technique (voir partie exp6rimentale) . Cette mBthode fut choisie parce qu’elle semblait la plus apte A fournir un acide nucleique peu dCgrad6, et parce que l’extraction alcaline s’y deroule dans des conditions faciles A reproduire.

Le produit ainsi obtenu est exempt de substances pro- teiques (&action du biuret nCgattve, m6me dans des solutions concentrdes du produit) .

Pour determiner la conlposition physique de l’acide nuclhique ainsi obtenu,’nous avons htudie sa solubilith par la methode des diagrammes de solubilit6 de Kunitz et North- rop (’). L’emploi de ces diagrammes permet en effet, dans les cas favorables, de denombrer les constituants d’un melange, le pourcentage respectif de chaque composant, et de determiner les conditions les meilleures d’isolement de chacun d’eux. La methode de Kunitz et Northrop a permis de fractionner des melanges complexes de prothines et d’obtenir les differents individus chimiques qui les composent dans un &at de grande puretb (’) .

Les quantites d’acide nuclhique mis en suspension au cours d’une experience de solubilite et les quantites de cet acide passant en solution sont determinees par dosage colorime- trique du phosphore.

Aprh diverses tentatives, nous avons adopt6 comme $01- vant I’acide acetique a 50 p. 100. Dans ce milieu, la separation des deux phases est parfaite. Au contraire, en presence d’acides forts (HCI, S04H2, acide trichlorac6tique), ou & des concen-

( I ) JOHNSON et HARKINS, J . A . C. S., 51, 1779 (1929). (a) KUNITZ et NORTHROP, Cold Spring Harbor Symposia on Quantita-

tive Biology, 6 , 526 (1938). (a) K U N ~ et NORTBROP, Cold Spring Harbor Symposia on Quantita-

tive Biology, 6 , 625 (1938); - HEIIRIM, DESREUX, NORTEROP, J . Gen. PhysioI., %, 213 (1940).

10 H. CHANTRENNE

trations d’acide achtique inf6rieures B 50 p. 100, on obtient des suspensions colloi3dales stables ; 1’6tude de la solubilit6 des nucl6ates peu solubles (Ba, La, Pb, Mg) se prdsentait ma1 : la reproductibilitd des rdsultats n’htait pas satisfaisante. dr P &at.

I

I ‘ I I I I

I I

. 4 D W

FIG. 3. - Courbe de solubilit6 d’acide nucl6ique non purifi6. Abscisses : quantit6 d’acide nucl6ique par cms de suspension. Ordonnbes : quantitb d’acide nucl6ique par cms de filtrat.

Pourcentage de la fraction soluble : a b

Le graphique 3 obtenu pour un echantillon d’acide nucleique extrait de la levure de la fagon indiquee, montre que cet Bchantillon contenait une substance trhs peu soluble dans l’acide achtique B 50 p. 100, et qui repr6sente un peu moins de la moitih de la quaatit6 totale du produit 6tudiB. C’est la m6me substance qui prBcipite d8s les plus faibles concentrations, et jusqu’aux concentrations les plus BlevBes que nous ayons essaydes (6 %).

Appelons A la fraction tr8s peu soluble dans l’acide acetique B 50 p. 100, et B, la fraction soluble.

L’examen des rdsultats que nous avons obtenus (cf. partie experimentale) montre que la solubilit6 de la fraction A est de I’ordre de 30 milligrammes par. litre, celle de B est sup& rieure & 30 grammes par litre. La solubilit6 de B est donc plus de 1.000 fois superieure B celle de A dans le m6me solvant.

L’isolement des deux fractions promettait d’&tre trhs facile. Cependant, par fractionnements rhp6t6s dans l’acide acdtique


50 p. 100, il est impossible d’obtenir un produit contenant plus de 90 % de la fraction A peu soluble. I1 s’avhre, en effet, que cetbe fraction se transforme assez rapidement en substances solubles lorsqu’elle reste au contact d’acide ac6tique 50 p. 100.

Nous avons r6ussi B isoler trhs commod6ment un produit contenant plus de 99 % de la fraction peu soluble, en adoptant un autre solvant : un melange form6 d’un volume d’acdtone, deux volumes d’acide acBtique glacial et sept volumes d’eau. La solubilit6 des deux fractions A et B dans ce milieu, est sensiblement la m&me que dans l’acide ac6tique B 50 p. 100.

l i . F Y W * .

/ /

/ /

/

I

... &&. I” I..

FIG. 4. - Courbes de solubilitk d’hchantillons purifies d’acide nucl6iquc.

Le diagramme 4 (petites Btoiles) qui montre que plus des 99 % de la substance isol6e sont insolubles dans les conditions expbrimentales adoptees ne permet cependant pas d’af- firmer que cette substance soit form6e d’une seule esphce moldculaire : la solubilit6 trhs faible rend impossible 1’6tude de la partie infkrieure du diagramme, et on ne peut pas rejeter h priori I’id6e que le produit 6tudi6 pourrait &re form6 de plusieurs substances trbs peu solubles. Nous nous sommes efforcB de r6aliser des conditions de solubilit6 plus grande de la fraction A. Nous avons essay6 la pr6cipitation B 1’6tat de nucl6ates de divers m6taux (Ba, Pb, La, Mg), la pr6cipitation physique de nucleate de sodium par des sels neutres (chlorure. de sodium, sulfate d’ammonium) , la prbcipitation par divers melanges acides ou neutres contenant des solvants organiques miscibles 5 l’eau. Dans tous les cas, la solubilite de la fraction A Btait trhs faible (de l’ordre de 30 mg/litre) ou bien au contraire presque illimit6e; dans aucun cas, elle n’avait une valeur moyenne.

Soulignons ici que la grande diffdrence de solubilit6 des deux fractions A et B qui a BtB rapporthe plus haut et le carac- t6re de (( tout ou rien )) de la solubilit6 de la fraction A, indique que A pourrait &re un polynuc16otide B degre de polymerisa- tion 6lev6.

12 H. CHAhTRENNE

En effet, Husemann, Pliitze et Schulz ont fait remarquer ( l )

que la solubilitb d’un polymere est ou bien tres faible ou bien presque illimitde, selon que le monomere est moyennement soluble uu peu soluble. Le calcul de 1’Cnergie de dissolution montre que dans une sdrie de polymhres homologues, la solubilitb dans un solvant donnC est une fonction exponentielle du coefficient de polymdrisation. Cette relation a bt6 v6rifiCe notamment pour une sbrie de polystyroles & degrbs de polym6ri- sation divers.

On congoit que la rbalisation de conditions de solubilitb moyenne pour un polymere &lev6 soit rendue tres difficile, si de faibles variations de la solubilitd du monomhre entrafnent des variations trhs importantes de celle du polymere, qui passe ainsi sans transition d’une valeur extrbme & l’autre.

Ce caractere particulier de la solubilith de la fraction A emp&che de pousser plus avant 1’6tude de son degrC de puret6 par l’emploi des diagrammes de Kunitz et Northrop.

111. Etude 6lectrophor6tique de la fraction A

L’appnreil utilise (’) est muni du dispositif optique de Svensson (’). Le diagramme fourni par l’appureil est tel qu’h chaque constituant sbparC correspond une courbe en cloche

d n d c qui rend compte de la variation de la dCriv6e - et donc - tlx dx en fonction de 2 , la hauteur dam la cellule d’blectrophorhse,

FIG. 6. - Diagramme d’6lectrophor&se.

( l ) HUBEMANN, PL~TZE et SCHULZ, Naturwissenschajten, 29, 306 (1941). (’) L’tllectrophorhse a 6th effectu6e B la Fondation Reine Elisabeth &

h i d e de l’appareil realis6 par M. Maurice Errera, qui a bien voulu effectuer lui-m6me la plupart des manipulations. Nous sommes heureux de pouvoir lui presenter ici nos plus vifs remerciements.

(a) SVENWN, Kollotd Z., 87, 181 (1939).

ACIDE RIBONUCLEIQUE DE LA LEVURE 13

n &ant l’indice de refraction de la solution et c la concentration en substance dissoute. I1 s’ensuit que la surface delimitee par celle-ci est proportionnelle & la concentration de la subs- lance correspondante et & son indice de r6fraction spkcifique.

Un Bchantillon de la fraction A sous forme de sel de Na, et contenant environ 97 % de produit peu soluble dans le mB- lange acide acktique-acktone-eaa d6fini plus ha@, a fourni le diagramme de la figure 5.

La premiere courbe correspond & la (( bande de sels )) qui est due une repartition inkgale des petits ions dans la solution ; elle se manifeste dans toutes les experiences d’electro- phorhse, et n’a pas de signification particpliere. La seconde courbe rkvhle la pr6sence d’une impurete qui reprksente 6 & 7 % de la quantite totale de substance pr6sente. Le sommet principal correspond a un composant qui represente environ 92 % du produit total. Le (patribme est peut-&tre une trace d’une impuret6.

L’electrophorbse montre donc que la fraction A isolee, comme nous l’avons indiqu6, par prhipitations rBpet6ea dans un melange acide ac6tique-acetone-eau, est formee pour 92 %

FIG. 6. - Courhes de solubilitb d’acide nuclkique : 1. Mcrck;

11. Bochringer; 111. Echantillon obtenu par la m6thode de Johnson et Harkins; IV. Acide nucleique A.

24 H. CHANTRENNE

environ d’une substance qui se comporte dans un champ Blectrique comme un corps pur que nous appellerons d6sor- mais clcide nucl t ique A.

L’isolement d’un acide nucleique form6 pour 92 % d’une substance dBfinie constitue, croyons-nous, un important pro- grhs. En effet, les pr6parations commerciales qui ont servi & toutes les 6tudes chimiques et physico-chimiques de l’acide nuclhique entreprises jusqu’ici, manifestaient des propriBtBs physiques trhs variables.

Le diagramme de solubilit6 (fig. 6) Ctabli pour un acide nucl6ique de Merck (I), de Boehringer (11) et pour un Cchan- tillon obtenu par. la mBthode de Johfison et Harkins (111) montre que ces produits contenaient notamment des proportions trhs differentes d’acide nuclBique A (’) .

IV. Etude 6ectrotitrimCtrique de Pacide A

De toutes les tentative8 faites dans le but de determiner-le mode de liaison des nucl6otides dam l’acide nuclhique, la plus ClBgante et la plus fructueuse fut sans doute celle de Levene, qui Btudia la courbe de titration de l’acide nucl6ique. I1 par- vint ainsi, sinon h Btablir de fagon certaine la formule classique qui porte son nom, du moins & montrer qu’elle est com- patible avec les faits experimentaux connus & 1’6poque. I1 put aussi Bliminer dkfinitivement une s6rie d ’autres formules que ses r6sultats mettaient en contradiction avec les donnBes de l’exp6rience.

L’analyse directe de la courbe de titration d’un Clectrolyte polyvalent est fort compliqu6e et devient impraticable lorsque 1’6lectrolyte posshde des fonctions nombreuses & pK trks voisins ; l’acide nucldique, comme les prot6ines, est dans ce cas. Nous avons donc adopt6 la m6thode de comparaison pr6conisBe par Simms et Levene qui a d6jja rendu de grands services mais qui ne peut &re utilishe qu’avec beaucoup de prudence.

Cette m6thode consiste & dresser la courbe thBorique correspondant ?i la composition prBsum6e de la substance BtudiBe

(l) La solution d’acide nuclkique partiellement dBgrad6 ne se comporte Bvidemment pas comme une solution idbale. I1 s’ensuit que la solubilitB de chaque composant est influencBe par la presence des autres composants et que les valeurs de solubilite de la fraction peu soluble, obtenues par extrapolation jusqu’i l’ordonn6e, des courbea I, II et III ne concordent pas exactement avec celle obtenue pour notre acide nu- clBique purifi6.


et Zi y comparer la courbe exphimentale. Si les courbes ne coi’ncident pas, on soustrait l’une de l’autre, et pour chaque pH, les ordonnkes des deux courbes, et on definit a i d une (( courbe de comparaison )) plus simple qui traduit les diff6- rences qui existent entre la substance Btudihe et la structure qu’on lui attribue.

Dans le cas de l’acide nucl6ique de la levure, ce travail est ais6, car Levene (’) a fourni les pK (pH de demi-titration) des diffkrentes fonctions ionisables qu’on peut s’attendre Zi ren- contrer dans l’acide nuclkique. Ces valeurs sont basks sup des mesures effectuhes sur les nucleotides isol6s.

Nous les reproduisons ci-dessous :

Groupes PK 1“ groupe phosphorique primaire 1

1 2 ” - - - 2 3e - 2 4 “ - - -

Groupes amine aromatique :

- -

Guanine 233 Adenine 397 Cytosine 492

Groupe phosphorique secondaire 6,O

Groupes OH aromatiques : Guanine 10,l Uracile 10,2

Nous avons construit la courbe thdorique correspondant Zi la formule de Levene, en admettant ces valeurs. C’est la courbe continue t rade sur les graphiques (fig. 7 et suiv.).

Pour construire cette courbe, il suffit de tracer la courbe de titration d’un acide monobasique pour chacune des valeurs de pK du tableau ci-dessus, puis d’additionner pour chaque pH les ordonnees correspondantes de toutes les courbes ; leur somme dBfinit l’ordonnde correspondante de la courbe de titration thCorique de 1’6lectrolyte complexe. La courbe de titration d’un acide monobasique a pour Bquation :

a &ant le degr6 d’ionisation.

( I ) LEVENE et SIMMS, J . B . C., 70, 327 (1926).

16 H . CHANTRENNE

Nous avons determine la courbe de titration de I’acide nucl6ique A dans le domaine de stabilit6, c’est-&-dire de pH 2,5 ZI pH 10 (fig. 7, petits triangles).

Les diagrammes expriment la quantitb de base fixbe par l’acide nucleique en fonction du pH. Nous comptons les quantit& d’acide fix6 comme quantitbs negatives de base.

La quantitb de base fix6e est calcul6e selon Simms et Levene :

b’= b + H - OH

h =pant i t6 de base forte ajout6e H =quantit6 d’ions Hf dans la solution OH=quantitb d’ions OH- dans la solution

H et OH peuvent Qtre assimil6s aux activit6s de ces ions pour les pH auxquels nous avons effectu6 les mesures (de 2,6 & 10).

Nous avons exprim6 la quantit6 de base fixbe en mol6cule- grammes par 4 atomegrammes de phosphore. Les r6sultats sont ainsi rapport& au t6tranuclCotide, selon* I’habitude adop- tbe depuis Levene.

La courbe de comparaison C I traduit les differences qui existent entre la courbe experimentale et la courbe th6orique de Levene (courbe en trait plein) (’). Elle montre que I’acide nuclbique A contient par tbtranucl6otide une fonction ionisable qui n’est pas prkvue par la formule de Levene ; le pK de cette fonction est voisin de €46. En effet la courbe t rach en pointillb est celle d’une substance qui contiendrait en plus des fonctions prkvues par Levene, un groupe ionisable de pK = 8,6, et dans laquelle la fonction de pK = 6,O serait $em- placbe par une fonction de pB=6,2. La courbe de compnrai- son C I1 montre que l’acide nucl6ique A suit parfaitement cette nouvelle courbe thdorique, de pH 4,5 ZI pH 10.

Entre pH 2,5 et pH 43, on constate un h a r t entre les deux courbes, qui indiquerait l’absence dans I’acide A d’une fonction. dont le pK serait situ6 vers 2,5, et qui pourrait Qtre le groupe NH, de la guanine pour lequel Levene prbvoit pK=2,3.

Nous n’avanpons cette dernihre conclusion qu’avec rhserves

( I ) Remarque. - L’examen des courbes montre qu’A pH 2,5 c o m e A pH 10, l’ionisation est partielle : nous n’atteignons pas encore les paliers de fin de titration. I1 en rCsulte que nous ne pouvons donner pour les quantitbs de base fixCe, que des valeurs dCfinies h un terme prbs; la position des courbes le long de l’axe des ordonnkes est donc arbitraire; cell6 des courbes de comparaison Bgalement. Mais leur forme est correcte et c’est elle qui importe.

ACIDE RIBONUCLEIQUE DE LA LEWRE

I I

I

. I I

. I ,

17

4

P

1

a

-1

- 4

I 1 1 1 1 1 J 4 5 6 1 8 9 f O i

PH FIG. 7. - Courbe de titration de I’acide nucleique A .

18 H. CHANTRENNE

car la branche de la courbe CII sur l’allure de laquelle elle est basde, est trop courte pour qu’on puisse dmettre un juge- ment ddfinitif.

Ces rksultats permettent donc de croire que les groupes de l’acide A qui s’ionisent entre pH 2,5 et pH 10 ont des pK voisins de 3’7 - 4’2 - 6,2 - 8’6 - 10,l - 10,2 ( l ) .

L’acide nucldique A contient un dquivalent de chacun de ces groupes ionisables, par 4 atomes de phosphore. Deux autres Gchontillons d’acide A ont fourni des courbes identiques.

ACIDF. KUCLBIQUE B

L’acide B (voir p. 10) est la fraction soluble dans l’acide acktique 2i 50 p. 100. La courbe d’dlectrotitration (fig. 8) de cet acide coincide presque parfaitement, de pH 2,6 h pH 10,

4

4 -

3 -

1 -

9 -

FIQ. 8. - Courbe de titration de la fraction B

( l ) Voir LEVENE et SIMMS, J . B . C., 70, 827 (1926).

ACIDE RIBONUCLEIQUE DE LA LEVURE 19

avec la courbe theorique de Levene. Les pK des fonctions qui s’ionisent dans cette r6gion de pH sont donc voisins de 2,3 - 3,7 - 4,2 - 6,O - 10,l - 10,2.

ACIDE NUCLBIQUE COMMERCIAL

(Boehringer)

La courbe de titration de l’acide nucleique Boehringer (fig.-9) s’Ccarle de la courbe thborique de Levene, mais dans

e

FIG. 9. - Courbe de titration de I’acide Boehringer.

20 I€. CIIANTRENNE

une moins large mesure que celle de l’acide A. L’Ccart se manifeste aussi vers pH 8,6 et en dessous de pH 4. On pouvait s’attendre B un tel rksultat puisque l’acide Boehringer est un m6- lange de A et B. REMARQUES

Les courbes de titrations n’ont 6th d6terminCes qu’entre pH 2,5 et pH 10. Levene et Simms ( l ) et Allen et Eiler (’) qvi ont utilis6 la meme methode ont explor6 une r6,‘ *ion encore moins &endue de 1’6chelle des pH. On ne pourrait guhre 6lar- gir le domaine de pH 6tudi6 au delB des limites que nous avons choisies, car l’acide nucl6ique s’hydrolyse rapidement en milieu trop basique ou trop acide. Cette limitation nous prive de tout renseignement en ce qui concerne les fonctions qui s’ionisent aux pH extrhmes, comme par exemple les groupes acid? phosphorique primaire.

Insistons aussi sur le fait que rien ne distingue une region de la courbe de titration qui correspond B une fonction basique d’une region qui correspond B une fonction acide. Pour n’en avoir pas tenu compte, plusieurs chercheurs ont tire de leurs exphriences des conclusions que nous croyons errondes. Dans plusieurs travaux recents de Bredereck (’) , dans ceux de Makino (”), dans celui d’Allen et Eiler (’), on lit que l’acide nucldique est un acide tetrabasique, car la titration B la ph6- nolphtalhine absorbe 4 6quivalents de NaOH par t6tranuclCo- tide. Cette conclusion les m h e A conclure en faveur de la formule cyclique de Takahashi selon laquelle l’acide nucl6ique posshderait 4 fonctions acides par tdtranucl6otide.

L’acide nuclkique que ces chercheurs gtudient, commu- nique B l’eau un pH voisin de 2,5 ; la phCnolphtal6ine vire vers pH 8,5. En r6alit6, la titration d’acide nucldique en pr6- sence de ph6nolphtal6ine indique donc le nombre d’6quiva- lents de soude fixes par l’acide nucl6ique entre pH 23 et pH 8,5 environ. Or, d’aprbs les donndes de Levene et Simms (’) quand on fait passer une solution d’acide nucl6ique de pH 2,5 A pH 8,5, on libhe de leur chlorhydrate un peu plus de 2,5 6quivalents de fonctions NH2, on neutralise un Bquivalent d’acide phosphorique secondaire et environ 114 d’6quivalent

(I) LEVME et SIMMB, J. B . C . , 70, 327 (1926). (*) ALLEN et EILER, J. B. C . , 137, 757 (1941). (*) BREDERECK, BERCER et RICHTW, Ber. , 74, %?8 (1941). (‘) MAHINO, Z. physiol . Chern. , 232, 229 (1935) et a38, 201 (1935).

(‘1 LEV- et SIHNB, J . B . C. , 65, 619 (1926) et 70, 327 (1926). ALLEN et EILER, J . B . C . , 137, 767 (1941).


des groupes phknoliques des h6tCrocycliques ; pour dCplacer le pH de 2,5 B 8,5, il faut donc ajouter pr8s de 4 6quivalents de soude par t&ranuclCotide, rnais ces quatre e‘quivaleizts d e soude ne sont pas fish par les groupes acide phosphorique primaire. I1 est donc tout g fait erron6 de conclure de tels rCsul- tats de titration B la phCnolphtalCine, que l’acide nucldique posdderait 4 fractions acides.

Vu l’importance de cette remarque en ce qui concerne la validit6 de la formule cyclique de Takahashi, nous avons tenu ?I Bprouver experimentalement notre interprktation. Nous avons cherche 5 repCrer dans la courbe de titration, les regions qui

a A

1 5 4 5 6 ? 8 9 40

FIG. 10. I. Courbe de titration de l’acide nucleique selon

11. Courbe de titration thkorique de l’acide nuclhique

A Points expbrimentaux obtenus l’aide d’un acide

Levene.

complhtement d6samin8.

nuclCique particllement dbsamin6.

22 H. CHANTRENNE

correspandent aux groupes NH,. Nous avons determine la courbe de titration d’acide nucleique prhlablement soumis l’action de I’acide nitreux ?t 25”. Dans ces conditions les groupes NH, disparaissent et font place ?t des groupes OH.

La figure 10 montre nettement que la region de la courbe qui a Btd modifike dans ces conditions, est bien celle qui, d’apres Levene et Simms (’) , correspond aux groupes NH, (’) . (La desamination n’est pas complete: on sait que les purines se desaminent difficilement et il n’6tait pas indiqu6 de prolon- ger trop le sejour de l‘acide nucl6ique en milieu acide, puisqu’il s’y hydrolyse peu A peu.)

Ce resultat nous permet de souligner I’erreur d’interprd- tation commise par ’Makino, Bredereck, Allen et Eiler. I1 eat Bvident que la conclusion qui en resultait et qui plaidait en faveur de la formule cyclique de Takahashi doit &re rejetbe. Cette formule perd ainsi l’un de ses principaux appuis exphri- mentaux. Rappelons qu’elle est en contradiction avec les courbes de titration que nous obtenons puisqu’elle ne prevoit pas le groupe phosphorique secondaire que l’exphrience met en evidence.

On ne peut pas admettre non plus sans restriction la formule classique de Levene qui ne permet pas d’expliquer l’existence de la fonction de pK 8,6 ; de plus nous ne croyons pas que l’existence des quatre fonctions acide phosphorique primaire soit prouvke. Enfin il est Bgalement dtabli que le mate- riel experimental utilise par les ehercheurs &hit de 1:acide nucleique fortement ddgradd. I1 n’est donc pas btonnant que le poi& moldculaire de l’acide nuclhique reste inconnu et il se pourrait que Ie tetranucleotide ne soit qu’un motif qui se r6pBte de nombreuses fois dans la moMcule proprement dite.

Nous avons entrepris 1’6tude de l’action de la ribonucldase sur l’acide nucl6ique purifie ainsi que celle de plusieurs pro- pri6tes physico-chimiques de cette moldcule afin de prdciser 8a charge, sa forme et son poids mol6culaire.

* * *

- (l) LEVENE et SIMMS, J. B . C., 85, 519 (1925) et 70, 327 (1926). (’) Pour la position de la courbe le long de l’axe des ordonndcs,

voir la remarque, page 16.


TECHNIQUES ET RBSULTATS EXPI~RIMENTAUX

Isolement de l’acide nuclhique

On met en suspension dans 2 litres d’eau, 500 grammes de levure d e boulangerie, et on refroidit ti 0 degr6. On y ajoute une solution de 100 grammes de NaOH dans 300 cniJ d’eau Bgalement refroidie ti 0 degr6. On amhne le volume du melange iI.3 litres, en ajoutant de l’eau glade, et on l’abandonne iI 0 degrd pendant 1 heure 1/2. On abaisse alors le pH jusque 6,5 (papier de tournesol acide) par addition d’acide acetique. On filtre sur matibre filtrante u Tonsil n. Au liquide clair obtcnu, on ajoute assez d’alcool pour obtenir une solution contenant 4 % d’alcool. On filtre alors sur filtre Seitz (( Kllrschichte no 5 I). Le filtrat est clair, jaune et manifeste une 16g&re fluorescence verdltre. On ajoute HCl con- centre jusqu’ti ce que le liquide soit nettement wide au papier rouge Congo; puis lentement et en agitant on ajoute 4/5 volume d’alcool iI 94 p. 100. I1 se forme aussit6t un prdcipit6 blanc qui flocule trhs bien. On laisse reposer une demi-heure, on decante la majeure partie du liquide, piiis on centrifuge. On lave le prCcipil6 sur la centrifugeuse : 2 fois ti l’alcool, 3 fois ti 1’8ther et on sbche dans le vide sur acide sul- furique. On obtient ainsi une poudre hlanche ires lCgbre qui est l’acide nucleiquc brut.

Rendernent : 6 grammes de produit brut.

PURIFICATION

On met en suspension dans 1 litre d’eau, 15 grammes d’acide nuclhique, brut, finement pulv6risk; par addition prudente de NaOH 2 p. 100 on amhne le pH vers 6. La solution est trouble. On filtre sur u Tonsil ))

puis sur filtre Seitz (1 Entkeimungsschichte H. Le liquide jaune obtenu est limpide. On rend le liquide acide au papier rouge Congo par addition de HCl 20 p. 100, puis on ajoute lentement 900 cms d’a lml . On recueille le precipite par centrifugation, lave ti l’alcool et B l’dther, et shche dans le vide sur SO,H,.

Rendement : 13,5 g d’acide nucl6ique purifi6, soit environ 9 grammes par kilo de levure.

Cet acide est exempt de prothines : la reaction du biuret est negative.

Diagramme de solubilit6 dans l’acide acdtique ti 50 p. 100

On met en suspension dans l’eau 0,3 g d’acide nucleique ainsi pr6- pare; par addition prudente de NaOH 2 p. 100, on ambne le pH vers 6; l’acide est alors totalement dissous. On dilue A 25 cms.

Dans 5 tubes ti essais, on introduit respectivement 1, 2, 3, 4, 5 cms d e cette solution et on complhte ti 5 cm3 avec de l’eau. On place le? tubes dans la glace fondante. A chaque tube, on ajoute 5 cm3 d’acidc achtique glacial; on agite et on laisse 1 / 4 d’heure ti 0 degrh. On centri- €uge rapidement; le liquide surnageant doit &re parfaitement limpide. On pipette 5 cm’ de chaque liquide surnageant, mineralise chacune des prises ti l’acide de 0,6 cm* d’acide perchlorique 70 p. 100. On dose le P. On determine Cgalement la teneur en P de la solution de nuclCate.

24 H . CHANTRENNE

Tous les dosages de P ont 6t6 effectuks par la m6thode de Kiittner et Liechtenstein (’) . R~SULTATS

La premiere colonne exprime la teneur en P en g 10-’ par cms en supposant qu’aucune prkipitation ne se soit produite. Cela represente donc le P total dans le diagramme (abscisses).

par cm* la teneur en P du liquide surnageant (ordonnkes du diagramme).

La seconde colonne exprime en g

P total P non P total P non P total P non pr&iplte prfclpit4 prQiplt,f

21,l 15,O 110 84 564 290 42,2 3093 230 1 31 1.128 620 63,3 46’0 330 200 1.693 915 844 37,O 440 252 2.256 1.240

550 318 2.820 1.500

Ces valeurs ont 6th port&s sur les graphiques 11 et 12. Les points se placent en ligne droite; l’inclinaison de la droite indique que 45 % de l’acide nucl6ique ont 6tk prkipit6s dans ces conditions.

FIG. 11. - Diagramme de solubiJit6 dans l’acide acetique A 60 p. 100. Zone de concexftration : P = 0 - 600 . g/cmS.

(l) K ~ ~ T N E R et LIEGETENSTEIN, J. B. C., 86, 671 (1930).


PsolutJr/ce /

/ /

/

/ /

/ /

/

/ /

/

dggrP/ce 4000 PO40

FIG. 12. - Diagramme de solubilit6 dans l’acide acktique a 50 p. 100. Zone de concentration : P = 0 - 3.000. 10-o g/cmS.

Un autre lot d’acide nuclbique soumis B la m&me Btude, a fourni les rksultats suivants (graphique, fig. 3):

P total P non prkipit6 P total P non pr8cipit4

5.875 3.580 940 560 4;700 2.820 705 406 3.525 2.020 470 245 2.350 1.380 1.176 695

-

Les rksultats sont tout B fait semblables B ceux fournis par 1’6chan- tillon pdc6dent. Le domaine de concentration a BtB Blargi jusqu’h une teneur en acide nuclBique de 6 % environ. Cet Bchantillon d’acide nu- clBique contient environ 40 % de la substance pr6cipitBe dans ces conditions.

FRACTIONNEMENT : PREMIER ESSAI

A une solution B 2 p. 100 d’acide nuclkique dans l’eau (+ NaOH -+ pH 6) refroidie B 0 degr6, on ajoute un volume Bgal d’acide acBtique glacial aussi froid que possible. On laisse 1/4 d’heure B 0 degr6, puis on centrifuge; on lave le pr6cipit6 A l’aide d’acide ac6tique B 60 p. 100, puis B l’alcool et B 1’6ther et on shche dans le vide sur SOJI,. Ce pr6cipitB reprbsente la fraction A. Le liquide surnageant de la centrifugation est additionnh d’un peu de HCl, puis d’un volume Bgal d’alcool. Le pr6- cipit6 qui se forme est centrifug6, lave A l’alcool et A l’Bther, et s6chB. C’est la fraction B.

26 H . CHANTRENNE

Solubiliti de la fraction A

La solubilite de la fraction A a ete ktudiee selon la methode d6jA u tilishe .

P non pr&ipit& P total P non prkipit8 P total

12 5 4 120 21 ,o 24 7 2 120 20,8 48 12,2 240 36’8 72 16,4 360 53,6 96 18,2 470 70,R

(Graphique 18, petits triangles. )

Ces points se placent bien sur une droite, mais qui n’est pas hori- zontale; son inclinaison indique la presence de 14 % de substances non prhcipitables.

* * * L’acide A a BtB soumis A une nouvelle prbcipitation par I’acide ac6-

tique A 50 p. 100. Cet acide nuclkique ayant subi deux precipitations successives, est soumis A la mBme etude que plus haut.

P total P non pr6ccipit4 P total P non pioCipit4

24’4 778 48,8 1916 73,2 13,2 97,6 14,6

122 20,5 244 3 4 , O 366 6490 488 83’5

(Graphique 13, petites croiz.)

Ces points se placent sur la m&me droite que ceux de 1,a serie prk- cedente; des precipitations rCpBt6es n’am61iorent pas l’acide nucleique, bien qu’elles Bliminent chaque fois une quantit6 importante de produits solubles. Ceci montre que l’acide acktique, dans les conditions utilMes, demolit partiellement l’acide A et le transforme en produits plus solubles, ou bien qu’un Bquilibre tend B s’ktablir entre I’acide A et des produits de degradation solubles.

En rkduisant au minimum le temps de sejour de l’acide nuclkique dam I’acide acdtique, on a obtenu une amelioration sensible.

P total

122 244 366 488

P non pr6cipit6

14,5 21,5 30’0 4095

(Graphique 13, petits cercles.)


\ \

0

\ \ \

\ \\

\

I

0

28 H. CAANTRENNE

La teneur en produits solubles n’est guhre que de 7 %. Mais une precipitation ultbrieure, cependant rapide, a ramen6 cette

teneur h 9 % :

P total P non prkiptte P en solution aprhs 2 heures

67 10 17 134 17 %5 201 23 30 268 28 44

(Graphique 13, petits carrds.)

La troisihme colonne du tableau ci-dessus montre que le s6jour de l’acide nucl6ique dans l’acide achtique, conduit h sa transformation partielle en produits solubles.

La precipititation par l’acide ac6tique h 50 p. 100 ne permet donc pas une purification plus pouss6e du produit.,

Diagramme de eolubilitk de la fraction A dans un mklange contenant de l’acktone, de l’acide adtique et de l’eau

On a proc6d6 comme prbchdemrnent, mais en rernplaCant l’acide ac6- tique glacial par un m6lange form6 de deux volumes d’acide ac6tique glacial, un volume d’ac6tone et deux volumes d’eau, et refroidi h 0 degr6.

P total

115 230 346 460

P non prkipith

17,5 41,2 65,5 83,O

On a port6 sur le m&me graphique (fig. 14) les valeurs obtenues pour la prkipitation du meme Bchantillon d’acide nucl6ique par l’acide ac6- tique. Les valeurs obtenues se placent presque sur la m&me droite.

Si nous tenons compte de la remarque faite plus h u t , dans laquelle nous montrions que la solubilit6 de la fraction A 6tait trhs diffkrente de celle de la fraction B, nous pouvons conclure que la substance prdcipi- tbe par le mdlange est selon toute vraisemblance, identique il celle que prbcipitait l’acide acbtique.

Nous avons essay6 de pousser plus loin la purification par pr6cipi- tations successives h l’aide de ce m6lange. L’acide nucl6iqke dont nous partions avait subi trois pr6cipitations rapides par l’acide ac6tique.

P total

123 246 369 492

P non precipitf

12,o 26,6 34,6 51,O

(Graphique 6, petits cercles.) soit 91 % de A, 9 % de produits solubles.


Le prkcipitd a dtt5 recueilli, lave & l’aide du mdange precipitant dilue deux fois, puis & l’alcool, A l’kther, puis rcdissous. On a refait un diagramme dc solubilit6 dans les m&mes conditions :

P total

85 170 255 340

P non pr6cipit6

5,5 4,5 9,o 13’0

(Graphique 4, petits triangles.) soit 97 % acide A.

Une seconde s6rie d’essais a 6th faite :

P total

101 202 303 404

P non prkipit6

4’2 7,o 8’4 12,6

(Graphique 4, petits carrds.) :soit 97,5 % acide A.

Le precipitd a 6th redissous, puis sa solubilit6 Btudiee :

P total

77,5 136 232,5 310

(Graphique 4, petites croix.) soit 99 % A.

Le precipitd redissous a 6te de nouveau Btudie :

P total

86 172 268 344

P non pr6cipit6

292 3,3 3,a 3,2

- (Graphique 4, petites dtoiles.)

soit 99-100 % A.

On p u t donc purifier I’acide nucldique A par prCcipitations suc-

La solubilitt5 de l’acide nucldique A dans le melange : adtone-acide -cessives par le melange (acCtone-acide acetique-eau) .

30 H. CHANTRENNE

acetique-eau, est telle que 1 cm* de solution saturee contient environ

Au cows d’un essai de fractionnement portant sur plusieurs grammes d’acide nucleique total, nous avons obtenu par deux prbi- pitations successives A l’aide du melange, une preparation d’acide nucleique A dont le diagramme de solubilite indique une teneur de 98 % en P prepipitable.

3 * 10-6 g P.

P total

88’6 177 %6,6 364

P non pr&ipIte

1’8 382 4,0 443

IWLEMENT DE LA FRACTION A

On met en suspension 10 .grammes d’acide nucleique (preparc? comme il a 6th dit plus haut) dans 600 cm’ d’eau; on ajoute prudemment de la soude caustique h 2 p. 100 pour dissoudre l’acide nuclbique, tout en veillant A ce que le pH ne depasse jamais 7. On refroidit la solution h 0 degr6, puis on y sjoute un volume Bgal d’un melange d’une partie d’acetone, deux parties d’acide acetique et deux parties d’eau, melange Bgalement refroidi A 0 de&. I1 se forme un precipite parfaitement blanc qui flocule rapidement. On laisse reposer 1/4 d’heure A 0 degr6, puis on &pare le precipite par centrifugation. On le lave A l’aide du liquide precipitant dilue de moiti6, puis A I’alcool pour 6limi- ner l’acide acetique.

Sans qu’il soit necessaire de &her le precipite, on le remet en suspension dans 260 cm* d‘eau, le redissout par addition prudente de soude L 2 p. 100. On rephte alors la precipitation comme ci-dessus. On centrifuge, lave A l’aide du melange precipitant dilu6, puis A l’alcool, a 1’6ther et on sbche dans le vide.

Rendement : 3’6

I1 est souvent plus commode de disposer du nucleate de sodium qui est directement soluble dans l’eau. Pour l’isoler, on met l’acide nucleique en suspension dans M) fois son poids d’eau, on ajoute trhs prudemment de la soude caustique B 2 p. 100 et on amhne le pH h 6,O. Si l’acide utilise est exempt de proteines, la solution (environ 2 %) est parfaitement limpide (si elle est trouble, filtrer sur filtre Seitz (( Ent- keimungsschichte D) . Refroidir A 0 degr6, ajouter trois volumes d’ac6tone. Le nucleate de Na precipite (si la floculation tarde, on peut la declan- cher en ajoutant une goutte d’acide acetiquo). On centrifuge, lave le precipite B l’scetone, puis on sbche dans le vide. Le nucleate A se pre- sente sous la forme d’une poudre beige clair trhs soluble dans l’eau.

I1 est bon de determiner la solubilite de ce nucleate; le diagramme de solubilite etabli selon la methode decrite plus haut doit indiquer une teneur en P soluble infbrieure B 3 % du P total.

ELIXTROPBOR~E

Une solution de nucleate A dans un tampon de phosphate de Wren- sen pH 7, de force ionique 0,l a 6th dialysee pendant une nuit dans un

4 grammes d’acide nucleique A.


sac de cellophane, contre un grand volume du meme tampon de phosphate. On a soumis la solution dialys6e A 1’6lectrophorbse dam un appareil muni du dispositif optique de Svensson ( l ) . Le diagramme obtenu est reproduit sur la figure 6.

ELECTROTITR ATION

Les mesures ont Bt4 effectudes A l’aide d’un appareil du type dBcrit par Goyan, Barnes, Hand ( l ) . Les mesures de pH se faisaient A l’aide d’une Blectrode de verre du type McInnes contr816e par un systhme potentiomBtrique muni d’un relais h triodes de Dubuisson et Debot (*). Lc thermostat 6lait reg16 A 2 5 O .

On vBrifiait 1’Ctalonnage de 1’6lectrode avant et aprbs chaque sBrie de titrations, A l’aide d’un tampon de phosphate de S6rensen pH 6,81. La force Blectromotrice trouvBe pour cette valeur du pH permet de cal- culer ou de determiner graphiquement le pH correspondant aux autres valeurs de la force Blectromotrice par application de la relation :

dans laquelle : K = 57,7 f 0,2 ( I - 18) On voit qu’h 25“ une diffbrence d’une unit6 pH correspond A uiie

diffbrencc de force t%xtroInotrice de 0,0591 volt. Les lectures de forcc Blectromotrice Btaient reproductibles A 0,0001 volt prbs. Le pH est donc mesur6 ti moins de 0,Ol unit6 pr8s.

Nous avons procedd comme suit : on iritroduisait dans l’appareil de titration u n volume connu (g6n6ralement 40 cm3) de la solution A Btu- dicr. On y qjoutait centimbtre cube par centimhtre cube (ou 1/2 cm3) uiie solution 0,02 N de HCl ou de NaOH rontcnue dans une burette et on dBterminait le pH aprbs chaque addition.

Lorsqu ’on titre des solutions aqueuses de nuclkate, 1’Bquilibre de pH est atteiiit trbs rapidement - beaucoup plus rapidement que dans le cas des protCiiies. On peut effectuer la mesure du pH 1 A 2 minutes aprbs I’addition du i6actif. Lorsque par addition de HCl on atteint un pH voisin de 3, l’acide nuclBique forme une suspension colloidale, mais ceci n’affecte en rien la titration.

I1 est & dBconseiller de proceder de la facon inverse : quand on titre par NaOH une suspension mkcanique d’acide nucleique dans l’eau, on doit attendre 16 A a0 minutes aprhs chaque addition de NaOH pour que l’equilibre soit atteint, et les r6sultats restent irrhguliers.

1 = tempdraturc (ici 25”).

1. ELECTROTITRATION DU NUCLEATE A

Le nucleate A a 6th prBparB selon la mBthode indiquBe plus haut. La solution Btait parfaitement limpide et contenait 0,64 g de nucl6ate de sodium dans 40 cm’.

Le tableau I reproduit 1t.s dsultats obtenus (voir fig, 7).

( I ) SVENSSON, Kolloid Z., 87, 181 (1939). ( l ) GOYAN, BARNES et HAND, Industrial and Engineering Chemistry

(a) DUBWISSON et DEBOT, Archives inlernationales de Physiologie, 50, Anulytical Edition, la, 486 (1940).

54 (1940).

n

HCI

: 0

,020

2 0 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12

13

14

16

16

17

18 0,5

2,5

lJ

5

5

40

40,5

41

41

,5

42

42,5

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

65

56

57

68

TABL

EAU I

Electrotitration d

u n

ucle

ate

A :

89,1

2 pM

(PO

,),

-

b 3 -

10,l

- 2

0,2

- 3

0,3

-

40,4

- 5

0,5

- 6

0,6

- 8

0,8

- 10

1,o

- 12

1,2

- 14

1,4

- 16

1,6

- 18

1,8

- 20

2,o

- 22

2,2

- w

,4

- 26

2,6

- 28

2,8

- 30

3,O

- 32

3,2

- 34

3,4

- 36

3,6

PH

6,B

69

04

5.73

5,

47

5,243

5,

06

4,89

4,

56

4,27

49

04

3,85

39

64

3,45

3,

26

3,14

3,

Ol

2,91

2

32

2,69

2,69

a,75

POH

7,68

7.

86

8,17

8,

43

8,94

9,

Ol

93

4

9,63

9,

86

10,0

6 10

,26

10,M

10

,64

10,7

6 10

,89

10,9

9 11

,OE

11,1

5 11

,21

11,2

6 11

,31

(H+)

1,8

393

897

13,O

27

,6

5398

91

,3

5J5

141

229

36s

549

724

977

1.23

0 1.

510

1.78

0 2.

040

2.29

0 2.

670

(OH-)

H+ 0 OJ

O7

0,14

01

23

0,37

09

56

1,2

294

616

10,9

17

,4

n,4

36

39

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W

34 H. CEANTRENNE

II. ELECTROTITRATION DE L'ACIDE N U C L I ~ Q U E B, 8OLUBI.E

Les rBsultats de l'blectrotitratien sont rassembles dam le tableau 11

- - ~ 0 o o i ~ ~ ~ ~ d 4 % ~ ~ ~ ~ ~ 6 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ g %S*bffi - c' 0- 0- rl- d- +i 4 ri rli mi ci- cj ci m" Oi m- m- m- e- *- *- *- *- m" m- a-

ACIDE RIBONUCLBIQUE DE LA LEVURE 35 111. ELECTROTITRATION DE L'ACIDE NUCL~IQLIE DE B O I W R I S G I ~

Les r6sultals de I'Plectrotitralion b o i l 1 rassemblks dam le tableau I11 et ont servi A tclablir le grayhiquc de 1;i figure 9.

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- 2,75

- a,79


DBsainination de l’acide nucliique Boebringer

On sait que les groupes NH, fix& sur des noyaux puriques ou pyri- midiques rbagissent beaucoup plus len tement que les amincs aliphati- ques avec I’acide nitreux.

On a mis un gramme d’acide nucl6ique en suspension dans I’eau, amen6 le pH ti 6 avec NaOH, de facon ?I dissoudre l’acide; le volume de la solution 6tait de 15 cm3 environ; on y a ajout6 2,6 grammes de nitrite dc sodium dissous dans 5 cm3 d’eau; puis 7 cm3 d’acide ac6tique glacial. On a maintenu le melange ti 2 5 O pelidant 6 heures. A ce moment le d6ga- gement gezeux avait apparemment cess6.

Par addition de soude, on a ramen6 le pH vers 6, et mis la solution A dialyser pendant 3 jours et 4 nuits, contre de I’eau distill& courante, dans un tube A dialyser; le liquide int6rieur et le liquide ext6rieur Btaient convenablement agitCs pendant toute la durke de la dialyse. Tempkra- lure : 2 degr6s.

Au dialysat (120 cm’) rendu acide au papier rouge Congo par addition d’acide chlorhydrique, on a ajout6 trois volumes d’acbtone. AprBs repos, d’une heure ti 0 degr6, le pr6cipit6 a 6t6 centrifuge, lave ti l’alcool ct A 1’Ether sur la ccntrifugcuse, et s6ch6 dans lc vide. On a recueilli 0,65 gramme.

Cet acide soumis A 1’6lectrotitration dans les conditions habituelles, ;I donne les r6sultats rapporl6s dans le tableau IV et le graphique 10.

* * * Cette recherche a 6t6 effectu6e sous la direction de M. Des-

reux. Nous sommes heureux de pouvoir le remercier ici de son appui th6orique et des pr6cieux conseils techniques dont il nous a gratifi6 tout au long de notre travail.

UNIVERSITB DE L&GE, Laboratoire de chimie-physique

(Professeur Desreux) .

Cornrnuniqud B la Socidtd chimique de Belgique, le 83 juillet 2945

Documents

Contribution à l'étude de l'acide ribonucléique de la levure