Contribution à l'étude de l'acide ribonucléique de la levure

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    06-Jun-2016

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<ul><li><p>Bull. SOC. Chim. Belg., 55, pp. 5-37, 14 fig., 1946 </p><p>Contribution ii 1Btude de lacide Tibonuclkique de la levure </p><p>par </p><p>H. CHANTRENNE (LiPge), aspirant F. N. R. S. </p><p>R%sud. - Dans la prenii&amp;re parlie de ce travail, nous montrons quil est possible disoler dune prBparation dacide nuclhique de la levure, une fraction A qui prkipite dans des conditions parfaitement reproductibles. Les preparations commerciales contiennent cet acide A en proportions trBs variables. </p><p>L6tude Blectrophorbtique dune pr6paration de nucleate A a mon- tr6 quelle contenait plus de 91 % dune substance bien definie et par- faitement seperable par BJectrophorBse. I </p><p>Lelectrotitration du nucleate. A, de la partie soluble B et dun nucleate commercial a fourni les resultats suivants : </p><p>Lacide A contient des fonctions rdpondant aux pK suivants : 3,7 - 4,2 - 6,2 - 8,6 - 10,l - 10,2. I1 se distingue donc de lacide B par la pr6- sence dune fonction suppldmentaire de pK 8,6 et u n petit dhplacement de la fonction dont le pK est voisin de 6. De plus il est possible quil ne posshde pas la fonction dont le pK est voisin de 2,3. </p><p>Le produit B posshde dans la region BtudiBe, des fonctions ioni- sables dont les pK sont voisins de 2,3 - 3,7 - 4,2 - 6,O - 10,l - 10,2. </p><p>I1 possede une fonction correspondant ?i chacun des dits pK par quatre atomes de phosphore. La courbe de titration est conforme B la courbe thborique de Levene dans toute la region Btudike, soit de pH 2,6 A pH 100. </p><p>Lacide commercial de Boehringer qui est un melange des acides A et B fournit une courbe de titration intermediaire. </p><p>Par IBtude electrotitrimetrique de Iacide nuclCique dhsamind, nous mans montrh que lea regions dionisation des fonctions NH, sont bien celles qu,admet Levene : leurs pK se situent donc entre 2,3 et 4,2. LBtude de Iacide nucleique dhsamine nous a permis en outre de montrer que les conclusions que Allen et Eiler, Makino, Bredereck tirent des resultats de Ieurs dosages acidimktriques sont errondes et nous avons remis en question le problBme du nombre des fonctions acide phosphorique pri- maire de lacide nucleique. La formule cyclique de Takahashi-Makino perd ainsi les principaux de ses fondements exphimentaux. </p></li><li><p>6 A. CHANTRENNE </p><p>Isolement, purification et titration de Iacide ribonuclhique () </p><p>I. INTRODUCTION </p><p>Les acides nucleiques sont des substances naturelles com- munes Zi tous les Qtres vivants. On peut les isoler sous la forme dune poudre blanchltre amorphe insoluble dans les solvants organiques. 11s consistent en une combinaison dacide ortho- phosphorique, dun sucre &amp; 5 carbones et dhbtbrocycliques appartenant aux groupes des purines (adbnine, guanine) et des pyrimidines (cytosine, uracile, thymine) . </p><p>On distingue deux classes dacides nuclbiques daprBs la nature de leur constituant glucidique : </p><p>Les acides dksoxyribonuclkiques contiennent du d-d6soxy- ribose, ils sont localises dans les noyaux cellulaires et ils ont pour type lacide thymonucl6ique, quon extrait du thymus de veau ; les acides ribonuclkiques contiennent au contraire du d-ribose ; ils se trouvent, essentiellement dans le cytoplasme de toutes les cellules (. ). </p><p>Depuis quelques annbes, les acides ribonuclbiques retien- nent lattention des biologistes car on a des raisons de penser quils interviennent de quelque fagon dans lbdification des pro- tbines par les &amp;re vivants (* ). </p><p>Lanalyse de leur fonction physiologique se heurte mal- heureusement &amp; linsuffisance des connaissances actuelles de leurs propribtea physico-chimiques et de la structure de leurs mol6cules. </p><p>Lbtude que nous prbsentons est le point de depart dune skrie de recherches entreprises au laboratoire de chimie de lUniversit6 de LiBge, et qui sont consacrdes &amp; lbtude des pro- pribtbs physico-chimiques de lacide nuclhique de la levure ou acide zymonuclbique, qui est le type des acides ribonuclbiques. </p><p>La structure chimique de lacide zymonuclhique reste tr&amp;s imparfaitement connue, en dbpit des nombreux travaux qui furent consacrbs &amp; son btude. Lorsque Levene () Btablit que </p><p>( l ) Dans la redaction de ce memoire, nous navons pu tenir compte que dun seul travail paru pendant la guerre dans les periodiques anglo- Saxons, celui de Allen et Eiler. </p><p>() J. BRA=, Archives de biologic, 53, 207 (1941). (*) CABPERWON, LANDSTR~M-HYDFA et AQUILONIIJS, Chromosoma, B 2, </p><p>(9 LEVENE, Biochern. Z., 47, 120 (1909). 111 (1941). </p></li><li><p>ACIDE RIBONUCLBIQUE DE LA LEVURE 7 </p><p>lacide nucl6ique est form6 par lunion de quatre nuclCotides en proportions BquimolBculaires, le problkme de sa structure fut ramen6 A celui du mode de liaison des quatre nuclBotides entre eux; tous les travaux consacrBs depuis lors B lacide nucl6ique par Levene, Thannhauser, Jones, Bredereck, Taka- hashi, Makino, Galland, F.-G. Fischer et leurs collaborateurs, sont autant de tentatives plus ou* moins fructueuses de rbsolu- tion de ce probkme. Les conclusions auxquelles parvinrent ces chercheurs furent souvent contradictoires. De lexamen atten- tif des rBsultats expdrimentaux quils ont accumul6s, il res- sort () quon peut consid6rer comme bien Btablis les faits suivants : lacide zymonucl6ique est form6 par la combinai- son de quatre mononucl6otides en proportions BquimoMcu- laires; la rupture de la molQule en mononuclBotides sac- compagne de lapparition de quatre fonctions acides ; une sur quatre des liaisons auxquelles participe lacide phosphorique se comporte differemment des autres. </p><p>On ne posshde actuellement du poids mol6culaire de lacide nucleique aucune valeur certaine : les chiffres proposBs se situent entre 1.300 () et 17.000 (*). Nous montrerons dail- leurs dam une publication ultbrieure quils sont d6pourvus de signification. </p><p>OH I </p><p>I I O=P-Ri bosc- Adthine </p><p>OH 0 I </p><p>0=P-Ribose-Uracile I I </p><p>OH 0 I I 1 </p><p>OH 0 I </p><p>I </p><p>O=P-Ribose-Guanine </p><p>O=P-Ri bose-Cytosine </p><p>OH </p><p>FIG. 1. - Formule de structure de Levene. </p><p>(I) H. CHAWTRENNE, thkse, Liege (1946). () MYRBACK et JORPES, 2. Physiol. Chem., 237, 169 (1936). ( 8 ) LORING, J . B . C., 130, 251 (1939). </p></li><li><p>8 H. CHANTRENNE </p><p>On ne doit donc considerer les formules de structure pro- pos6es par Levene () (fig. 1) ou par Takahashi () (fig. 2) - </p><p>OH I </p><p>Cytosine --Ribose-- 0-P-0- Ribose-Adenine I 0 </p><p>I 0 </p><p>II 0 </p><p>I O=P-OH </p><p>I HO-P=O </p><p>I 0 0 </p><p>i 0 </p><p>I II I I </p><p>G uanine-Ribose-0-P-0-Hi bose- Uracile </p><p>OH FIG. 2. - Formule de structure de Takahashi. </p><p>pour ne citer que les plus classiques - que comme des repre- sentations approch6es et provisoires. Elles nen r6sument pas moins un ensemble remarquable dacquisitions precieuses. </p><p>* * * A la lecture de tous les travaux consacres &amp; 16tude de la </p><p>structure de lacide nucleique, nous avons 6th frappe par le fait quaucun effort na 6t6 fait dans le but dobtenir une subs- tance homogene &amp; proprietes definies, formhe dune seule esphce mol6culaire. </p><p>Or, lacide nucleique sextrait de la levure en milieu for- tement alcalin et on sait que le s6jour prolong6 de lacide nu- clbique dans un tel milieu, conduit &amp; son hydrolyse en nucleo- tides (ou nucldosides). On a donc des raisons de craindre - comme le firent remarquer trks justement Johnson et Har- kina (*) et plus tard Fischer () - que lacide nucleique ne soit dej&amp; partiellement degrade au cours de lextraction. </p><p>I1 apparatt donc comme tres probable que les Bchantillons dacide nucleique dtudiBs jusquici netaient pas des substances pures, mais plutbt des melanges contenant des produits d6jh plus ou moins hydrolyshs ; il eat certain aussi que les Bchantil- </p><p>( l ) LEVENE, J. B. C., 48, 119 (1921). p) TAXAHASHI, J. Biochem., i6, 463 (1932). () JOHNSON et HARKINS, J . A . C. S., Ui, 1779 (1929). () F.-G. FIBCHW, Natunuissenschaften, 30, 377 (1942). </p></li><li><p>ACIDE RIBONUCLBIQUE DE LA LEVURE 9 </p><p>lons htudihs par les differents chercheurs navaient pas des proprihtes iden tiques. </p><p>Notre premier but fut de combler cette lacune ; nous nous sommes efforce disoler un acide nucl6ique aussi peu degrade que possible et form6 essentiellement dune seule espece mole- culaire proprihtes physiques bien ddfinies. </p><p>11. Isolement dun acide nucl6ique d6fini </p><p>Lacide nucl6ique fut extrait de la levure selon la methode de Johnson et Harkins (I) dont nous avons leghrement modifih la technique (voir partie exp6rimentale) . Cette mBthode fut choisie parce quelle semblait la plus apte A fournir un acide nucleique peu dCgrad6, et parce que lextraction alcaline sy deroule dans des conditions faciles A reproduire. </p><p>Le produit ainsi obtenu est exempt de substances pro- teiques (&amp;action du biuret nCgattve, m6me dans des solutions concentrdes du produit) . </p><p>Pour determiner la conlposition physique de lacide nu- clhique ainsi obtenu,nous avons htudie sa solubilith par la methode des diagrammes de solubilit6 de Kunitz et North- rop (). Lemploi de ces diagrammes permet en effet, dans les cas favorables, de denombrer les constituants dun melange, le pourcentage respectif de chaque composant, et de determiner les conditions les meilleures disolement de chacun deux. La methode de Kunitz et Northrop a permis de fractionner des melanges complexes de prothines et dobtenir les differents individus chimiques qui les composent dans un &amp;at de grande puretb () . </p><p>Les quantites dacide nuclhique mis en suspension au cours dune experience de solubilite et les quantites de cet acide passant en solution sont determinees par dosage colorime- trique du phosphore. </p><p>Aprh diverses tentatives, nous avons adopt6 comme $01- vant Iacide acetique a 50 p. 100. Dans ce milieu, la separation des deux phases est parfaite. Au contraire, en presence dacides forts (HCI, S04H2, acide trichlorac6tique), ou &amp; des concen- </p><p>( I ) JOHNSON et HARKINS, J . A . C. S., 51, 1779 (1929). (a) KUNITZ et NORTHROP, Cold Spring Harbor Symposia on Quantita- </p><p>tive Biology, 6 , 526 (1938). (a) K U N ~ et NORTBROP, Cold Spring Harbor Symposia on Quantita- </p><p>tive Biology, 6 , 625 (1938); - HEIIRIM, DESREUX, NORTEROP, J . Gen. PhysioI., %, 213 (1940). </p></li><li><p>10 H. CHANTRENNE </p><p>trations dacide achtique inf6rieures B 50 p. 100, on obtient des suspensions colloi3dales stables ; 16tude de la solubilit6 des nucl6ates peu solubles (Ba, La, Pb, Mg) se prdsentait ma1 : la reproductibilitd des rdsultats nhtait pas satisfaisante. dr P &amp;at. </p><p>I </p><p>I I I I I </p><p>I I </p><p>. 4 D W </p><p>FIG. 3. - Courbe de solubilit6 dacide nucl6ique non purifi6. Abscisses : quantit6 dacide nucl6ique par cms de suspension. Ordonnbes : quantitb dacide nucl6ique par cms de filtrat. </p><p>Pourcentage de la fraction soluble : a b </p><p>Le graphique 3 obtenu pour un echantillon dacide nu- cleique extrait de la levure de la fagon indiquee, montre que cet Bchantillon contenait une substance trhs peu soluble dans lacide achtique B 50 p. 100, et qui repr6sente un peu moins de la moitih de la quaatit6 totale du produit 6tudiB. Cest la m6me substance qui prBcipite d8s les plus faibles concentra- tions, et jusquaux concentrations les plus BlevBes que nous ayons essaydes (6 %). </p><p>Appelons A la fraction tr8s peu soluble dans lacide ace- tique B 50 p. 100, et B, la fraction soluble. </p><p>Lexamen des rdsultats que nous avons obtenus (cf. partie experimentale) montre que la solubilit6 de la fraction A est de Iordre de 30 milligrammes par. litre, celle de B est sup&amp; rieure &amp; 30 grammes par litre. La solubilit6 de B est donc plus de 1.000 fois superieure B celle de A dans le m6me solvant. </p><p>Lisolement des deux fractions promettait d&amp;tre trhs facile. Cependant, par fractionnements rhp6t6s dans lacide acdtique </p></li><li><p>ACIDE RIBONUCLBIQUE DE LA LEVURE 11 </p><p>50 p. 100, il est impossible dobtenir un produit contenant plus de 90 % de la fraction A peu soluble. I1 savhre, en effet, que cetbe fraction se transforme assez rapidement en substances solubles lorsquelle reste au contact dacide ac6tique 50 p. 100. </p><p>Nous avons r6ussi B isoler trhs commod6ment un produit contenant plus de 99 % de la fraction peu soluble, en adoptant un autre solvant : un melange form6 dun volume dacdtone, deux volumes dacide acBtique glacial et sept volumes deau. La solubilit6 des deux fractions A et B dans ce milieu, est sensiblement la m&amp;me que dans lacide ac6tique B 50 p. 100. </p><p>l i . F Y W * . </p><p>/ / </p><p>/ / </p><p>/ </p><p>I </p><p>... &amp;&amp;. I I.. FIG. 4. - Courbes de solubilitk dhchantillons purifies dacide nucl6iquc. </p><p>Le diagramme 4 (petites Btoiles) qui montre que plus des 99 % de la substance isol6e sont insolubles dans les condi- tions expbrimentales adoptees ne permet cependant pas daf- firmer que cette substance soit form6e dune seule esphce mo- ldculaire : la solubilit6 trhs faible rend impossible 16tude de la partie infkrieure du diagramme, et on ne peut pas rejeter h priori Iid6e que le produit 6tudi6 pourrait &amp;re form6 de plu- sieurs substances trbs peu solubles. Nous nous sommes efforcB de r6aliser des conditions de solubilit6 plus grande de la frac- tion A. Nous avons essay6 la pr6cipitation B 16tat de nucl6ates de divers m6taux (Ba, Pb, La, Mg), la pr6cipitation physique de nucleate de sodium par des sels neutres (chlorure. de sodium, sulfate dammonium) , la prbcipitation par divers melanges acides ou neutres contenant des solvants organiques miscibles 5 leau. Dans tous les cas, la solubilite de la frac- tion A Btait trhs faible (de lordre de 30 mg/litre) ou bien au contraire presque illimit6e; dans aucun cas, elle navait une valeur moyenne. </p><p>Soulignons ici que la grande diffdrence de solubilit6 des deux fractions A et B qui a BtB rapporthe plus haut et le carac- t6re de (( tout ou rien )) de la solubilit6 de la fraction A, indique que A pourrait &amp;re un polynuc16otide B degre de polymerisa- tion 6lev6. </p></li><li><p>12 H. CHAhTRENNE </p><p>En effet, Husemann, Pliitze et Schulz ont fait remarquer ( l ) que la solubilitb dun polymere est ou bien tres faible ou bien presque illimitde, selon que le monomere est moyennement soluble uu peu soluble. Le calcul de 1Cnergie de dissolution montre que dans une sdrie de polymhres homologues, la solu- bilitb dans un solvant donnC est une fonction exponentielle du coefficient de polymdrisation. Cette relation a bt6 v6rifiCe no- tamment pour une sbrie de polystyroles &amp; degrbs de polym6ri- sation divers. </p><p>On congoit que la rbalisation de conditions de solubilitb moyenne pour un polymere &amp;lev6 soit rendue tres difficile, si de faibles variations de la solubilitd du monomhre entrafnent des variations trhs importantes de celle du polymere, qui passe ainsi sans transition dune valeur extrbme &amp; lautre. </p><p>Ce caractere particulier de la solubilith de la fraction A emp&amp;che de pousser plus avant 16tude de son degrC de puret6 par lemploi des diagrammes de Kunitz et Northrop. </p><p>111. Etude 6lectrophor6tique de la fraction A </p><p>Lappnreil utilise () est muni du dispositif optique de Svensson (). Le diagramme fourni par lappureil est tel quh chaque constituant sbparC correspond une courbe en cloche </p><p>d n d c qui rend compte de la variation de la dCriv6e - et donc - tlx dx en fonction de 2 , la hauteur dam la cellule dblectrophorhse, </p><p>FIG. 6. - Diagramme d6lectrophor&amp;se. </p><p>( l ) HUBEMANN, PL~TZE et SCHULZ, Naturwissenschajten, 29, 306 (1941). () Ltllectrophorhse a 6th effectu6e B la Fondation Reine Elisabeth &amp; </p><p>h i...</p></li></ul>

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