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Contribution 21 1'Ctude du polymorphisme de quelques mCtallothionCines par chromatographie liquide de haute performance Cotntnission des Communaute'sEurope'ennes, Centre Commun de Recherche, Institut des Mate'ria~u et Mesures de Rwrence, Retieseweg, B-2440 Geel, Belgique R e p le 19 octobre 1992 Gw BORDIN, FERNANDO CORDEIRO -SO et ADELA-ROSA RODRIGUEZ. Can. J. Chem. 72, 1238 (1994). Quatre mCtallothionCines commerciales extraites de foie de lapin (RL, RL I, RL 11) et de rein de cheval (HK) ont CtC CtudiCes par chromatographied'exclusion stCrique et sur phase non-polaire, afin de caracttriser leur polymorphisme. Les isoformes sont dttecttes en UV A 250 nm. Les ~Cparations par exclusion stCrique montrent que les mttallothiontines sont partiellement dimtristes, avec des proportions molaires de dimkres variant de 5% pour HK A 15% pour RL 11. Par chromatographiesur phase non-polaire, on montre que RL est composCe de quatre isoformes dominantes, RL I de deux, RL I1 de trois et HK de deux. Pour la strie RL, RL I et RL 11, une attribution des pics est proposCe. Les rksultats des deux mCthodes convergent pour estimer que RL est constituke de 20 A 30% de RL I et de 70 A 80% de RL 11. Gw BORDIN, FERNANDO CORDEIRO RAFQso, and ADELA-ROSA RODRIGUEZ. Can. J. Chem. 72, 1238 (1994). Four commercially available metallothioneinsfrom rabbit liver (RL, RL I, RL 11) and from horse kidney (HK) have been stud- ied by size exclusion chromatography and by reverse-phase chromatography, to characterize their polymorphism. The isoforms are detected by UV at 250 nm. Separations by size exclusion show that the metallothioneins are partially dimerized, with molar rates of dimer ranging from 5% for HK to 15% for RL 11. The four chromatograms obtained by reverse phase exhibit a different morphology: RL separates in four main isoforms, RL I into two, RL I1 into three, and HK into two. An attribution of the various peaks for the RL, RL I, and RL I1 series is proposed. The comparable results obtained by the two methods allow us to estimate that RL is composed of 2&30% RL I and 70-80% of RL 11. Introduction Les mCtallothionCines (MT) constituent une famille de metal- loprotCines originales. Un poids molCculaire relativement bas, une proportion ClevCe de cystkine (=30%), l'absence d'acides aminCs aromatiques et la prCsence permanente de cations mCtal- liques complexCs (essentiellement cadmium, zinc et (ou) cuivre selon l'origine des MT) dont la teneur totale varie peu sont les ClCments structuraux qui caractkrisent ces protkines atypiques (I). La distribution des 20 rCsidus cystCinyles sur les 61 acides aminCs que compte une chaine mCtallothionCinique est invari- ante quelle que soit l'origine des MT, au moins chez les mammiferes (2), avec 7 sCquences Cys-X-Cys, ou X est un amino-acide autre que la cystkine. Les caractkristiques optiques traduisent parfaitement l'existence de liaisons entre les atomes de soufre des cystCines et les cations mCtalliques (de 6 B 7 atomes par gramme de mCtal par mole de MT). Les 20 thiolates participent ainsi B la chClation des cations dans un rapport glo- bal soufrelmCta1de 311 environ (3,4). DCcouvertes en 1957 par Margoshes et Vallee (5) dans le cortex rCnal du cheval, des MT ont CtC identifiCes depuis cette Cpoque chez de trks nombreuses espkces animales dont l'homme (6) et la moule Mytilus edulis (7), chez divers microorganismes comme l'ascomyckte Neuro- spora crassa (8) et m&mechez certaines plantes dont la tomate (9). I1 est donc acceptable d'envisager une prksence ubiquiste des mCtallothionCines dans le monde vivant. Au cours des 15 dernikres annCes, les connaissances sur la structure chimique et sur les fonctions biochimiques des MT ont fortement progressk. On a par exemple pu mettre en Cvidence le fait que certaines MT existent sous plusieurs isoformes (isomCtallothionCines, isoMT), ce polymorphisme provenant d'une variation de structure primaire par substitution de 1 B 15 acides aminCs survenue au cours de 1'Cvolution des espkces (10). Le nombre d'isoformes d'une MT pourra donc tout ' ~ u t e u r qui adresser toute correspondance. TClCphone : 32-14- 571211. TClCcopieur : 32-14584273. Ttlex : 33589 EURAT B. naturellement dipendre de l'espkce considtrte. Kojima et al. (11) parlent d'au moins quatre isoMT chez le cheval (foie et rein), Klauser et al. (12) Cgalement d'au moins quatre chez le lapin (foie), alors que Hunziker et Kagi (13) identifient cinq iso- formes humaines (foie) et Richards et Steele (14) en dCnom- brent trois chez le porc (foie et rein) et deux chez le rat (foie). Cependant, au-dela de cette variabilite ccnaturelle>> parfois importante du nombre d'isomCtallothionCines, des Ccarts d'ordre mCthodologique divisent toujours les auteurs. Les mCthodes classiquement employCes pour sCparer les isoMT sont celles bas~es sur les diffkrences de charges Clectriques induites par les variations de structure primaire : Clectro- phorkse, chromatographie d'Cchange d'ions (15). Mais une sub- stitution de quelques amino-acides n'induira pas toujours une diffkrence de charges Clectriques telle qu'elle puisse permettre une skparation efficace des isoformes (10). Cette limitation semble toutefois pouvoir &tre levCe par l'utilisation d'une autre technique chromatographique, la chromatographie liquide sur phase non-polaire. Elle conduit gCnCralement B de bien meilleu- res rCsolutions et permet de montrer la prCsence d'isoformes supplCmentaires non dCtectCes par les mkthodes ccclassiques, (12, 16). Par exemple, Richards et Steele (14) identifient deux isoMT dans le cytosol de foie de porc par Cchange d'ions (DEAE-SCphadex A 25), mais en isolent trois sur une colonne de phase non-polaire (RP C18). Enfin, l'emploi d'une m&me mCthode de sCparation ne constitue pas encore B ce jour une garantie de similitude de rbultats. Bien qu'ils utilisent des methodologies trks voisines (m&me type de colonne, m&mes solvants d'Clution) pour Ctudier la MT extraite du rein de cheval, Richards et Steele (14) et van Beek et Baars (17) n'aboutissent B des rksultats que difficilement comparables. Au-delB du nombre de pics observCs (respectivemeit sept et trois), les chromatogrammes prksentent des morphologies fort diffkrentes. Les conclusions ne peuvent donc qu'&trepartielles. Les divergences sur l'existence voire sbr la possibilit~ d'existence de formes dimkres et (ou) polymkres de MT sont Cgalement importantes. En rCalitC, fort peu de travaux font men- Can. J. Chem. 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Contribution à l'étude du polymorphisme de quelques métallothionéines par chromatographie liquide de haute performance

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Contribution 21 1'Ctude du polymorphisme de quelques mCtallothionCines par chromatographie liquide de haute performance

Cotntnission des Communaute's Europe'ennes, Centre Commun de Recherche, Institut des Mate'ria~u et Mesures de Rwrence, Retieseweg, B-2440 Geel, Belgique

R e p le 19 octobre 1992

G w BORDIN, FERNANDO CORDEIRO -SO et ADELA-ROSA RODRIGUEZ. Can. J. Chem. 72, 1238 (1994). Quatre mCtallothionCines commerciales extraites de foie de lapin (RL, RL I, RL 11) et de rein de cheval (HK) ont CtC CtudiCes

par chromatographie d'exclusion stCrique et sur phase non-polaire, afin de caracttriser leur polymorphisme. Les isoformes sont dttecttes en UV A 250 nm. Les ~Cparations par exclusion stCrique montrent que les mttallothiontines sont partiellement dimtristes, avec des proportions molaires de dimkres variant de 5% pour HK A 15% pour RL 11. Par chromatographie sur phase non-polaire, on montre que RL est composCe de quatre isoformes dominantes, RL I de deux, RL I1 de trois et HK de deux. Pour la strie RL, RL I et RL 11, une attribution des pics est proposCe. Les rksultats des deux mCthodes convergent pour estimer que RL est constituke de 20 A 30% de RL I et de 70 A 80% de RL 11.

G w BORDIN, FERNANDO CORDEIRO RAFQso, and ADELA-ROSA RODRIGUEZ. Can. J. Chem. 72, 1238 (1994). Four commercially available metallothioneins from rabbit liver (RL, RL I, RL 11) and from horse kidney (HK) have been stud-

ied by size exclusion chromatography and by reverse-phase chromatography, to characterize their polymorphism. The isoforms are detected by UV at 250 nm. Separations by size exclusion show that the metallothioneins are partially dimerized, with molar rates of dimer ranging from 5% for HK to 15% for RL 11. The four chromatograms obtained by reverse phase exhibit a different morphology: RL separates in four main isoforms, RL I into two, RL I1 into three, and HK into two. An attribution of the various peaks for the RL, RL I, and RL I1 series is proposed. The comparable results obtained by the two methods allow us to estimate that RL is composed of 2&30% RL I and 70-80% of RL 11.

Introduction Les mCtallothionCines (MT) constituent une famille de metal-

loprotCines originales. Un poids molCculaire relativement bas, une proportion ClevCe de cystkine (=30%), l'absence d'acides aminCs aromatiques et la prCsence permanente de cations mCtal- liques complexCs (essentiellement cadmium, zinc et (ou) cuivre selon l'origine des MT) dont la teneur totale varie peu sont les ClCments structuraux qui caractkrisent ces protkines atypiques (I). La distribution des 20 rCsidus cystCinyles sur les 61 acides aminCs que compte une chaine mCtallothionCinique est invari- ante quelle que soit l'origine des MT, au moins chez les mammiferes (2), avec 7 sCquences Cys-X-Cys, ou X est un amino-acide autre que la cystkine. Les caractkristiques optiques traduisent parfaitement l'existence de liaisons entre les atomes de soufre des cystCines et les cations mCtalliques (de 6 B 7 atomes par gramme de mCtal par mole de MT). Les 20 thiolates participent ainsi B la chClation des cations dans un rapport glo- bal soufrelmCta1 de 311 environ (3,4). DCcouvertes en 1957 par Margoshes et Vallee (5) dans le cortex rCnal du cheval, des MT ont CtC identifiCes depuis cette Cpoque chez de trks nombreuses espkces animales dont l'homme (6) et la moule Mytilus edulis (7), chez divers microorganismes comme l'ascomyckte Neuro- spora crassa (8) et m&me chez certaines plantes dont la tomate (9). I1 est donc acceptable d'envisager une prksence ubiquiste des mCtallothionCines dans le monde vivant.

Au cours des 15 dernikres annCes, les connaissances sur la structure chimique et sur les fonctions biochimiques des MT ont fortement progressk. On a par exemple pu mettre en Cvidence le fait que certaines MT existent sous plusieurs isoformes (isomCtallothionCines, isoMT), ce polymorphisme provenant d'une variation de structure primaire par substitution de 1 B 15 acides aminCs survenue au cours de 1'Cvolution des espkces (10). Le nombre d'isoformes d'une MT pourra donc tout

'~uteur qui adresser toute correspondance. TClCphone : 32-14- 571211. TClCcopieur : 32-14584273. Ttlex : 33589 EURAT B.

naturellement dipendre de l'espkce considtrte. Kojima et al. (11) parlent d'au moins quatre isoMT chez le cheval (foie et rein), Klauser et al. (12) Cgalement d'au moins quatre chez le lapin (foie), alors que Hunziker et Kagi (1 3) identifient cinq iso- formes humaines (foie) et Richards et Steele (14) en dCnom- brent trois chez le porc (foie et rein) et deux chez le rat (foie).

Cependant, au-dela de cette variabilite ccnaturelle>> parfois importante du nombre d'isomCtallothionCines, des Ccarts d'ordre mCthodologique divisent toujours les auteurs. Les mCthodes classiquement employCes pour sCparer les isoMT sont celles b a s ~ e s sur les diffkrences de charges Clectriques induites par les variations de structure primaire : Clectro- phorkse, chromatographie d'Cchange d'ions (15). Mais une sub- stitution de quelques amino-acides n'induira pas toujours une diffkrence de charges Clectriques telle qu'elle puisse permettre une skparation efficace des isoformes (10). Cette limitation semble toutefois pouvoir &tre levCe par l'utilisation d'une autre technique chromatographique, la chromatographie liquide sur phase non-polaire. Elle conduit gCnCralement B de bien meilleu- res rCsolutions et permet de montrer la prCsence d'isoformes supplCmentaires non dCtectCes par les mkthodes ccclassiques, (12, 16). Par exemple, Richards et Steele (14) identifient deux isoMT dans le cytosol de foie de porc par Cchange d'ions (DEAE-SCphadex A 25), mais en isolent trois sur une colonne de phase non-polaire (RP C18). Enfin, l'emploi d'une m&me mCthode de sCparation ne constitue pas encore B ce jour une garantie de similitude de rbultats. Bien qu'ils utilisent des methodologies trks voisines (m&me type de colonne, m&mes solvants d'Clution) pour Ctudier la MT extraite du rein de cheval, Richards et Steele (14) et van Beek et Baars (17) n'aboutissent B des rksultats que difficilement comparables. Au-delB du nombre de pics observCs (respectivemeit sept et trois), les chromatogrammes prksentent des morphologies fort diffkrentes. Les conclusions ne peuvent donc qu'&tre partielles.

Les divergences sur l'existence voire sbr la possibilit~ d'existence de formes dimkres et (ou) polymkres de MT sont Cgalement importantes. En rCalitC, fort peu de travaux font men-

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TABLEAU 1. Concentrations en cadmium et en zinc de chaque mCtal- lothionkine

Cd ( Zn Cd + Zn MT (mol g-I) (rnol g-') (mol g-')

RL - M 7641 74,O 1 20,34 94,35 lot 20H9650

RL I - M 5267 62,72 17,44 80,16 lot 90H9600

RL I1 - M 5392 64,14 15,30 79,44 lot 79F95 10

HK - M 4766 44,12 26,OO 70,12 lot 4 1 H9505

tion de MT dimCristes et encore moins de formes polymCrisCes. En 1977, Webb etEtienne (18) observent dans des MT extraites de foie de rat et de lapin qu'une petite proportion du cadmium apparait associCe i des composCs protkiniques de poids molCcu- laires supCrieurs - non dCterminCs - i ceux des MT. 11s pensent que ces composCs sont des polymkres de MT, formCs par des liaisons S-S intermolCculaires. Suzuki et Yamamura (19) suggkrent Cgalement la prCsence dans le foie de lapin de dimkres de MT dont les liaisons S-S peuvent Etre rompues sous l'action d'un agent rkducteur. Cet important travail ne prCsente cependant aucun aspect quantitatif. Langston et Zhou (20) identifient chez le bivalve marin Littorina littorea deux mCtalloprotCines Cd-BPI et Cd-BPII aux caractCristiques sem- blables i celles des MT et dont les poids molCculaires (PM) sont d'un rapport 2. 11s envisagent ainsi la possibilitk que l'un des composCs (PM = 20 000 D) soit la forme dimkre de l'autre (PM = 10 000 D), mais n'avancent aucun argument. On pourra encore citer Suzuki et al. (16) qui, en 1983, font mention, sans plus de prCcision, de la prCsence de MT dimCrisCes dans le foie de caille du Japon et de la grenouille Xenopus laevis mais de leur absence chez le rat (foie et rein).

ConsidCrant tous ces rCsultats parfois contradictoires, il nous a paru nCcessaire d3entreprendreune Ctude chromatographique systkmatique des seules MT actuellement disponibles, celles commercialistes par Sigma et que certains auteurs utilisent dCji comme ccrCfCrences,, sans que toutes leurs caractkristiques soient encore bien connues. Pour ce travail, deux types de sCparation ont CtC utilids, la chromatographie d'exclusion stCrique et celle sur phase non-polaire. De nouvelles caractCri- stiques de ces MT sont ainsi rCvC1Ces : proportion de forme dimkre, nombre d'isoformes dominantes.

MatCriel et mCthodes Echantillons et re'actifs

Les quatre MT CtudiCes proviennent de la firrne Sigma (Saint Louis, EUA) et sont extraites soit de foie de lapin (RL lot 20H9650, RL I lot 90H9600 et RL I1 lot 79F9515) soit de rein de cheval (HK lot 41H9505). RL I et RL I1 sont les isoformes de RL obtenues par sCpa- ration ccclassique,, (Cchange anionique). Leurs concentrations rnCtal- liques (Cd et Zn) figurent dans le tableau I. Les solutions mttres de MT (1000 rng L-I) sont prCparCes dans des solutions tampon de phosphate de sodium (voir ci-dessous) et conservCes i 4°C. Eau (Alltech) et acC- tonitrile (Merck) sont de qualit6 chromatographique, les sels minCraux Ctant ccpro analisi),.

Appareillage et mode ope'ratoire Le systttme chrornatographique (Kontron, Ziirich, Suisse) se com-

pose d'une pompe HPLC 420, d'un rnCIangeur de solvants GF 425,

d'un injecteur automatique HPLC 360 avec une boucle d'injection de 100 FL et d'un dCtecteur UV 430 h double longueur d'onde. L'en- semble des opkrations, ainsi que le traitement des donnCes (intkgration des pics) sont contrblks par le systttme informatique Data System 450-MT.

Exclusiotz ste'rique : Clution isocratique sur une colonne Bio-Sil SEC 125 (300 x 7,8 rnm, Bio-Rad) avec une solution tampon de phosphate (Na2HP0, 0,15 M, NaH,PO, 0,04 M, NaCl0,15 M, pH = 7,15) ii un dCbit de 0,5 rnL rnin-l.

Phase non-polaire : elution sur une colonne Bio-Sil CIS HL 90-5s (150 x 4,6 mm, silice ii greffes octadCcyle C,,, Bio-Rad) en mode binaire linCaire A-B (A : tampon phosphate Na,HPO, 0,01 M, pH = 7,O; B : acktonitrile), 3-20% B en 30 min j. un dCbit de 1.3 mL rnin-I.

Les phases mobiles sont filtrCes sur des membranes Millipore de 0,22 Fm et continuellement dCgazCes ii 1'hClium. Les pics sont dCtectCs ii 250 nm (absorbance due aux thiolates mCtalliques Cd-S et Zn-S) et h 280 nm (dCtection ctnCgativez : absorbance faible due ii l'absence d'acides aminCs arornatiques). Sauf spCcification, les resultats ex- pos& ci-dessous se rapportent i la detection ii 250 nm. Toutes les expCriences dkcrites sont rCalisCes i tempCrature ambiente (-20°C).

Les concentrations mCtalliques sont dCterminCes par spectromCtrie d'absorption atomique sur un Perkin Elmer 5000, muni d'un four de graphite HGA-400 et d'un Cchantillonneur automatique AS-40.

Rbultats et discussion Chromatographie d'exclusion ste'rique

Afin de dCterminer le poids molCculaire (PM) de chaque MT, la colonne a d'abord CtC calibrCe au moyen d'un mClange stan- dard (Bio-Rad) contenant les protCines suivantes : thyroglobu- line (PM = 670 000 D, tR = 11,28 min), IgG (PM = 158 000 D, tR = 12,62 rnin), ovalbumine (PM = 44 000 D, tR = 14,63 rnin), myoglobuline (PM = 17 000 D, tR = 16,98 min) et cyanocobal- amine (PM = 1350 D, tR = 21,54 rnin). La rCpCtabilitC de la sCp- aration a CtC vCrifiCe en injectant cinq fois de suite le mClange de prottines. Pour chacun des temps de rktention, le coCfficient de variation (c.v.) est inferieur i 1,5%. La rCsolution (R) de chaque pic est excellente ( l , 2 < R < 3,3). On a obtenu la droite de calibration suivante :

o~ tR est le temps de rktention en minutes, pour un intervalle d'application en PM slCtendant de 1000 i 700 000 D. Chaque mCtallothiontine a ensuite CtC chromatographiCe cinq fois. ~ e s chromatogrammes obtenus sont montrCs sur la figure 1. Leur morphologie est semblable avec un pic dominant t l u t vers 17,60 min prCcCdC d'un pic d'absorbance beaucoup plus faible t l u t vers 16,40 rnin (c.v. < 1%). Le tableau 2 rassemble les temps de rCtention des deux pics et les poids molCculaires cor- respondants pour chacune des MT. Les pics 1 et 2 (pic princi- pal) coi~espondent respectivement i ]'elution de molCcules de PM de 21 000 i 22 000 D et 11 000 D (c.v. < 6%).

Ce poids molCculaire moyen de MT d'environ 11 000 D s'accorde parfaitement aux valeurs classiquement dtterminkes par cette technique chromatographique, 1'Ccart avec la valeur obtenue i partir de la structure primaire (6000-7000 D) ttant attribut i la forme non globulaire de cette mCtalloprotCine (21). Le petit pic, PM double de celui des MT, pourrait donc provenir de l'tlution des dimkres des MT formts par des liaisons S-S intermolCculaires. Ces produits Ctant purlfi~s, cette hypothkse seule parait envisageable.

L'Cchange thiol-disulfure est un mCcanisme chimique ayant une fonction fondamentale au niveau biologique (22) :

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-100.00 1 1 15.00 20.88

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FIG. 1. Profils d'tlution des mttallothiontines en exclusion sttrique. Dttection UV j. 250 nm (conditions exptrimentales dans le texte). (a) RL CyT=200 rng L-' (1.83 x M); (b)RLI CMT= 150 mg L-I (1.39 x 10" M); (c)RLII CMT= 150 m g ~ - ' (1,33 x l0;'M); (d)HK CMT= 150 mg L- (1,40 x M). Unitt en ordonnte : 1000 mV sur l'enregistreur correspondent i 0,005 unitts d'absorbance pleine tchelle.

RSH + XSSX + RSSX + XSH

RSH + RSSX + RSSR + XSH

Cette reaction est ainsi classiquement utilisee pour rkduire les liaisons S-S protkiniques. Les dimkres de MT devraient donc &tre rkduits par un thiol tel que le 2-mercaptokthanol. La figure 2 montre le chromatogramme de RL avant (2a) et aprks (2b) l'addition de mercaptokthanol (0,5% vlv, 80°C pendant 10 min). On observe effectivement une quasi-disparition du premier pic parallklement B une augmentation du pic principal. Un rksultat identique est obtenu pour les trois autres MT. Le taux moyen de rkcupkration (aire du pic aprks rkductionlsomme des aires des deux pics avant rtduction) est de 102% (?4%, n = 13), pour l'ensemble des quatre MT. I1 y a donc une rkponse

spectrophotomktrique identique des deux espkces. L'excks de rkducteur (PM = 78,13) est logiquement tluk quelques minutes aprks la MT.

Chaque MT a kt6 chromatographike une dizaine de fois B des concentrations (CMT) comprises entre 10 et 200 mg L-' afin d'ktudier d'une part, la linearit6 entre le signal UV et la concen- tration et d'autre part, l'kvolution du rapport entre les deux pics. Pour chaque MT, on a Ctudi6 la linkarit6 de l'aire du premier pic (S,) et de celle du second pic (S2) en fonction de CMT en mg L- . Les droites ainsi obtenues (r > 0,996) sont caractkriskes par les pentes rassemblkes dans le tableau 3. Deux importantes con- clusions peuvent d6ji &tre tirkes. Premikrement, pour chaque MT, l'excellence des corrklations de S, et S2 = f(CMT) montrent que le taux de dimkres est indkpendant de la concentration totale en MT. Deuxikmement, les diffkrences qui existent entre

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TABLEAU 2. Temps de ritention (t,) et poids moliculaires (PM) des deux esptces correspon- dant aux deux pics obtenus par chromatographie d'exclusion sttrique des MT

Pic 1 Pic 2

MT t , (min) PM (D) t, (min) PM (D)

TABLEAU 3. Pentes des droites ccaire du premier pic S,n et ccaire du second pic S2" en fonction des concentrations totales en MT (en

mg L-I)

Pentes (mV min mg-' L)

min

FIG. 2. Chromatogramme de RL en exclusion sttrique avant (a : -) et aprts (b : ---) addition de 2-mercaptoCthano1. CMT = 200 mg L-' (1,83 x M). Unit6 d'ordonnte : cf. figure 1.

les rapports de pentes (S2 =f(CMT)/SI =f(CMT)) indiquent claire- ment que le taux de dimkres varie d'une MT B l'autre : plus ce rapport sera ClevC, plus le taux de dimkrisation de la MT con- sidCrCe sera faible. On peut donc dCj2 Ctablir la skquence dCcroissante suivante pour les taux de dimkres : RL I1 > RL > RL I > HK.

Estimation du pourcentage molaire de dimbres : la formation du dimkre (D) B partir du monomkre (M) de chaque MT rCsulte de la rCaction (simplifite) 2M + D. Pour une concentration molaire totale en MT, nous avons CMT = C, + 2C,, oii CM est la concentration molaire en monomkres et C, celle en dimbres. Pour chaque chromatogramme, on peut exprimer l'aire des pics comme suit : S, = a D C D et S2 = aM.CM, ou a, et a, sont les adsorptivitks molaires respectives du dimkre et du monomkre. Par ailleurs, on peut poser a, = 2aM, pour tenir compte du fait que la rCponse du dCtecteur est la m&me pour le monomkre et pour,le dimkre. De toutes ces Cquations, on tire CM = 2CD(S2/ S,). A titre d'exemple, le tableau 4 rassemble les dCtails de cal- cul de S,/S,, de C,, de CM et du pourcentage de dimkres pour la mCtallothionCine RL. On constate une trks bonne reproductibil- it6 du rapport S2/Sl et de la proportion de dimkres (c.v. = 33%).

Le tableau 5 regroupe les valeurs moyennes des pourcentages molaires de dimkres de chaque MT. On constate bien que, d'une MT B I'autre, la proportion molaire de protCine dimCrisCe est variable, allant de 5% pour HK a environ 15% pour RL 11. On

MT SI =ACMT) s2 = A ~ M T ) Wa

RL 4,84 f 0,52 16,88 + 0,69 3,49 RLI 2,56 + 0,18 14,78 f 2,56 577 RL I1 4,64 f 0,50 13,50 + 1,39 2.9 1 HK 2,44 f 0,89 17,32 + 1,65 7,lO

"Rp est le rapport des pentes S, =flCMT)/S, =f(CMT).

notera Cgalement que RL I1 a un taux de dimkres double de celui de RL I, RL Ctant dans une situation intermkdiaire. La nature (structure primaire) d'une MT intervient donc dans son degrC de dimkrisation.

De ce modkle, il dCcoule Cgalement que la pente de la droite S, =f(C,) devrait &tre double de celle de S2 = f(CM). Les pentes de ces droites ( r > 0,997) sont rassemblkes dans le tableau 6. Pour chaque MT, le rapport des pentes Cvoque est bien Cgal B 2, confirmant ainsi le modble propost.

L'examen des absorbances 2 280 nm renforce ces conclu- sions. Dans cette zone, contrairement aux disulfures (22), les thiolates n'absorbent pratiquement plus. Dans notre cas, bien que faible, cette absorbance reste mesurable pour chaque pic. Le tableau 7 regroupe les rapports S2/S, B 250 et B 280 nm des quatre MT. Celles ayant les plus faibles taux de dimkres (RL I et HK) montrent la plus grande diminution de ce rapport. On en dCduit que la riduction d'absorbance entre 250 et 280 nm affecte beaucoup plus le second pic (monomke) que lepremier (dimkre). La prCsence de liaison(s) S-S explique donc proba- blement cette absorbance relativement plus grande du premier pic B 280 nm.

Tous ces ClCments militent donc pour la thkse de la dimkrisa- tion partielle des MT CtudiCes.

~ t a n t donnC que I'absorbance a250 nm est due aux thiolates mttalliques Cd-S et Zn-S, il nous a semblC inttressant de con- sidCrer Cgalement S1 et S2 en fonction de (Cd + Zn). Les pentes correspondantes sont rassemblees dans le tableau 8. I1 existe un Ccart non nCgligeable entre les pentes de la sCrie RL, RL I, RL I1 d'un cGtC et celle de HK de l'autre, ceci Ctant probablement explicable par les caractkristiques mCtalliques diffkrentes de HK. Par rapport aux trois MT RL, elle a en effet une concentra- tion totale en metal plus faible tout en ayant une proportion de Zn assez supCrieure (tableau 1). Tout ceci s'accorde bien avec les rCsultats des Ctudes spectrophotomCtriques menCes sur ces m&mes MT (23).

Nous avons dCjB mentionnt que la RL (13,1% de dimbres) est en rCalitC un ccmClangen des deux formes RL I (7,5% de dimkres)

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TABLEAU 4. Rapport des aires des deux pics (S,/S,) 2i 250 nm, concentrations en dimtres (CD) et en monomtres (CM) et pourcentage molaire de dirntres corre-

spondants, calculCs pour differentes concentrations totales de RL

c~~ CD c~ Dimtre M) s,/s, ( 1 o - ~ M) M) (% molaire)

1,833 3,46 1,833 3,41 1,833 3,lO 1,833 3,21 1,371 3,38 0,914 3,34 0,73 1 3,32 0,640 3,O 1 0,457 3,38 0,183 2,93 0,137 3,69 0,09 1 3,52 0,09 1 3,44

Moyenne 3,32 f 0,17

TABLEAU 5. Pourcentage molaire de dimtres de chaque MT

MT % de dirntre n

TABLEAU 6. Pentes des droites ccaire du premier pic S,B en fonction de la concentration en dimtres, ccaire du second pic S,D en fonction de la concentration en monomtres et rapports de pentes (dimtresl

monomtres) correspondants

Pentes de S =f(Q (x108) (mV min M-I)

MT s1 =f(c~) s 2 = f ( c ~ ) Rp"

RL 4,75 t 0,33 2,37 f 0,13 2,OO RL I 3,73 f 0,38 1,87 f 0,21 1,99 RL I1 4,07 f 0,42 2,02 f 0,25 2,O 1 HK 4,26 t 0,35 2,12 f 0,22 2,Ol

'Rp est le rapport de pentes S, =AC,)/S, =AC,).

TABLEAU 7. Variation (6) de rapport des aires des deux pics (S,/S,) de 250 2i 280 nm pour chaque MT

MT S,IS, (250 nm) S,IS, (280 nm) 6 (%) n

RL 3,32 f 0,17 1,90 t 0,50 -43 13 R L I 6,24 f 0,44 2,55 t 3,35 -59 8 RL I1 2,77 f 0,20 1,39 2 0 , l l -50 12 HK 8,93 f 1,35 2,76 f 0,3 1 -69 8

et RL I1 (15,3% de dimkres). Les taux moyens de dimkres que nous venons de determiner doivent donc permettre de calculer la proportion respective de chacune des deux isoformes (x% de RL I et y% de RL 11) de RL i I'aide du systkme suivant :

TABLEAU 8. Pentes des droites ccaire du premier pic S,)) et ccaire du second pic S2" en fonction de la sornme des concentrations metal-

liques de chaque MT

Pentes (mV min M-') (x106)

MT S, = f(Cd + Zn) S, =f(Cd + Zn)

RL 5,11 t 0,55 17,86 f 0,72 RL I 3,19 t 0,21 18,42 f 2,28 RL I1 5,83 f 0,38 17,OO t 1,14 HK 3,47 k 1,33 24,64 f 2,49

On obtient ainsix = 28% (+4%) de RL I et y = 72% (+ 11%) de RL 11.

En 1982, Geller et Winge (24), sur la base des travaux de Kagi et Vallee (3, 4) et de Tsunoo et al. (25) entre autres, Ccri- vaient que les mCtallothionCines ne contenant pas de cuivre, c'est-i-dire celles induites par cd2' ou zn2+, ne contenaient que des cystkines rkduites (sous forme de thiolates de cadmium et (ou) de zinc). Nos rksultats semblent donc devoir infirmer cette assertion. I1 a effectivement bien CtC montrC que la presence de cuivre, in vivo ou in vitro, conduisait i la formation de liaisons S-S intramolCculaires (16, 26). Cependant, Webb et Etienne (18) expliquent la prCsence de MT (extraites de foie de lapin et de rat) polymCrisCes par la perte partielle de zn2+, moins forte- ment complexC que cd2' (3), suivie de la formation de liaisons S-S intermolCculaires. Des auteurs comme Minkel et al. (27) considkrent que la polymCrisation des MT ne serait que le rCsul- tat de l'oxydation des MT survenue au cours de leur extraction. Or, plusieurs auteurs travaillant sur les MT extraites de mol- lusques marins comme l'huitre Crassostrea virginica (28, 29) ont pu montrer que l'origine Ccologique (Ccosystkme) avait une influence sur la prCsence ou non de forme dimkre : les huitres de Caroline du Nord (EUA) posskdent les deux formes MT 10 et MT 20 (nomenclature faisant rCfCrence aux poids molCcu- laires respectifs de 10 et 20 kD), celles provenant de la Baie de Chesapeake ou de zones plus nordiques d'AmCrique du Nord, soumises au m&me procCdC d'extraction, ne possCdant que la forme monomkre MT 10. La forme dimkre n'est donc assurC- ment pas le rksultat du mode opCratoire utilisC pour l'extraction des MT.

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I -300.00 t I I

10.00 15.00 20.00 rnin. I -300.00 ' I I I

10.00 15.00 20.00 rnin

-200.00 I I I

I I -200.00 ' 1 8 I

10.00 15.00 20.00 rnin 10.00 15.00 20.00 rnin FIG. 3. Profils d'klution des mCtallothionkines en chromatographie sur phase non-polaire. DCtection UV ?I 250 nm (conditions expkrimentales

dans le texte). (a ) RL CMT = 130 mg L-' (1,19 x M); (b) RL I CM, = 100 mg L-' (9,23 x lo4 M); (c ) RL I1 CM, = 100 mg L-' (8,87 x M); (d) HK CMT = 100 mg L-' (9,35 x lo4 M). Unitk d70rdonnCe : cf. figure 1.

Chromatographie sur phase non-polaire Livrons-nous h une ktude comparative des quatre chromato- Les chromatogrammes-types obtenus pour chaque MT sont

reprksentks sur la figure 3. Bien que les morphologies soient diffkrentes, on peut ntanmoins dCgager plusieurs caractCris- tiques communes : (i) tous les pics sont CluCs entre 12 et 21 min, soit par une phase mobile contenant entre 10 et 15% d'acktoni- trile; (ii) les pics sont toujours trgs bien skparks (R > 1, sauf pour les pics 2 et 3 de RL oh R = 0,7, figure 3a); (iii) la reproduct- ibilitk des temps de rktention de chaque pic est excellente (c.v. < 1% pour 10-15 skparations B diffkrentes concentrations entre 50 et 180 mg L-I), de mCme que celle du signal UV (somme des aires des pics 2s) (c.v. compris entre 1 et 7%).

grammes. Le tableau 9 rassemble les temps he rktention des principaux pics de chaque MT. On peut en tirer les conclusions suivantes : (i) un seul pic est cccommun>> aux quatre MT, celui Cluk B 15,30 minutes, soit par une phase mobile contenant 11,7% d'acktonitrile; (ii) le pic secondaire de HK (2 14,30 min) est propre B cette molkcule : on ne le retrouve pas dans la sCrie RL; (iii) la superposition des chromatogrammes de RL I et de RL I1 conduit, en termes de nombre de pics et de temps de rkten- tion, B un nouveau chromatogramme qualitativement semblable B celui de RL (figure 4). 11 semble donc probable que les deux premiers pics de RL soient attribuables B RL 11, que le troisibme

ConsidCrons B prksent chaque chromatogramme skparkment. le soit 2 RL I et que le quatrigme provienne d'une double con- La RL se separe en sept pics, dont quatre dominants et trois de tribution. moindre importance. La morphologie de RL I est trks diffkrente L'ordre d'Clution (valeurs des facteurs de capacitk k') des dif- et relativement simple : deux pics largement dominants fkrentes isoformes depend de leur composition en acides entourks de trois a quatre petits pics. RL I1 se compose de trois aminks. Le caractere plus ou moins hydrophobe de chaque isoformes principales et de deux B trois autres formes de moin- amino-acide dttermine son facteur de capacitC sur une colonne dre importance quantitative. Enfin, la HK montre un pic de phase non-polaire (30). Nos rCsultats montrent une Clution prkpondkrant (pic n02 de la figure 3d), un pic secondaire (pic plus rapide de RL I1 que de RL I, celle-ci devant donc Ctre plus nOl) et deux B trois pics mineurs. hydrophobe. En 1979, Kimura et al. (31) dkterminaient la struc-

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1244 CAN. J. CHEM

TABLEAU 9. Temps de rttention des principaux pics de chaque MT chromatographike sur phase non-polaire. La structure du tableau scht-

matise la position relative des diffkrents pics de chaque MT

MT t , des principaux pics (min)

rnin FIG. 4. Superposition des chromatogrammes en phase non-polaire

de RL I et de RL I1 (C,, = 100 mg L-'). A comparer quulitutivenlent i la figure 3a. Unit6 d'ordonnke : cf figure 1.

ture primaire des formes I et I1 de la RL. La principale dif- fCrence rCside en la prCsence dans RL I d'arginine et parfois de leucine, deux acides aminks plus hydrophobes que leurs substi- tuts dans RL I1 comme la sCrine. La RL I est sCparCe en deux pics principaux (figure 3b). Or, toujours selon les m&mes auteurs. il existerait une variante de cette MT dans laauelle une sCrine serait substituCe par une leucine, ce qui devrait induire une diffkrence notable de comportement chromatographique. I1 a dCj& CtC montrC (32, 33) que les facteurs de capacitC de pep- tides contenant jusqu'g unk vingtaine d'acides aminks, pou- vaient se calculer en additionnant les facteurs de capacitC des acides aminCs constitutifs. Au-del& de 20 amino-acides, ce calcul devient plus spkculatif, le comportement chromato- graphique des longues chaines peptidiques dCpendant Cgale- ment de leurs structures secondaires et tertiaires. I1 peut nCan- moins fournir une bonne approximation. Pour tout ce qui suit, nous insistons sur le fait que nous ne procCdons qu'5 des esti- mations de 1'hydrophobicitC relative des diffkrentes isoformes, sachant pertinemment que les Cchelles d'hydrophobicitC d'acides aminks dont nous disposons ont CtC Ctablies sur des phases non-polaires et avec des phases mobiles diffkrentes des notres.

Par rapport & la structure primaire de RL 11, celle de RL I varie de la manikre suivante, + 1 Glu, + 1 Arg, - 1 Ser et - 1 Ala.

publiCs par Grushka et al. (30), ou selon les paramktres d'hydro- phobicitC dCterminCs par Parker et al. (34), une augmentation du caractkre hydrophobe de RL I, donc de son temps de rCten- tion. C'est bien ce que l'on observe, avec tR RL I > tR RL Si on substitue dans RL I une sCrine supplCmentaire par une leucine (tR ,,, %- tR Ser), on devrait assister 2 une nouvelle augmentation du caractkre hydrophobe et avoir tR RL I(Leu) > tR RL I(Ser) > tR RL II.

Sur le chromatogramme de RL I, le premier pic (tR = 13,74 min) pourrait donc correspondre & la forme ccsCrine,, et le second (tR = 15,28 min) & la forme ccleucine>>. Cette hypothkse reste naturellement a vCrifier. Pour RL 11, seule la structure primaire globale est connue. La sCparation de RL conduit donc & l'ordre suivant (selon les tR indiquCs dans le tableau 9) : RL I1 (2 iso- formes non identifikes) - RL Is,, - RL I,,,.

Kojima et al. (11) ont publiC en 1976 la structure primaire de HK-A et de HK-B, les deux isoMT obtenues par sCparation anionique classique de HK. Les compositions moyennes mon- trent que HK-A auraient deux variantes sCrinelleucine. Par rap- port & RL I,,,, et en se basant sur les Cchelles d'hydrophobicit6 dCj& citCes (30,32-34), l'isoforme HK-A,,, (+1 Pro, +3 Gly, +1 Val, +1 Arg, - 1 Asp, -2 Ala, - 1 Ile, -2 Lys) ne devrait voir son caractkre hydrophobe que fort peu varier, ce qui Cquivaud- rait & des temps de rCtention trks proches. Nos chromato- grammes montrent que le pic principal de HK et celui de RL I,,, ont le m&me tR = 15,3 min. On estime Cgalement de la m&me manikre que la variante sCrine HK-A,,, serait moins hydrophobe que RL I,,, et aurait donc un temps de rktention plus faible que celui de RL I,,, et de HK-A,,,. Cette isoforme HK-A,,, doit donc correspondre au premier pic de HK 2 14,3 min. Enfin, on peut Cgalement estimer le caractkre hydro- phobe de HK-B (- 1 Pro, +2 Val, +2 Thr, +2 Ala, -2 Gly, +1 Gln, - 1 Arg, +1 Lys) comme Ctant plus faible que celui de HK-A,,,. On devrait alors avoir tR HK.B < tR HK-ASer. Soit un pic qui devrait sortir & un tR < 14,3 min, mais qui est absent de notre chromatogramme. Le lot de HK CtudiC dans ce travail semble donc correspondre 2 l'isoforme pure HK-A.

La 1inCaritC de la rCponse UV en fonction des concentrations en MT et en mCtal a CtC CtudiCe pour le signal total (ZS) et pour celui du pic cccommun,,, pic toujours le mieux rCsolu (S,, aire du pic commun). Les pentes des droites obtenues (r > 0,991) sont rassemblCes dans le tableau 10. Compte tenu des incertitudes et suite au traitement statistique classique effectuC, on peut estimer que les pentes cctotales,> ne different pas significative- ment les unes des autres, & l'exception de celle de HK calculCe par rapport & la concentration en MT, notablement plus faible. Cette dernikre apparait bien diffkrente des trois RL. Les pentes du pic cccommun,, S, = f(CMT) et S, = f(Cd + Zn) varient assez fortement, reflCtant la contribution relative de cette isoforme & chacune des MT. HK montre ainsi des pentes nettement plus ClevCes que celles de la sCrie RL. Ces valeurs de pentes per- mettent alors de calculer, par rapport aux pentes totales, que les isoformes CluCes 2 15,30 minutes reprksentent 70,0% de la HK (c'est & dire 70% de variante <<leucine>>), 21,1% de la RL, 29,5% de la RL I et 18,8% de la RL 11.

Concernant la sCrie MT RL, on dCduit de ces chiffres une par- ticipation inkgale des formes RL I et RL I1 & la RL globale. S ix et y sont respectivement les proportions de RL I et de RL I1 dans RL, on peut alors Ccrire :

Cette variation devrait provoquer, selon les k' d'acides amin6s

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TABLEAU 10. Pentes des droites ccsomrne des aires des pics CSn et ccaire du pic commun SCn de chaque MT s6parCe sur phase non-polaire, en fonction des concentrations en MT et

en m6taux

Pentes (mV min M-') (X 10')

MT C S =f(C,,) sc =A%,) C S = ACd + Zn) Sc = ACd + Zn)

RL 38,57 + 8,25 8,12 + 1,30 6,28 + 1,34 1,32 f 0,21 RL I 40,45 + 1,95 1 1,95 + 0,65 7,78 + 0,39 2,29 + 0,13 RL I1 43,96 + 10,9 1 8,25 ? 1,04 8,52 + 2,46 1,60 + 0,21 HK 25,78 f 6.04 18,3 1 + 5,OO 5,66 + 1,33 4,02 f 1,10

On aboutit ainsi 5 21% (25%) de RL I et a 79% ( 2 14%) de RL 11. Ces rCsultats confirment ceux obtenus prCcCdemment a partir des pourcentages de dimbres, A notre connaissance, aucun tra- vail quantitatif de cet ordre n'avait encore, k ce jour, CtC publiC. En 1987, Richards et Steele (14) ne faisaient que mentionner que l'isoforme la plus abondante de la RL Ctait une sous-espkce de la RL 11. Plus globalement, travaillant, entre autres, sur les MT-RL et MT-HK, ces m&mes auteurs obtenaient des chro- matogrammes fort semblables pour ces deux molCcules : deux pics dominants et quatre k cinq pics mineurs. Notre travail mon- tre ainsi que le polymorphisme de la mCtallothionCine extraite de foie de lapin (RL) est en fait nettement plus complexe. Pour la HK, nos rCsultats s'apparentent davantage.

Conclusion L'utilisation de la chromatographie d'exclusion stCrique et de

la chromatographie sur phase non-polaire avec dCtection UV nous a permis de mieux caractCriser les quatre mCtallo- thiontines RL, RL I, RL I1 extraites du foie de lapin et HK, extraites du rein de cheval. On a ainsi pu montrer que : (i) les quatre MT sont partiellement dimCrisCes (pourcentage molaire de forme dimkre : 5-15%); (ii) la RL, composCe de RL I et RL I1 sCparables par tchange d'ions, apparait constituCe de quatre iso- formes dominantes, alors que la HK ne se sCpare qu'en deux isoformes; (iii) RL I et RL I1 se subdivisent Cgalement en deux et trois sous-espbces respectivement; les deux pics de RL I cor- respondent essentiellement 5 une substitution ~Crinelleucine; (iv) globalement, RL I et RL I1 contribuent respectivement pour 20-30% et 70-80% de RL; (v) le lot de HK ne semble contenir que la forme HK-A, dont environ 70% de sous-espbce conte- nant de la leucine.

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