B u l l . SOC. Chim. Belg. vo1.85/n012/1976

CONTRIBWION DES CALCULS QUANTIQUES A L'ELUCIDATION

DE LA STRUCTURE EN SOLUTION DE L'ACIDE RIBONUCLEIQUE DE TRANSFERT

PAR LES TECHNIQUES DE LA RMN

B. PULLMAN

I n s t i t u t de Biologie Physico-Chimique Laboratoire de Biochimie Theorique

associe au C.N.R.S. 13, rue P. e t M. Curie - 75005 Par is -

RESUME - Les spectres RMN de haute resolution des acides ribonucleiques de t r a n s f e r t (tARN) pre-

sentent dans l 'eau une s e r i e de resonances comprises en t re -11 e t -15 p.p.m. qui sont a t t r i - buIs aux protons U-N H e t G-N H impliqUes dans l e s l i a i sons hydrogene en t re l e s paires de bases. Les positions3des r6sofiances sont les resul tantes des valeurs "intrins8ques" caracte- r is t iques des paires A-U e t G-C isolees e t de leur perturbation sous l ' e f f e t d'empilement due essentiellement aux courants n de bases. Les calculs quantiques de ces e f f e t s on t per- mis l 'ass ignat ion des resonances observees aux pa i res de bases specifiques e t on t a i n s i con- tribu6 d'une fason decisive I 1'6lucidation de l a s t ruc ture secondaire e t t e r t i a i r e des tAPN en solution.

I. INTRODUCTION

Les raisons qui m'incitent I presenter dans ce &moire ce fragment p a r t i c u l i e r de ma con-

ference pleniere au 7.5 Collcque de Chimistes Quanticiens d'Expression Latine sont doubles.

D'une par t , j e voudrais i n c i t e r l e s chimistes quanticiens, un peu t rop centres peut-&re s u r

l e s problemes des spectrosmpies u l t rav io le t te e t v i s ib le , I etendre leur champ d'action. En

par t icu l ie r , l a resonance magnetique nucleaire (RMN) qui e s t aujourd'hui un des o u t i l s prin-

cipaux de l a chimie e t biochimie s t ruc tura les , me p a r a i t n'avoir a t t i r e que relativement peu

d ' in te r6 t de l a par t des chimistes theoriciens. Deuxiemement, a ceux qui s ' in te r rogent e t

nous interrogent sur l a s ign i f ica t ion pratique des calculs de l a chimie quantique, j e vou-

d r a i s indiquer sur un exemple que j e c ro is assez spectaculaire l e r61e dec is i f que peuvent

prendre de t e l s calculs dans l a solution d'un probleme experimental mmplexe, de grande actua-

lit&. Cet exemple j e l e prendrai dans l e domaine de l 'e lucidat ion de l a s t ruc ture en solut ion

des acides ribonucleiques de t ransfer t (W).

11. LE PROBLEME

L'elucidation de la s t ruc ture secondaire e t t e r t i a i r e des acides ribonucleiques de trans-

f e r t , par t ic ipants a c t i f s essent ie l s dans les processus de synthese de proteines , e s t un des

probl.5mes centraux de l a biologie mol6culaire actuel le . De tres nombreux r e s u l t a t s exp6ri-

mentaux ont d te obtenus durant ces dernieres annees par des etudes aux rayons X en ce qui

- 925 -

concerne l a s t ructure c r i s t a l l i n e de ces composes ( ' ) . Tuutefois, l ' i n t e r l t pr incipal de l a

biologie moleculaire concerne p l u t d t l a s t ruc ture de ces comps4s en .solution et durant ces

dernieres annees de t res nombreux travaux ont 6th consacres d ce probl&re, l a technique prin-

cipale u t i l i s e e &ant l a resonance nucleaire magnetique de haute resolut ion (voir par exemple

2-14).

+ on

t C

I Bmr de 7 I'aminoacidc

p 0. . I 1

I 1 0..

I : 0. .

0 . .

!.l

Bms 1 1 du hU ,-u,t'; B ~ s du T I C

Y'R'A , 0. . -..A

i, r-m-R-Y, O-O-O-O-G, R G.G.A r-.. ' T, Ur.6 : b-o-?-G 'o-~-e-o-C'~ I . . . . .

.... I I 0.. .. 0 . 0 variable 7.7 .-...) Bmr

*\.,. b u r de

I'anticodon Bmr de

I' anticadon

B M S variable

Figure la - Structure en " f e u i l l e de t r & f l e " dQS mFX. b - Structure en "L" des tARN.

J e rappelle dans l a f igure l a d'une facon schematique l a s t ruc ture gBn6rale de t e l s

acides (les d e t a i l s en d i f fe ran t selon l a nature de l ' ac ide amin6 concern€). E l le e s t mnnue

sous l a designation de " feu i l le de t r s f l e " e t comprte dans c e t t e representation essent ie l -

lement quatre "bras" pr inc ipaw e t t r o i s "boucles" pr incipales (+ un p e t i t bras e t boucles

d i t e s "variables"). Les bras sont m n s t i t u e s par l e s pa i res de bases puriques e t pyrimidi-

ques couplees e t superposees en hel ice , l e s boucles par des bases non couplees. En f a i t , des

couplages en t re des bases appartenant aux bras 00 boucles d i f fe ren ts produisent une s t ruc ture

t e r t i a i r e qui &me d ces acides dans le c r i s t a l me forme en L i l l u s t r e e dans l a f igure lb

oil chaque branche de c e t t e l e t t r e represente une hel ice continue.

Le p r o b l h e de l a s t ruc ture en solut ion (dans l 'eau, solvant biologique par excellence)

forme d'une exploration tendant d Otabl i r jusqu'd quel peut e t e s t en general p s 6 sous

p i n t l a s t ructure cristallographique e s t conservee ou modifiee par l e solvant. La question

centrale e s t l a conservation ou l a non conservation du muplage des bases par l i a i son hydro-

l a

- 926 -

gene e t ensui te c e l l e de leur superposition en hel ices , ces caracter is t iquen determinant l e s

elements essent ie l s de l a s t ructure secondaire e t t e r t i a i r e des tARN.

L'out i l pr incipal pour une t e l l e determination e s t la RMN de haute resolution, sur tout

depuis que Kearns, Shulman e t

majorite des resonances protoniques, observees dans l e s spectres des tRRN dans l a region en t re

-11.5 e t -15 p.p.m. sont dues aux protons des paires A-U e t G-C fa i san t p a r t i e des cycles des

bases e t impliquees directercent dans l e s l i a i sons hydrogPne. Ce sont l e s protons at taches

respectivement a N3 de l ' u r a c i l (U-N,H) e t 1 N1 de l a guanine ( G N I H ) (Fig. 2 ) . Les spectres

leurs collaborateurs (2-14) on t m i s en evidence l e f a i t que l a

Figure 2. - Paires de bases A-U e t G-C.

experimentaux des tARN presentent une s e r i e de resonances dans ce domaine, provenant des

differentes paires des bases couplees, l a d ivers i te des resonances &ant due a l a d ivers i te

de positionnement de ces pa i res au se in de ces acides. La f igure 3 presente 1 t i t r e d'exemple

l e spectre RMN du E. coli ~ A R N ~ ~ ( 1 3 ) .

E

I 1 I 1 1 I

- 14 -12 -1 0

Figure 3. - Spectre RMN du E. coli tARNTrp (13)

- 927 -

L'emplacement observe de resonances e s t l a resul tante de deux e f f e t s contraires . D'une

par t , l a formation meme d'une l ia i son hydrogene entre l e s bases s'accompagne d'un diplace-

merit des risonances U-N H e t G-NIH vers les champs bas par rapport d l eur posi t ion dans l e s

molecules separees (15124). L'origine de c e t e f f e t e s t due sur tout d un e f f e t de champ(25).

D'autre par t , l a superposition ver t ica le des h-ses ou de pai res de bases produl t un deplace-

ment de ces mbes resonances vers l e s champs hauts (voir par exemple 14 e t 26,27) par suite

de l ' e f f e t d ' icran dP

(29). La grandeur de ces derniers deplacements depend naturellement de l 'o r ien ta t ion mutuelle

des bases ou paires de bases impliquies. L a f igure 4 presente schematiquement l ' a l l u r e e t

l'ampleur du phenomene.

principalement (bien que pas uniquement) ('*) au courant II des bases

-11.5

Risononces dons les bases libres

G - N , H Z-10.5

s -11.0 T-N3H \

diplacement vem le champ bible lam de

Rironances dans les de bases e m p i l k

A- T - 14.5 % -14.6

Figure 4. - Origine des resonances dans le domaine -11 d -15 p.p.m. du

U-N-,H e t G-N1H.

Le p r o b l h e avec lequel sont confront& l e s experimentateurs ayant obtenu un spectre

RMN d'un tARN dans l a region concernee e s t de pouvoir effectuer une a t t r ibu t ion des resonan-

ces observees I des paires de bases specifiques. En e f f e t , seule une t e l l e a t t r ibu t ion per-

met t ra i t de rendre compte de la s t ruc ture secondaire e t t e r t i a i r e des U R N en solut ion e t

en par t icu l ie r de comparer c e t t e s t ruc ture avec c e l l e des a s acides dans l e c r i s t a l .

111. LA CONTRIBUTION DE LA THEORIE A LA SOLUI'ION DU PROBLSME.

L'experience seule ne p a r a i t pas pouvair ou tou t au moins n'a pas reussi jusqu ' ic i B

risoudre ce p r o b l h . En revanche, l a th6orie a pu apporter dans ce domaine une CUntribUtiOn

decisive qui a f a i t que ce problame a pu &re t r a i t € avec succes pratiquement des q u ' i l a i t 6

- 928 -

pose. Aujourd'hui l a s t ruc ture en solut ion d'un grand nombre des tARN e s t dans ses grandes

l ignes Gterminee, l e s & r i t e s en revenant a l a contribution decisive de l a theorie pour

l ' in te rpre ta t ion des spectres RMN de ces acides.

Le probl&oe theorique au depart e s t double. 11 s ' a g i t en premier l i e u de determiner ce

que s e r a i t l a position de l a resonance de U-N H e t G-N H dans des paires des bases complemen-

t a i r e s AU e t GC i so lees , non soumises a l ' e f f e t d'empilement (resonance " intr insMue") . I1

n 'ex is te pas de renseignemmts experimentaux a ce s u j e t , l e s bases l i b r e s ayant dans l ' eau

une tendance de s ' assoc ier par empilement v e r t i c a l p lu td t que par l i a i sons hydrogene (voi r

par exemple 30, 3 1 ) . Une f o i s ce renseignement de depart obtenu, il s ' a g i t de determiner

jusqu'a quel point ce deplacement de resonance vers l e champ fa ib le par l a formation des

l ia isons hydrogene e s t cornpens6 par un deplacement vers l e champ haut sous l ' e f f e t de l'em-

pilement de ces paires dans l e s par t ies hel icoidales de l ' A R N , &ant entendu que ce second

e f f e t e s t essentiellement vari'able d'une pa i re a l ' a u t r e en fonction de l a nature e t de l ' a r -

rangement mutuel des bases e t pa i res des bases superposCes.

questions. En ce qui concerne l a premiere nous venons d'evaluer treS recemment (32) l e s va-

leurs du deplacement vers l e champ bas des reronances de U-N,H e t G-NIH sous l ' e f f e t de l a

formation des paires de bases A-U e t G-C, fournissant a i n s i l ' information directe sur l a va-

leur des resonances intrins&ques de ces protons. En ce qui concerne l a d e u x i h e , Giessner-

Pre t t re e t Pullman ont

bases des acides nucleiques l e s deplacements chimiques devant se produire sous l ' e f f e t du

courant n d e ces bases pour des protons des molecules voisines s e trouvant dans d i f fe ren tes

regions d'un plan s i t u e a 3 . 4 A au-dessus (ou au-dessous) du plan de l a base pr i se en consi-

deration ( l a distance de

l e s acides nucleiques). Etant donne l'importance his tor ique de ces courbes, nous l e s repro-

duisons i c i dans l a f igure 5 pour l e s quatre bases pr incipales , tout en s ignalant que ces travaux ont €te aujourd'hui etendus a toutes l e s dis tances ver t ica les jusqu'a 7 ( 3 3 ) e t

qu'ont 6 t e egalement Bvaluees l e s contributions des facteurs complementaires t e l s que l ' e f f e t

d'anisotropie atomique ou "locale" (28) .

3 1

Aujourd'hui une reponse directe peut &re fournie par l a theorie quantique a ces deux

BvaluC d8s 1970 (") des courbes d ' isoecran indiquant pour chacune des

3 . 4 A e s t l a distance moyenne habi tuel le d'empilement de bases dans

Toutefois, il peut 6 t r e interessant de s ignaler qu'au moment oii l e s experimentateurs se

SOnt trOuv8s confront& pour l a premiere f o i s avec l e probleme de l ' i n t e r p r e t a t i o n de spectres

RMN des tARN (vers 1973) seuls 6 ta ien t connus d'eux nos r e s u l t a t s concernant l e s courbes

d'isoecran pour l e deplacement chimique dues a l'empilement des bases. I1 leur manquait donc

l e renseignement primaire mncernant l e s resonances "intrinseques" de U-N3H e t G-N H dans l e s

paires des bases non perturbees. (En r e a l i t 4 ce renseignement e x i s t a i t dans une Note aux

Comptes Rendus publiee par nous en 1970 (25) mais qui e s t passee inaperpue des experimenta-

teUrS). En fa i san t appel a des experiences ingenieuses sur des modeles oligonucleotidiques,

des experimentateurs ont reuss i a determiner indirectement c e t t e donnee manquante en s e ser-

vant pour ce la de nos donn6es theoriques sur l e s courbes d'isoecran. Le pr incipe du procede

e s t l e suivant (voi r par exemple 2 3 ) . Considerons un deoxyoligonucleotide (11-13) d-ADTDGD

1

C A T qui en solut ion dans l ' eau forme une double P P

_ _ _ hel ice auto-complBmentaire :

A T G C A T .P:P:P:P:P: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T A C G T A P P P P P

- 929 -

I 1 i H

Figure 5. - Courbes d'isodeplacement chimique pour des protons s e trouvant B 3.4 A au-dessus (ou au-dessous) du plan des bases (29) .

En spectroscopie RMN c e t t e he l ice presente dans l e champ bas t r o i s resonances B -13.35, -13.8

-12.7 P.P.m. correspondant de toute evidence aux t r o i s

une

lors de l ' i l eva t ion de

indiqud. en commenpant par c e l l e a -13.35 p.p.m e t terminant par c e l l e a -12 p.p.m, indiquant

par 1.3 l a dissolut ion progressive des pai res de bases.

de pa i res de bases pr isentes :

pai re A-T terminale, une pa i re A-T in te r ieure e t une pa i re G-C centrale . Par a i l l e u r s ,

l a temperature ces resonances disparaissent ("fondent") dans l 'o rdre

Les informations thermodynamiques que l 'on possede s u r l e s s t a b i l i t e s re la t ives des

paires de bases (voir par exemple 34, 35) permettent d'affirmer sans grand risque d 'erreur

que dans l e cas qui nous interesse, l a plus durable des resonances doi t appartenir B l a p a i r e

G C , que l a resonance de pers is tance intermediaire doit appartenir d l a pa i re A-T i n t i r i e u r e

e t que l a resonance qui d i spara i t l a premiere doit carac tdr i ser l a pa i re A-T terminale. Les

frequences a i n s i assignees resu l tan t evidemment de l a combinaison des e f f e t s dus B l a forma-

t ion des l ia i sons hydrogene e t de ceux dus a l'empilement. Neanmoins, l 'ass ignat ion &ant

f a i t e , si l 'on adopte pour l a double hel ice m e s t ructure determinee, disons c e l l e du B-ADN,

dont l e s caracter is t iques g i o d t r i q u e s sont connues, on peut a l o r s evaluer, grace a nos cour-

bes d'isoecran, quel le s e r a i t pour l e s d i f fe ren ts types de pai res de bases presentes l a a m p -

- 930 -

sante du &placement chimique

nous l ' indiquons dans

vers l e champ haut due 1 l'empilement. Ainsi par exemple come

l a p a r t i e superieure de l a f igure 6 ce deplacement 6valu6 theoriquement

Ditermination de friquences <'intrin&ques')

DGplacement vers le champ Risonance Paire de Risonance ,, effct de eintrin&que*

Observe' I ' empilement de bases bases

G - C -12.7 - 0.9 -13.6

A-T int. -14.6

Cas de A - T terminal

A-T term. -13>\ r%zce -

divergence d w -13.9 a %-aying* - 14.6

Figure 6. - Wtermination semi-empirique des resonances intr inssques.

s e r a i t de 0.9 p.p.m. pour l a pa i re G-C e t 0.8 p.p.m. pour l a paire A-T. A p a r t i r de c e t t e

donnee on peut a lors prevoir, par soustract ion, quel le s e r a i t l a valeur de resonance " in t r in-

s&que" des paires isolees ( f i g . 6 ) : e l l e s e r a i t de13 .6 p.p.m. pour l a pa i re G-C e t de -14.6

p.p.m. pour la paire A-T. Bien que d i f fe ren ts auteurs u t i l i s a n t d i f fe ren ts exemples trouvent

des valeurs legsrement d i f fe ren tes , e l l e s sont toutes dans l'ensemble t res proches des valeurs

prdcitees.

Le cas de l a paire A-T terminale e s t special e t montre l e s precautions q u ' i l convient

de prendre dans ce genre de t rava i l . En e f f e t , l e deplacement vers l e champ haut, dCi a l'empi-

lement, &value pour c e t t e pa i re , e s t de 0.07 p.p.m.. Combine A l a valeur intrinsSque de l a

resonance de l a paire A-T f ixee plus haut a -14.6 p.p.m., il conduit 1 prevoir pour c e t t e

paire une resonance s i tuee vers -13.9 p-p-rn. (Fig. 6 ) . Or l a resonance exHrimentale e s t a -13.35 p.p.m.. La divergence n'infirme en f a i t nullement l a th lor ie ; e l l e e s t due au phenomene

de "fraying" de l a paire t e m i n a l e qui consis te essentiellement en son decouplage p a r t i e l .

Q u o i q u ' i l en s o i t , les resonances "intrinssques" des paires A-T (ou A-U, e l l e s ne SOnt

pas supposees Ctre tres differentes) f ixees , e t comme nous l 'avons vu f ix6es en bonne p a r t i e

grace a l a contribution de l a theorie , il e s t a lors a i s e , t o u t au moins en principe, de deter-

miner l e s resonances previs ibles pour l e s d i f fe ren tes pa i res de bases d'un tARN, en calcu-

- 931 -

l a n t pour chaque paire l e deplacement prevu vers l e champ haut sous l ' e f f e t du courant II des

paires de bases ou des bases adjacentes e t en u t i l i s a n t pour cela l e s murbes de l a f igure 5 ,

I condition naturellement d'avoir adOpt6, pour l ' e d i f i c e une g 6 o d t r i e appmpriee. La g6om6-

t r i e adoptee e s t en general c e l l e de l ' h e l i c e A ou A'-ARN.

Tableau I. - Attribution des resonances dans l e spectre RMN

de E. c o l i tRNATrP

Posi t ion observee Resonance Intensi te Position

prevue Paire

A 0.8 14.68 14.8 A14- (S4)U8

D

E

B 0.8 14.40 13.8 A412

A 4 3 1

13.4 -53

1.0 13.82 14.2

1.0 13.80 13.8 '-'52 1.0 13.42

1.0 13.30 13.30 A-U1

1.0 13.24 13.25 G-C30 1.0 13.20 13.15

1.0 13.12 13.15

1.0 13.06 12.75

1.0 12.83 12.80 G-CZ

Dc6 1.0 12.76 12.70

1.0 12.74 12.65

1.0 12.69 12.65 G-C4

C

=5 t e r t i a i r e

G-C2 7

GC3

1.0 12.67 12.65 G-C49

12.55 GC7

1.0 12.53 12.50 G-ClO F 1.0 12.36 12.40 G-c5 1

G-c2 8

1.0 12.58

1.0 12.23 12.20

1.0 12.11 12.20 G-c29 G

H 1.0 11.82 - u protege (prob. U33)

I 13 1.0 11.49 11.50 G-C

Le pro&d€ s 'avere extrCmement eff icace. I1 conduit I une ident i f ica t ion de l 'apparte-

nance de chaque resonance e t grosso mod0 a permis d ' e t a b l i r que l a s t ruc ture des tARN en solu-

t ion est tr& sensiblement identique I c e l l e observee dans l e s cr is taux correspondants, bien

que cer ta ines differences s ign i f ica t ives paraissent s e manifester Bgalement. A i n s i , par exem-

ple , a lors que l e s cr is taux de cer ta ins tRNA paraissent comporter des paires de bases non usuelles, en par t icu l ie r G-U, couplds par l i a i sons hydrogene, ce couplage ne p a r a i t pas se

conserver en solution (voir par exemple 12) .

I (13). 11 concerne l e ~ R N A ~ ~ dont l a s t ruc ture e s t indiquee dans l a f igure 7. On peut cons- t a t e r que dans l'ensemble l 'accord en t re l e s previsions theoriques e t l e s observations expe-

rimentales e s t excel lent , l ' e c a r t entre l e s deux 6 tan t en general in fer ieur 0.1 p.p.m. qui

Un exemple de l a cornparaison de l a theorie e t de l 'exp6rience e s t donne dans l e tableau

- 932 -

A I C

C

G

I 1 C * G I I

G * C I I

SOG C a

Figure 7. - wTT.

represente l a precision meme des mesures. Dans l a pratique tou t n ' e s t pas auss i simple naturel-

lement que dans ma presentation schematique e t l ' a t t r i b u t l o n de cer ta ines resonances necessi te

une discussion plus serree ( c ' e s t l e cas par exemple de l!inversion des a t t r ibu t ions pour l e s

paires A-ulZ e t A-U31 dans 1s Tableau I ) . Toutefois, ces d e t a i l s techniques e t autres , quelque

s o i t leur importance, sont en dehors du but de ce t a r t i c l e . Les lecteurs interesses p u r r o n t

en trouver l a presentation dans l e s memoires originaux.

Le procede d e c r i t i c i e t qui f a i t si largement appel i l a contribution de l a chimie

quantique represente actuellement l e myen essent ie l pour l a determination de l a s t ruc ture en

solution des tARN. A ce jour il a ete u t i l i s e dans de nombreux laboratoires , pour plusieurs

tARN di f fe ren ts (2-15).

En plus de sa s ign i f ica t ion d i rec te pour ce probl&ue, l a contribution de l a theorie a des

repercussions indirectes pour tou t un ensemble de p r o b l a e s qu 'eclaire l ' a t t r i b u t i o n des reso-

nances RMN a des

t ion suivre dans l e s d e t a i l s l e changement de s t ructure moleculaire d'un tARN sous e f f e t de

l a chaleur, l a d i spar i t ion progressive des resonances avec 1'Blevation de l a temperature pou-

vant &re r e l i e e a l a dis1oca:ion des pa i res determinees (par exemple 9.24) . De mbe, l ' e f f e t

de cations

mes de cwrdinat ion avec des s i t e s bien d6terminLs (par exemple l o ) . Pareillement, l'observa-

t ion des modifications produites dans l e spectre par interact ion avec des agents d ' interca-

lement, t e l par exemple l e bromure d'ethidium (36'37), permet de loca l i se r avec precision l e s

paires de bases specifiques des tARN. Ainsi on peut grace a c e t t e a t t r ibu-

par exemple Mg++ sur l e spectre RMN des tARN peut a i n s i Ctre interpret6 en t e r -

- 933 -

sites de l ' in te rac t ion . O n a pu par e x e m p l e determiner de cette f a p o n glle l e site d ' interca-

lement de cette substance qu i est un i m p o r t a n t agent antiviral e t ant ibacter ien, dans tRANPhe

se situe au niveau des paires AU6 e t AU7 (36).

L e domaine de l a RMN des acides ribonucleiques de transfert n ' e s t pas le seul dans le-

quel nos courbes d'isoecran des bases puriques e t pyrimidiques ont trouv6 un usage extrsmement u t i l e . I1 e n est de meme pour d 'autres p r o b l e m e s analogues comme par e x e m p l e l ' in tercalement

de l'actinomycine e t d 'autres agents dans les helices doubles (38-43), la c o n f o r m a t i o n des

c o e n z y m e A (53) etc. oligo- e t ply-nucl6ot ides ( p a r exemple 44-50) , des c o e n z y m e s d'oxydo-reduction (51-52) r du

BIBLIOGRAPHIE

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