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CRef biotechnologies – 2004/2005 – Marc GENSSE Mise en évidence des constituants organiques de la matière vivante sur un liquide biologique : le lait – Durée : 3H I. Objectifs : Les constituants organiques de la matière vivante sont : glucides, lipides, protides et acides nucléiques (= le matériel génétique). Durant cette séance, nous mettrons en évidence 3 de ces constituants de la matière vivante. Il s'agit donc d'un TP d'introduction sur la mise en évidence des composés organiques, montrant la diversité et la complexité de la matière vivante au niveau moléculaire, venant juste après la caractérisation des minéraux dans la matière vivante. Les objectifs annexes sont : o Utilisation de la verrerie de laboratoire. o Sensibilisation aux dangers dans le labo de Biochimie et à la toxicité des réactifs. II. Matériel et réactifs Réactifs Répartition Noter Acide acétique 1/10 Flacon de 5 mL/binôme Acide acétique Soude 40 % Flacon de 10 mL/élève Soude concentrée Acide nitrique concentré 2,2 mol/L Flacon de 100 mL avec distributeur automatique sur 1 mL Acide nitrique concentré Liqueur de Fehling Flacon de 5 mL/binôme Liqueur de Fehling Sulfate de cuivre 1% Flacon de 10 mL/élève Sulfate de cuivre Lait entier Une brique de lait entier Lait entier Matériel Quantité/élève Eprouvette de 100 mL 1 Erlen de 150 mL 1 Becher de 150 mL 1 Pipette jaugée de 20 mL + propipette 1 Pipette graduée de 1 mL + propipette 1 Pipette graduée de 5 mL + propipette 2 Gaze pour filtration 1 Spatule 1 Tube à essai en verre de 10 mL + portoir 3 Pastettes (compte-gouttes) 4 Distributeur de 1 mL pour la solution d'acide nitrique concentré 1 pour la classe Lame + lamelle 1 Microscope 1 Bec Bunsen 1 par binôme

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CRef biotechnologies – 2004/2005 – Marc GENSSE Mise en évidence des constituants organiques de la matière vivante sur un

liquide biologique : le lait – Durée : 3H

I. Objectifs :

• Les constituants organiques de la matière vivante sont : glucides, lipides, protides et acides nucléiques (= le matériel génétique).

• Durant cette séance, nous mettrons en évidence 3 de ces constituants de la matière vivante. Il s'agit donc d'un TP d'introduction sur la mise en évidence des composés organiques, montrant la diversité et la complexité de la matière vivante au niveau moléculaire, venant juste après la caractérisation des minéraux dans la matière vivante.

• Les objectifs annexes sont : o Utilisation de la verrerie de laboratoire. o Sensibilisation aux dangers dans le labo de Biochimie et à la toxicité des réactifs.

II. Matériel et réactifs

Réactifs Répartition Noter Acide acétique 1/10 Flacon de 5 mL/binôme Acide acétique

Soude 40 % Flacon de 10 mL/élève Soude concentrée Acide nitrique

concentré 2,2 mol/L Flacon de 100 mL avec distributeur

automatique sur 1 mL Acide nitrique concentré

Liqueur de Fehling Flacon de 5 mL/binôme Liqueur de Fehling Sulfate de cuivre 1% Flacon de 10 mL/élève Sulfate de cuivre

Lait entier Une brique de lait entier Lait entier

Matériel Quantité/élève Eprouvette de 100 mL 1 Erlen de 150 mL 1 Becher de 150 mL 1 Pipette jaugée de 20 mL + propipette 1 Pipette graduée de 1 mL + propipette 1 Pipette graduée de 5 mL + propipette 2 Gaze pour filtration 1 Spatule 1 Tube à essai en verre de 10 mL + portoir 3 Pastettes (compte-gouttes) 4 Distributeur de 1 mL pour la solution d'acide nitrique concentré

1 pour la classe

Lame + lamelle 1 Microscope 1 Bec Bunsen 1 par binôme

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III. Technique/Manipulation/Mode opératoire 1. Mise en évidence des lipides du lait

• Le lait frais laissé au repos se recouvre rapidement d'une couche de crème. Observer une goutte de lait entre lame et lamelle à l'objectif x 10 du microscope. 2. Mise en évidence des protides du lait

• Etape de défécation Dans une éprouvette graduée de 100 mL, mettre 20 mL de lait. Ajouter 65 mL d'eau, transvaser dans une fiole d'Erlenmeyer. En agitant, verser goutte-à-goutte de l'acide acétique au 1/10 (20 à 30 gouttes) jusqu'à l'obtention de grumeaux. - Attention - Danger - Port de lunettes obligatoire - Laisser reposer quelques minutes. Mélanger à nouveau et filtrer dans un Becher.

• On peut ensuite réaliser sur le précipité 2 réactions de caractérisation des protides :

o La réaction du biuret Dans un tube à essai, mettre environ la moitié du précipité. Ajouter 5 mL d'eau et 5 mL de soude à 40 % - Attention - Danger - Port de lunettes obligatoire - Mélanger. Ajouter goutte-à-goutte une solution de sulfate de cuivre à 1% en agitant.

o La réaction xanthoprotéique Dans un tube à essai, mettre le reste du précipité. Ajouter 1 mL d'acide nitrique concentré à l'aide du distributeur automatique. - Attention - Danger - Port de lunettes obligatoire – Faire chauffer doucement pendant 1 min. Refroidir dans l'eau. Ajouter goutte-à-goutte de la soude à 40 % jusqu'au changement de couleur. 3. Mise en évidence des glucides Dans un tube à essai, mettre 2 mL de filtrat à l'aide de la pipette graduée. Ajouter 2 mL de liqueur de Fehling. Faire chauffer doucement jusqu'à ébullition. - Attention - Danger - Port de lunettes obligatoire - IV. Exploitation pédagogique

• Mise en évidence des lipides du lait o Conclure sur la densité des lipides et leur solubilité dans l'eau. o Observations – Interprétations d'une goutte de lait au microscope à l'objectif x10 :

dessins ramassés en fin de séance et notés. Question : sous quelle forme les lipides se trouvent-ils dans le lait ? Réponse : Introduire la notion de globules gras que l'on pourra développer avec la nécessité de l'homogénéisation du lait frais (= casser les globules gras) dans de nombreux process industriels comme le lait UHT entier, ce qui évite une remonté de la crème en surface.

• Mise en évidence des protides du lait o Etape de défécation

Décrire la nature du danger rencontré : danger chimique – Notion d'acide fort. Explication du rôle de la défécation dans de nombreux dosages biochimiques. Défécation = précipitation des protéines permettant d'avoir des solutions limpides et donc possibilités de dosages colorimétriques.

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o La réaction du biuret Décrire la nature du danger rencontré : Dangers chimiques : NaOH 40% = Notion de base forte et concentrée. Sulfate de cuivre II = Nocif en cas d'ingestion. Irritant pour les yeux et la peau. Danger biologiques : toxique pour les organismes aquatiques, les ions cuivre sont toxiques même en-dessous de 1 mg/L pour les poissons, les algues, les protozoaires et les bactéries. Observations – Interprétations de la réaction du biuret : En milieu alcalin, les ions Cu2+ forment avec les protéines un complexe cuivrique violet rose caractéristique des liaisons peptidiques. Les acides aminés simples et les dipeptides ne forment pas de composé coloré en présence de CuSO4. Deux liaisons peptidiques sont en effet nécessaires à la réaction..

o La réaction xanthoprotéique Décrire la nature du danger rencontré : danger chimique – Notion d'acide fort et concentré. Observations – Interprétations de la réaction xanthoprotéique : C'est une réaction de nitration des noyaux cycliques ou hétérocycliques (Tyr, Trp, Phe) des acides aminés. Si l'extrait testé contient des protéines, il se forme un précipité blanc en présence de HNO3. Porter à ébullition pendant 1 minute, le précipité devient jaune et se dissout totalement ou partiellement pour donner une solution jaune. Après refroidissement et alcalinisation par NaOH ou NH4OH, la coloration devient orangée. Comparaison des 2 techniques de détection des protéines : elles sont tous les 2 positives mais ne donnent pas exactement les mêmes informations.

• Mise en évidence des glucides o Décrire la nature du danger rencontré :

Danger thermique : risque de projection. Dangers chimiques et biologiques car la liqueur de Fehling contient du sulfate de cuivre II, KOH et NaOH.

o Observations – Interprétations : apparition d'un précipité rouge brique si présence de sucres réducteurs, ce qui permet d'introduire le sucre du lait = le lactose puis de son goût ⇒ tous les "sucres" n'ont donc pas forcément un goût sucré. Rem : la notion de sucres réducteurs sera abordée par la suite lors de l'étude des glucides.