DFGSM3 - CM1 – 2012/2013

DFGSM3 - CM1 – 2012/2013

Rôle des techniques spéciales dans:

-la démarche diagnostique

- l’évaluation du pronostic des maladies

- les choix thérapeutiques (notion de biomarqueur)Pr Laurence LAMANT

Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques

CHU PURPAN

[email protected]

UE Biopathologie Tissulaire

Techniques spéciales

- Colorations histochimiques- Histoenzymologie

- Microscopie électronique

- Immunohistochimie

- Biologie moléculaire in situ et non in situ


- Colorations histochimiques- Histoenzymologie


- Immunohistochimie

- Biologie moléculaire in situ et non in situ

Ziehl

Perls

Fontana

Rouge Congo

PAS

PAS

Trich Masson

But ?1/Mettre en évidence des constituants particuliers dans les cellules ou dans la

matrice extracellulaire 2/Mettre en évidence des agents infectieux

Les colorations les plus courantes

Coloration Principales substances colorées

PAS Glycogène, mucines neutres, champignons

Bleu Alcian Mucines acides

Rouge Congo Amylose

Perls Hémosidérine (fer ferrique)

Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines

Trichrome de Masson Collagène

Ziehl BAAR

Grocott Champignons, certains parasites

Intêrét des colorations spéciales

dans la démarche diagnostique ?

Réaction de Ziehl: mycobactérie




Rouge Congo Amylose



Trichrome de Masson

Collagène

Ziehl BAARGrocott Champignons, certains

parasites

Patient immunodéprimé, lésions des doigts et avant bras droit

Réaction de Ziehl: mycobactérie




Rouge Congo Amylose



Trichrome de Masson

Collagène

Ziehl BAARGrocott Champignons, certains

parasites

Patient immunodéprimé, lésions des doigts et avant bras droit

Coloration du PAS: Candida Albicans




Rouge Congo Amylose



Trichrome de Masson

Collagène

Ziehl BAAR


Cas cliniqueMme TIB…, 38 ans, atteinte d’une leucémie et ayant subi une greffe de moelle osseuse, présente une défaillance multiviscérale. Biopsie hépatique.

AspergillosePAS





Rouge Congo Amylose




Ziehl BAAR


Substances pathologiques: -par leur présence (agent pathogène)

Mr DA…Etienne né le 7/1/1955

• Renseignements cliniquesPatient consultant pour ascite et œdème des membres inférieurs. Examen biologique: augmentation discrète des transaminases

Hypothèses ?

• Insuffisance cardiaque (ou obstacle sus-hépatq)

• Insuffisance rénale, syndrome néphrotique• Cancer (mésothéliome, carcinose, CHC,

méta hépatique, cancer gynécologique si Femme…)

• Cirrhose (1ère étiologie en France)

Ascite


• Renseignements cliniquesPatient consultant pour ascite et œdème des membres inférieurs. Examen biologique: augmentation des transaminases

Biopsie hépatique


Diagnostic ?

Trichrome de Masson

CIRRHOSE

Trichrome de Masson Foie

Normal





Rouge Congo Amylose




Ziehl BAAR


Substances pathologiques: - par leur présence - par leur abondance (Subst. normales en quantité

anormale)





Rouge Congo Amylose




Ziehl BAAR


•Substances normales en situation attendue

Coloration du Bleu Alcian sur cellules caliciformes mucisécrétantes de la muqueuse intestinale

Coloration de Fontana sur naevus naevocellulaire

cutané

Peu utile !

Tissu sain

Tumeur maligne différenciée

d’origine glandulaire =

Adénocarcinome bien différencié

Tissu sain

Coloration peu utile !

Adénocarcinome bien

différencié

Tissu sain


différencié

Tumeur maligne peu différenciée

Tissu sain


différencié

Tumeur maligne peu différenciée

Coloration très utile !

Adénocarcinome peu différencié

S’agit-il d’une tumeur : Différencié

e Indifférenciée

Les deux Je ne sais

pas

POINTS

S’agit-il d’une tumeur :

Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas

Carcinome malpighien

Adénocarcinome

Mélanome

LymphomeTumeurs malignes différenciées:

ressemblent au tissu normal dont elles

dérivent


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas

Tumeurs malignes indifférenciées: pas de ressemblance avec

un tissu normal

Nécessité de colorations spéciales

?????

Adénocarcinome peu différencié

Fontana

Tumeur pulmonaire maligne peu différenciée

Métastase pulmonaire

d’un Mélanome





Rouge Congo Amylose




Ziehl BAAR


Substances pathologiques: - par leur présence

- par leur abondance - par leur situation (Subst. « normales » en situation

anormale)

Mr RO…Damien né le 5/6/1938

• Renseignements cliniquesPatient ayant un antécédent de mélanome

Mélanine

Pas de Mélanine

Mr RO…Damien né le 5/6/1938

• Renseignements cliniquesPatient ayant un antécédent de mélanome. Consulte pour des troubles du transit amenant à une coloscopie qui met en évidence une lésion polypoïde suspecte. Biopsie sous endoscopie:

Adénocarcinome colique bien différencié

Coloration du Bleu Alcian, inutile dans

ce contexte

Mr RO…Damien né le 5/6/1938• Renseignements cliniques

Patient ayant un antécédent de mélanome. Consulte pour des troubles du transit amenant à une coloscopie qui met en évidence qui met en évidence une lésion polypoïde suspecte. Biopsie : adénocarcinome colique bien différencié

Biopsie hépatique d’une de ces lésions

Pourquoi ?

Métastase du mélanome ou du carcinome colique ?

Traitement totalement différent

Bilan d’extension (TDM)

Autre lésion (bénigne, maligne…)?

Examen microscopiqueLa carotte biopsique adressée qui mesure 20 mm montre un parenchyme

hépatique dont l’architecture normale est détruite par une prolifération tumorale. Elle est constituée d’amas cellulaires sans architecture particulière. Les cellules sont atypiques, fréquemment en mitose.

Foie normal péritumoral

Nodule

Tumeur maligne peudifférenciée/indifférenciée

Foie normal péritumoral

Comment aller plus loin ?

Pas de glandePas de mélanine

HEHE Pas de kératine

Métastase du mélanome ou du carcinome colique ?

Autre tumeur ?

PEAU

COLON

Foie

Discrets dépôts de Mélanine

invisibles sur HE? Présence d’une mucisécrétion?

Métastase du mélanome ou du carcinome colique?

Examen microscopiqueLa carotte biopsique adressée qui mesure 20 mm montre un parenchyme

hépatique dont l’architecture normale est détruite par une prolifération tumorale. Elles est constituée d’amas cellulaires sans architecture particulière. Les cellules sont atypiques, fréquemment en mitoses. La coloration du Bleu Alcian met en évidence des vacuoles de sécrétion au sein de certaines cellules. La coloration de Fontana est négative.

Bleu Alcian

Métastase hépatique de l’adénocarcinome colique

Chimiothérapie adaptée à un adénocarcinome colique métastatique

• Renseignements cliniquesPatiente sans antécédent particulier qui a consulté pour épilepsie et chez qui est découverte une tumeur cérébrale unique. Exérèse. Tumeur primitive? Métastase?

Mme F.. Née en 1970

Pas de glandePas de mélaninePas de kératine

Examen microscopiqueIl s’agit d’un parenchyme cérébral siège d’une prolifération tumorale maligne

d’architecture diffuse, ne formant pas de structure glandulaire, sans pigment identifiable sur la coloration de routine. Pas de signe de kératinisation. Les cellules sont très atypiques, fréquemment en mitoses. Les caractéristiques de cette tumeur n’évoquent pas une tumeur primitive. Cependant, la coloration du Bleu Alcian ne met pas en évidence de vacuoles de sécrétion; La coloration de Fontana ne met pas en évidence de mélanine.

Bleu Alcian

Diagnostic ???Tumeur primitive : non

(sur la base de son aspect cytologique,de sa bonne limitation)

Lymphome cérébral?

Autre tumeur:

Métastase de carcinome, mélanome, sarcome ?

Conservation d’antigènes des

lignées lymphoïdes, épithéliales,

conjonctives ou mélanocytaires ??Outil?

Immunohistochimie

Comment aller plus loin ??


- Colorations histochimiques

- Histoenzymologie


- Immunohistochimie- Biologie moléculaire in situ et non in situ

Immunohistochimie

1 = Antigène2 = Anticorps primaire3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase (DAB)

• Principe ?

Exemple de l’IHC

immunoenzymatique indirecte

Immunohistochimie

1 = Antigène2 = Anticorps primaire3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase (DAB)

• Principe ?

Exemple de l’IHC


Immunohistochimie • Principe général

Exemple de l’IHC


Exemple de l’IHC


Exemple de l’IHC

immunoenzymatique directe

Immunohistochimie • Objectif ?

Mettre en évidence des Ag intracellulaires ou

extracellulaires grâce à des Ac spécifiques

• Sur quel matériel ?

Immunohistochimie

• Coupes en congélation

• Coupes en paraffine (démasquage Ag)

• Examen cytologique


Immunohistochimie

• Coupes en congélation

• Coupes en paraffine (démasquage Ag)



Immunohistochimie

• Coupes en congélation • Coupes en paraffine (démasquage Ag)


Antigène cytoplasmique

HbS

Antigène nucléaire

Ki67

Antigène membranaire

erbB2

• Quels antigènes ?

• Avec quel mode de révélation ?

Immunohistochimie

• Immunoenzymatique (indirecte; peroxydase, PAL)

• Immunofluorescence (directe)

erbB2

Anti-IgG

Pemphigoïde bulleuse

Adénocarcinome sein

Coupes fixées

Coupes congelées

Coupes congelées

Coupes fixées

Immunohistochimie

Intérêt diagnostique

Intérêt

pronostique

Intérêt thérapeutique

S’agit-il d’une tumeur : Différencié

e Indifférenciée

Les deux Je ne sais

pas

POINTS

Intérêt

diagnostiqueDiagnostic des tumeurs indifférenciées


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas


un tissu normal

Nécessité de colorations spéciales Bleu Alcian

+Adénocarcinome peu différencié


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas


Différenciée

Indifférenciée

Les deux

Je ne sais pas


un tissu normal

Nécessité de colorations spéciales

Si négatives…

Bleu Alcian -Fontana -

Tumeur maligne indifférenciée

IHC

Tumeurs

Anti-CK Anti-LCA (CD45)

Anti-PS100

Carcinome

Lymphome

Mélanome

…

Tumeurs

Anti-CK Anti-LCA (CD45)

Anti-PS100

Carcinome

+ - -

Lymphome

- + -

Mélanome

- - +

…

Tumeur cérébrale

Mélanome?

Carcinome?

Lymphome?

IHC

Colorations négatives, non contributives

Ac anti-CD45

Ac anti-CK

Ac anti-PS100

• Colorations spéciales négatives• Anti-CD45 –• Anti-CK –• Anti-PS100 +

Métastase cérébrale d’un mélanome

H&E

Tumeurs Anti-CK Anti-LCA (CD45)

Anti-PS100

Carcinome + - -

Lymphome - + -

Mélanome

- - +

Anti-CD45 Anti-CK Anti-PS100

H&E Ganglion médiastinal

Mélanome?

Carcinome?

Lymphome?

Ac anti-CD45

Ac anti-CK

• Colorations spéciales négatives• Anti-CD45 –• Anti-CK +

Métastase ganglionnaire d’un carcinome peu différencié

Anti-CD45 Anti-CKH&E

Tumeurs Anti-CK Anti-LCA (CD45)

Anti-PS100

Carcinome

+ - -

Lymphome - + -

Mélanome - - +

Ag HbS

Intérêt

diagnostiqueMise en évidence d’agents pathogènes

Intérêt

diagnostiqueMise en évid. de cellules tumorales rares

Recherche de micrométastase non décelable sur H&E, par immunohistochimie avec anti-

PS100, dans un ganglion chez un patient atteint d’un mélanome

Homme 75 ans

Métastase osseuse

Intérêt

diagnostiqueMise en évid de produits spécif de tumeur

Métastase osseuse d’un adénocarcinome

Diagnostic ?

Intérêt

diagnostique

Anti-PSA

Diagnostic ?

Métastase osseuse d’un adénocarcinome PROSTATIQUE

Ganglion normalCryptes normales

Tumeur avec faible index de prolifération

Tumeur avec fort index de prolifération

Meilleur pronostic

Intérêt

pronostiqueProlifération cellulaire (Ag Ki67) Oncogènes

Intérêt

thérapeutiqueMise en évidence de cibles thérapeutiques

» * RE dans le cancer du sein» * ErbB2 dans le cancer du sein

Adénocarcinome du sein

H&E

Anti-oestrogènes (Tamoxifène)

Ac humanisé anti-ErbB2: Herceptine

ErbB2

Facteurs prédictifs de réponse

thérapeutique

RE

Ac humanisé anti-ErbB2: Herceptine

ErbB2

Immunohistochimie

CISH

Biologie moléculaire



- Histoenzymologie


- Immunohistochimie

- Biologie moléculaire - Hybridation in situ

- PCR (non in situ)



- Histoenzymologie


- Immunohistochimie


- PCR (non in situ)

• Hybridation in situ

-Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en

congélation• Sondes froides (= non radio-actives)

• Chromogéniques (CISH)

• Fluorescentes (FISH)

-Applications • Détection d’amplification génique, de translocations chromosomiques • Détection du génome de certains virus

Gène HER2 non amplifié

Gène HER2 amplifié

Adénocarcinome

mammaire

?????

Chr 17

Her2 Intérêt

thérapeutique

Biologie moléculaire• Hybridation in situ

-Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en congélation• Sondes froides (= non radio-actives)

• Chromogéniques (CISH)• Fluorescentes (FISH)

-Applications • Détection d’amplification génique, de

translocations chromosomiques

• Détection du génome de certains virus

Détection par FISH d’une fusion entre

deux gènes

Gène A Gène B

Gène de fusion

Classification OMS Translocation Gènes impliqués Fréquence (%)Intérêt diagnostique

Intérêt pronostique

Biologie moléculaire• Hybridation in situ

-Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en congélation• Sondes froides (= non radio-actives)

• Chromogéniques (CISH)• Fluorescentes (FISH)

-Applications • Détection d’amplification génique, de

translocations chromosomiques

• Détection du génome de certains virus

Sonde anti-HPV (chromogénique)

Intérêt diagnostique



- Histoenzymologie


- Immunohistochimie


- PCR (non in situ)

Anomalies géniques

-Translocations chromosomiques

Applications en anatomie pathologique

• PCR (Polymerase Chain Reaction)

Gène de fusion

Amorce A

Amorce B

Anomalies géniques

-Translocations chromosomiques

-Mutations

Applications en anatomie pathologique

• PCR (Polymerase Chain Reaction)

MutationEx: Cancer colorectal métastatique

Surexpression d’un récepteur transmembranaire à activité

TK : EGFR, dans de nombreuses tumeurs solides dont le cancer colorectal, impliqué dans la prolifération cellulaire

EGFR: potentielle cible thérapeutique dans le cancer colorectal

Gène KRAS

KRAS muté: inutile de

prescrire des anti-EGFR

Intérêt thérapeutique

Notion de biomarqueurs

• Définition: caractéristique mesurée objectivement (cad avec une précision et une reproductibilité suffisantes) et évaluée comme indicateur de processus physiologiques ou pathologiques ou de l’action d’un médicament


• Intérêt en biologie médicale: * En prévention pour identifier ou calculer

un risque ou une prédisposition pathologique




* Pour diagnostiquer une maladie dans une population





* Orienter un traitement et en assurer le suivi, mesurer la réponse au traitement, adapter la stratégie thérapeutique

• Protéines sériques (biologie hors anapath)

PSA et ADK prostate (dépistage, diagnostic, suivi, rechute)






• Protéines tissulaires, ARNm, gènes

• Protéines tissulaires (détectables par IHC)

Biopsie ganglionnaireLymphome

IHC anti-CD3 (marqueur T)

IHC anti-CD20 (marqueur B)

Lymphome B

Lymphome B

Anticorps anti-CD20

(Rituximab)

+

Chimiothérapie

conventionnelleAvant 1998

Lymphome

B

CD20Après 1998

Déplétion lymphocytes B

Mort des cellules CD20+

Biopsie ganglionnaireLymphome

I HC anti-CD3 (marqueur T)

I HC anti-CD20 (marqueur B)

Meilleur typage dulymphome

Lymphome B

Indication thérapeutique

Anticorps anti- CD20

Rituximab

La protéine CD20 est devenue

un biomarqueur

• I ntérêt en biologie médicale:* En prévention pour identifi er ou calculer un

risque ou une prédiposition pathologique



• Protéines tissulaires (détectables par IHC)

* RE, HER2 dans adénocarcinome mammaire

IHC ErbB2

La protéine erbB2/HER2

est un biomarqueur

• I ntérêt en biologie médicale:* En prévention pour identifi er ou calculer un

risque ou une prédiposition pathologique



• Gènes, ARNm (détectables par FISH, PCR)

CISH HER2

Le gène erbB2/HER2

est un biomarqueur

+/-Inhib. EGFR

Le gène KRAS est un

biomarqueur

IHCColorations

CISH/FISHH&E HIS PCR, …

Evolution de la discipline…

1852 1879 19841632 1990

Evolution de la discipline…

1852 1879 19841632 1990

I HCColorations CISH/FISHH&E HI S PCR, …I HCColorations CISH/FISHH&E HI S PCR, …

2012

Traitement à la carte des

tumeurs

Documents

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