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Dr Ghislaine Descours Laboratoire de Bactériologie, Centre de Biologie Est
DUCIV, 15 octobre 2014
Diagnostic des infections bactériennes : quelle place pour la biologie moléculaire ?
Objectifs
! Connaître le principe des techniques moléculaires • PCR universelle versus PCR spécifique • PCR en point final versus PCR en temps réel
! Comprendre le délai de rendu des résultats
! Savoir cibler une demande de PCR • Apport par rapport aux autres techniques en Bactériologie • Quand ? Quoi ? Comment ?
! Avoir un regard critique sur la prescription & les résultats
Méthodes diagnostiques en bactériologie
Culture
TROD Tests rapides à
orientation diagnostique
Biologie moléculaire
Culture
! Avantages • Examen direct préalable • Sensibilité théorique : 1 UFC • Isolement des souches
" Sensibilité aux antibiotiques " Recherche de facteurs de virulence " Typage, enquêtes épidémiologiques
• Coût limité
! Limites • Bactéries nécessitant un milieu spécifique, fragiles, intracellulaires • Bactéries à croissance lente : retard au diagnostic • Infections décapitées par une antibiothérapie préalable
TROD
! Réactions immunologiques • Tests immunochromatographiques, ELISA, agglutination,
fluorescence!
! Avantages • Délai de réalisation < 1h • Ajustement thérapeutique immédiat
! Limites • Dépendance du développement par fournisseurs • Sensibilité / spécificité • Utilisation “détournée” sur des prélèvements profonds
Biologie moléculaire
! Avantages • Bactéries à croissance lente, difficilement ou non cultivables • Non influencée par antibiothérapie / transport
! Limites • Contraintes techniques (locaux dédiés) • Délais incompressibles
• Mais développement de techniques « clés en main » " Pas de problématique de locaux ou de délais " Coût élevé
Légionellose
Culture : 4 à 10 j Milieux spécifiques Enquête épidémio.
Ag urinaire : 1h
Sensibilité : 90% L. pneumophila sg1
PCR spécifique : < 24h Détection de
toutes les espèces
Se < AgU si Lp1
Méningite à pneumocoque
Culture : 24h
Antibiogramme
Recherche d’Ag solubles : < 1h
(si ED+)
PCR spécifique < 24h Intérêt si
antibiothérapie préalable
Biologie moléculaire en pratique
Unité de Biologie moléculaire CHU, personnel dédié
PCR “maison” ou trousses commerciales
Unité conventionnelle CHG, personnel polyvalent Techniques “clés en main”
Principe des techniques moléculaires
Détection et/ou identification d’un ADN bactérien dans un prélèvement biologique
PCR spécifique
Gène amplifié ciblant une espèce, un genre, un
génogroupe bactérien!
Présomption clinique forte
Résultat : positif / négatif
en 24 h
PCR universelle
Gène commun à toutes les eubactéries :
ARN ribosomique 16S
Sans a priori sur le résultat
Identification par séquençage du produit de PCR
en 48 – 72 h
PCR réalisées au GHE !"#$ %&'($)*+,($ !-.,&/(0('1$!"#$%&'%((%) *+,&)-./) 0123)345%)'2551'6)71"17#8&19#%")
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Quel prélèvement ?
! Potentiellement tout type de prélèvement
! PCR universelle • Site initialement stérile • Pas sur les prélèvements pour lesquels il existe des seuils de
pathogénicité (urines, LBA!)
! PCR spécifique • Bactérie non commensale
" Biopsie cutanée : pas de PCR spécifique Staphylococcus " Gorge : pas de PCR Streptococcus
Quelles conditions ?
! Recueil du prélèvement • Liquide de ponction, pus, tissu, biopsie, sang! • Bannir les écouvillons • Volume " 200 µL • Sang sur EDTA (héparine = inhibiteur) • Ne rien ajouter (liquide, fixateur, milieu de transport!)
! Nombre de prélèvements • Conditions identiques à la culture
" Multiplier le nombre de prélèvement en orthopédie " Culture et PCR sur un même prélèvement
! Acheminement au laboratoire • t° ambiante, +4°C, -20°C
Du prélèvement au résultat!
Différentes étapes
Prélèvement
Lyse cellulaire + extraction d’ADN
manuelle ou automatisée Amplification
et
détection de l’ADN amplifié Séquençage
(PCR universelle) et analyse de la séquence Simultanée :
PCR en temps réel
Après : PCR en
point final
4 heures 1 série quotidienne
24 – 48 heures
1 heure Validation du résultat
10 min
3 heures
Polymerase Chain Reaction
ADN cible : 1 copie
Dénaturation
Hybridation des amorces
Elongation (dNTP, polymérase)
30 à 40 cycles
soit
230 à 240 copies
Détection de l’ADN amplifié N
ombr
e de
cop
ies
Nombre de cycles
Détection en temps réel Marqueur
fluorescent
Détection en point final
Gel migration
Cycle Seuil Cycle
threshold (Ct)
Quantité d’ADN
Détection en point final
! Gel migration des produits de PCR ! Vérification de la taille attendue
Détection en temps réel
SybrGreen™
Liaison non spécifique à l’ADN db
Spécificité par amorces et température de fusion (1/2 ADN db – # ADN sb)
Economique et facile
! Reporter fluorescent E1"3&U(%)V)
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Détection en temps réel
SybrGreen™
Liaison non spécifique à l’ADN db
Spécificité par amorces et température de fusion (1/2 ADN db – # ADN sb)
Economique et facile
Sondes spécifiques
Liaison spécifique des sondes à l’ADN db
Multiplexage (! cibles)
Coût plus élevé Développement plus délicat
! Reporter fluorescent
La PCR universelle
L’ARNr 16S
! Codé en opéron ! Nombre de copies du gènes variable en fonction de l’espèce
bactérienne (1 à 10) ! Structure et fonction conservée chez toutes les bactéries ! Pas de transfert horizontal ! Nombreuses séquences déposées dans les bases de données
L’ARNr 16S
Séquences conservées chez toutes les bactéries
Amorces
Séquences spécifiques d’un genre / d’une espèce
“Signature” après séquençage du produit
de PCR
2$$$$$$$$$$$$322$$$$$$$$$$$$422$$$$$$$$$$$$$522$$$$$$$$$$$$$622$$$$$$$$$$$$$$7222$$$$$$$$$$$$$$7322$$$$$$$$$$$$7422$$$$$7822$$$$9+$
L’ARNr 16S
Séquences conservées chez toutes les bactéries
Amorces
Séquences spécifiques d’un genre / d’une espèce
“Signature” après séquençage du produit
de PCR
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Etape 1. PCR en point final
! PCR Migration des produits de PCR
Témoin négatif
Marqueur de poids moléculaire
Témoin positif
Patients
Etape 2. Séquençage des positifs
! Technique Big Dye® Terminator
! PCR avec produit de PCR + amorce + polymérase + dNTP (3’OH) en compétition avec ddNTP* interrupteurs (3’H) : ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP Pool de brins d’ADN de taille variable
! Purification du produit de PCR ! Électrophorèse capillaire
Etape 2. Séquençage des positifs
! CTTGCACTGC ! CTTGCACTGCG ! CTTGCACTGCGA ! CTTGCACTGCGAT ! CTTGCACTGCGATT ! CTTGCACTGCGATTA ! CTTGCACTGCGATTAC
Séquence ARNr 16S : CGATTAC
Chromatogramme
Etape 3. Comparaison avec une base de données = alignement de la séquence
! Le Bibi PQB • BioInformatic Bacterial Identification Prokaryote Quick Identification • https://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibiPQP/lebibiPQP.cgi
• Incrémentée tous les 3 mois (GenBank) • Informations contrôlées (espèce) : DSMZ database
Etape 4. Interprétation des séquences
Identification de genre si > 97 % Identification d’espèce si > 99 % Prevotella spp
(T : sequence type, TT : strain type, GenBank ID)
Un abcès pulmonaire stérile en culture
> 99% avec S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. porcorum, S. hyointestinalis
Un abcès pulmonaire stérile en culture
> 99% avec S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. porcorum, S. hyointestinalis Streptococcus gordonii
PCR spécifique Streptococcus (gène tuf)
Un LCR stérile
! Double voire triple séquence • Ininterprétable • Pluri microbien ? Contaminé ? • Rendu négatif
PCR 16S très faiblement positive
Une biopsie osseuse stérile chez une patiente aux antécédents d’infection à S. epidermidis
! Double séquence
! Alignement : S. aureus, 96% • Similarité < 97%, non rendue
! PCR spécifique Staphylococcus • Double séquence
! PCR spécifique S. aureus +
Des nodules pulmonaires stériles chez une enfant de 12 ans
Séquence non répertoriée dans notre base de données
Famille des Bacteroidetes
Amplification et séquençage d’un autre fragment de l’ADNr 16S, mais pas plus d’information à partir des
banques de données
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1500
Etape 5. Rendu des résultats
! Contrôle négatif et positif de PCR 16S • Détection de contaminants et inhibiteurs dans le mix
! Contrôle d’extraction • Amplification parallèle du gène de la $-globine (eucaryote) • Toujours positif • Si négatif
" Prélèvement acellulaire : intra-oculaire, LCR " Présence d’inhibiteurs de PCR
! Interprétation de la séquence • Confrontation des données cliniques et biologiques • Distinguer un contaminant d’un pathogène • Une PCR négative d’exclut pas un diagnostic
PCR universelle
! Avantages • Amplification de tous les ADN bactériens
! Inconvénients • Pouvoir discriminant inter-espèces parfois limité
" Staphylococcus et Streptococcus • Pouvoir discriminant inter-genres parfois limité
" Mycobactéries, entérobactéries! • Amplification des contaminants • Biais des banques de données
" Séquences surreprésentées, erronées, inconnues
Solution = PCR spécifiques
Les PCR spécifiques
! Amorces spécifiques d’un genre / d’une espèce bactérienne
PCR spécifiques
! PCR « semi-spécifiques » Staphylococcus & Streptococcus • Gène tuf • Gel migration • Suivie d’un séquençage pour identification d’espèce
! PCR spécifique • En point final ou en temps réel
Patients : 400 pb
Témoin + : 600 pb
PCR spécifiques en temps réel
! Développement de techniques “clés en main” • Lyse, extraction, PCR et interprétation dans un système
automatisé et fermé de paillasse en % 1 heure • Détection par des sondes spécifiques • Intégration au secteur de Bactériologie conventionnelle
! Domaines divers • Infections associées aux soins
SARM, ERV, carbapénémases, toxines de C. difficile • Résistance du BK à la rifampicine (rpoB) • Portage de S. aureus, Streptocoque du groupe B! • IST : Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae
! Evaluer les performances et le coût
Exemple : GeneXpert MTB/RIF
PCR spécifiques en temps réel au GHE
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! Apport
• PCR sur prélèvements pluri-microbiens " Complément de 16S si double
séquence " Bordetella " Clostridium difficile
• PCR combinées " Francisella / Bartonella henselae
• Sensibilité > PCR 16S " S. aureus > Staph > 16S " K. kingae > 16S
Cas cliniques & données de la littérature
Une polyarthrite bien particulière!
! Homme de 61 ans ! PAR atypique diagnostiquée en 2005
• Mono-arthrite genou droit • Extension aux mains, poignets, épaules, genoux, pieds,
chevilles, sans lésion structurale érosive typique • FR, anti-CCP, ACAN + • Corticothérapie + méthotrexate
! Consultation en cardiologie sur avis du rhumatologue • Dyspnée d’effort + œdèmes MI depuis un mois • Important syndrome inflammatoire biologique • Doute sur un souffle cardiaque systolique apyrétique
Une polyarthrite bien particulière!
! Endocardite infectieuse • Echographie cardiaque : • Végétation cardiaque massive
de 24 mm • Body-Scan normal • Anémie à 10,9 g/dL
! Indication chirurgicale de RVA en urgence pour risque embolique
Une polyarthrite bien particulière!
! Suites rapidement favorables • Muté en chirurgie à J4
! Laboratoire • Anatomopathologie : absence d’EI • Bactériologie
" Examen direct : pas de germe " Culture : stérile " Hémocultures négatives
EI silencieuse à hémocultures négatives chez un patient immunodéprimé
• Augmentin® + gentamycine
Une polyarthrite bien particulière!
! PCR universelle • Tropheryma whipplei (bactérie intracellulaire cultivable sur fibroblastes) • Relecture anapath de la végétation avec colorations spéciales (PAS) :
négative
! Relais Bactrim Forte + Plaquenil, 12 mois ! Arrêt corticoïdes et méthotrexate
! Disparition totale des douleurs articulaires
! Autres prélèvements • Biopsie duodénale à J7 : négative • Biopsie digestive, sang, selles, salive : négatives à 12 mois
Apport de la PCR dans le diagnostic des EI à hémocutures négatives
! 759 patients présentant une EI à hémocultures négatives • Etiologie dans 62,7 % des cas • Sérologie (principalement Coxiella et Bartonella) : 47,7 % • PCR sur valve ou sang (sérologie négative) : 14,4 %
" Streptococcus, T. whipplei, Bartonella, Staphylococcus " Sensibilité PCR sur valve : 66,1 % " Sensibilité PCR sur sang : 13,6 %
• Immunohistochimie • Etiologies non infectieuses
! Coxiella : sensibilité sérologie > PCR
Limites de la PCR dans les EI!
Limites de la PCR dans les EI!
Persistance de PCR positives sous antibiothérapie
Particulièrement Streptococcus
66 % 60 %
Limites de la PCR dans les EI!
! et jusqu’à plusieurs années après !
Cas n°2
Une fièvre résistante aux anti-pyrétiques
! Enfant de 9 ans ! Consultation MT
• Hyperthermie (39,2°C), céphalées intenses depuis 48h, raideur de nuque, photophobie
Transport privé en urgences vers les urgences pédiatriques sans antibiothérapie : méningite ?
! Urgences pédiatriques • Purpura pétéchial non nécrotique (pied) • Constantes hémodynamiques stables • Glasgow 8, mutation en réanimation • Injection de C3G
Bilan biologique
! Biochimie – Hématologie • Leucocytes = 10,50 G/L • CRP = 288 mg/L • Plaquettes = 135 G/L, TP = 36%
! TDM cérébrale : œdème diffus
! Bactériologie • Hémocultures • Tube EDTA • Pas de ponction lombaire (troubles de
la vigilance + troubles hémostase)
PCR spécifique N. meningitidis
! PCR spécifique en temps réel multiplex • Tous génogroupes + B + C + contrôle interne
! Réalisée • En urgence sur le tube de sang EDTA • Sur la PL réalisée à distance
" Examen macroscopique : trouble " Examen direct : très rares cocci à Gram négatif " Leucocytes : 10 800 M éléments/L, PNN : 98% " Protéinorachie : 6,63 g/L " Glycorachie : 0,3 mmol/L " Culture négative
! Positive pour N. meningitidis génogroupe B
PCR = diagnostic en urgence
! Méningites • PCR spécifique Méningocoque • PCR spécifique Pneumocoque • PCR spécifique Listeria
! PCR Méningocoque = diagnostic + typage
! Délai de rendu des résultats > PCR universelle • Retour d’expérience de notre laboratoire • Jamais positive si leucocytes < 200 /µL
Cas n°3
Cas n°3
! Patient de 28 ans, sans antécédent
! Survenue brutale d’une douleur basithoracique gauche dans la journée avec dyspnée progressivement croissante
! Examen clinique • Apyrétique (37,6°C) • Ni toux, ni expectoration, ni signe extra-respiratoire • Discrets crépitants en base gauche pulmonaire • FC = 90/min • PA = 110/60 mmHg • Sa(02) = 93%
Bilan d’entrée
! Biologie • CRP à 36 mg/L • Leucocytes 13,9 G/L avec 11,8 G/L PNN • Ionogramme, bilans hépatique, rénal, cardiaque normaux
! Imagerie • Radiologie pulmonaire : pneumopathie du lobe inférieur gauche
associée à des opacités alvéolaires de la base droite • Scanner : volumineuse condensation parenchymateuse du lobe
inférieur gauche (5 cm de largeur) sans épanchement
Amoxicilline per os + hospitalisation en Pneumologie
Evolution dans les 72 h
Admission 48 h 72 h
Température (°C) 37,6 38,4 39,5
Toux Absence Apparition d’une toux, expectorations blanchâtres
Douleur thoracique et dyspnée + ++ +++
morphine
Fréquence respiratoire (cycles/min) normale 38
Saturation (O2) 93% (air) 93% (air) 89% (10 L O2)
PAS (mm Hg) 110 90
Leucocytes (G/L) 13,9 13,1 3
CRP (mg/L) 36 210 323
Switch Auhmentin / Tavanic puis C3G / Rovamycine / Tavanic Mutation en USI, puis en Réanimation (CHU) : diagnostic de légionellose, ECMO
Evolution en réanimation
! Persistance de PCR positives sous antibiothérapie • Legionella : PCR habituellement négativée en < 2 semaines
(Korosec et al., Scand J Infect Dis., 2006)
Abcès pulmonaire
! Chirurgie thoracique à J42 et évolution favorable ! PCR universelle sur l’abcès : double séquence (Fusobacterium / culture) ! PCR spécifique Legionella : +++ ! Antibiothérapie totale : 3 mois
Persistance de PCR positives / LBA = complications
PCR quantitative sur LBA : un marqueur prognostique dans les légionelloses
! Charge bactérienne à l’admission corrélée à la sévérité des légionelloses ! Limites : standardisation des prélèvements pulmonaires
En conclusion!
Complémentarité des méthodes diagnostiques en Bactériologie
! Connaître les performances de chaque technique • Limite de détection, sensibilité et spécificité, indications • Degré d’urgence clinique • La PCR n’est pas forcément la technique la plus sensible !
! Intégrer les méthodes de biologie moléculaire (BM) dans un algorithme diagnostique
! Evaluer les kits commercialisés
! Association • Techniques « maison » & kits commerciaux • Kits « clés en main » & kits conventionnels
Connaître les limites de la PCR
! Faux positifs • Pas de différenciation contaminant / pathogène • N’est pas toujours le témoin d’une infection active
! Faux négatifs • Un résultat négatif n’exclut pas un diagnostic
" Cas avec culture + (rares colonies) / PCR –
! PCR ! méthode de vérification d’un résultat de culture douteux
Au delà d’un outil strictement diagnostique
! Outil pronostique • PCR quantitative
! Typage bactérien
! Recherche de facteurs de virulence • C. difficile / souche épidémique O27 • S. aureus / PVL!
! Recherche de résistance • Sondes détectant les mutations associées à la résistance • SARM, BK / rifampicine, H. pylori / clarithromycine!
