DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES. 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal

b ) Diagnostic de confirmation

c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)

2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.

a) problèmes posés par les mutations récurentes

b) problèmes posés par les mutations inconnues

i) diagnostic direct évident

ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire

3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie

a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)

b ) analyse familiale

c) diagnostic probabiliste





































Recherche de mutations récurrentes

Un gène – une mutation

Un gène-des mutations majoritaires

… de nombreux outils adaptés

Maladie de Huntington

Allèles anormauxAllèles anormaux(> 36 CAG )(> 36 CAG )

Allèles normauxAllèles normaux(( 30 CAG 30 CAG ))

Diagnostic Direct et analyse fonctionnelleSyndrome de retard mental lié à l ’X

• Le Gène :

– Gène FMR1, localisé en Xq27.3

– FMRP : RNA binding protéine

– Présence d ’une expansion d ’un motif trinucléotidique répété

« CGG » au niveau de l ’extrémité 5 ’non traduite du gène

(CGG)n(CGG)n

...Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine- Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine...

Diagnostic Direct Syndrome de retard mental lié à l ’X

• Southern Blot

BlotBlot

2,8 kb2,8 kbEcoRI+EagI normalEcoRI+EagI normal

5,2 kb5,2 kbEcoRI normalEcoRI normal

MutéMutéMéthyléMéthyléNINIPrémutéPrémutéNo MéthyléNo MéthyléNANA

Hom

me

norm

alH

omm

e no

rmal

Fem

me

norm

ale

Fem

me

norm

ale

Hom

me

prém

uté

Hom

me

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uté

Fem

me

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Fem

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Hom

me

mut

éH

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Fem

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mm

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Hom

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mos

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que

Fem

me

mos

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mm

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osaï

que

Interprétation des profilsInterprétation des profils

M M

PM

FH

Diagnostic direct d ’une lésion de l ’ADN par PCR

Deux réactions permettent d ’amplifier simultanément à l ’aide de 18 couples d ’amorces spécifiques, 18 exons du gène de la dystrophine et les jonctions introns-exons correspondantes.

Elles permettent ainsi de diagnostiquer la délétion d ’un ou plusieurs de ces exons chez les malades atteints de myopathie de Duchenne/Becker.

45

48

19

17

5

8

12

44

4

Dystrophiemusculaire

deDuchenne

MW

MM MT TEXON

pm

3

43

50

13

6

47

60

52

Oligonucleotide Ligation Assay

CC ADN NormalADN Normal

Sonde communeSonde commune

FluorochromeFluorochromeAA

GG

GG

LigationLigationdénaturationdénaturation

OLA NormalOLA Normal

Oligonucleotide Ligation Assay

GG

AATT ADN MutéADN Muté

Sonde communeSonde commune

FluorochromeFluorochrome

AA

LigationLigationdénaturationdénaturation

OLA mutéOLA muté

OLAOLA













Recherche de mutations inconnues

Techniques multiples de détection

PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X)

Siz

e m

arke

rU

ndig

este

dR

317X

Con

trol

PCR/HaeIIIPCR/HaeIII

Con

trol

s

nt 1

311

C

T

SSCPSSCP

Con

trol

s

nt 1

311

C

T

DGGEDGGE

HeterozygousCodon 317 CAG TAG

SequenceSequence













• Critères d’implication d’une variation nucléotidique dans un phénotype (pathologique)– évident (modification radicale de la protéine)

• Absence d’ARNm ou de protéine

• Perte de la fonction de la protéine in vitro ou dans un modèle (test fonctionnel)

• modification de l’ARNm

– Arguments probabilistes• Histoire familiale

– corrélations mode de transmission/ phénotype ; phénotype/génotype

• Arguments biologiques (éventuellement in sillico)– nature du changement d’acide aminé

– éloignement du consensus pour une séquence signal

– ...

• Comparaison en population– mutations comparables et leurs effets pathogènes

– conservation du résidu modifié dans une famille de gène (intraspécifique) ou une analyse phylogénétique (interspécifique)

– présence de la variation dans une population normale comparable













Le Diagnostic Indirect

Ici

Marqueur 1

Marqueur 2

Marqueur 3

Marqueur 4













Diagnostic Indirect (affection AD)













Phénomène de recombinaison

m +1cM

3cM

m +

P=0,01

ou m +

P=0,03

ou m +

P=0,0003

ou

• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée

– b) obtention du consentement éclairé

– c) rendu des résultats

• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)


– c) prise en charge de la grossesse en cours

– d) rendu des résultats

– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical









• Le consentement éclairé– Obligatoire

• doit porter sur des renseignements précis

• doit faire l’objet d’un document écrit

• doit être compris par le patient ou ses ayant-droits

– Les cas particuliers• enfants

– les titulaires de l’autorité parentale et éventuellement l’enfant lui même

• les majeurs incapacités– tuteur ou curateur

• les impossibilités– personne de confiance

déclarée

– famille

• L’attestation d’obtention du consentement.

• Le consentement éclairé

– Unicité de la recherche

– Autorisation du laboratoire

– Découvertes fortuites

– Incertitude sur le succès

– Durée des examens

– Conservation des échantillons

– Modalités de rendu diagnostique

– Caractère facultatif




– Abord du patient

– Lecture d’un compte rendu d’analyse moléculaire pour le praticien






• Rendu des résultats– par le médecin prescripteur du test

• qui est le seul destinatiare des résultats…

– Au cours d’une consultation appropriée

– Eventuel suivi

• Lecture d’un compte rendu de diagnostic moléculaire à l’usage du praticien– Notion de nomenclature internationale des mutations

Nomenclature des mutations

• Description au niveau nucléotidique– Base de description

• la séquence génomique : g.

• La séquence de l’ADNc : c.

– Les substitutions• g.11223G>A = substitution d’une guanosine par une adénosine en

position 11223 de la séquence

• c.542T>C (le nucléotide N° 1 est le premier nucléotide du codon d’initiation de la traduction (A de l’ATG))

• Cas des introns– c.641+2T>A ou IVSn+2T>A

– c.642-1G>T ou IVSn-1G>T

• Séquence de référence précisée.

– Les délétions et les insertions• « del » ou « ins »

• c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA

• Description au niveau protéique– p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X

– p.R40W ou p.Arg40Trp

• Description de mutation à effet plus complexe– Exemple mutations décalantes du cadre de lecture

• c.642_643insCfsX18

• p.Ala214AlafsX6

• Lecture du compte rendu– 1°) la technique employée

– 2°) le résultat brut• Présence d’une mutation [c.24C>T]+[=] dont l’impact protéique est

[p.Lys8Arg]+[=]

– 3°) le commentaire• La mutation p.Lys8Arg présente à l’état hétérozygote est décrite de

manière récurente dans la population européenne. Elle est responsable du phénotype du patient. Elle se transmet en dominance et, sa présence doit faire conseiller une consultation spécialisée de génétique pour informer le proposant des risques et engager une éventuelle enquête familiale.

• Précisions, questions et description des mutations complexes : – http://www. dmd.mutnomen.html

















• Consentement de la femme enceinte

• Elle a eu et compris les informations suivantes– Mode de pratique du DPN

– Nature et limite des examens réalisés

– Risques liés au prélèvement

– Délai d’obtention des résultats

– Remise et explication des résultats

• Il n’y a en acun cas un engagement à la réalisation d’une interruprion de la grossesse si le fœtus est atteint de la maladie recherchée









CHORIOCENTESE et / ou PLACENTOCENTESE

• Date : - Choriocentèse: 10 - 14 SA

- Placento : 15 - 35 SA

• Villosités : annexes

• Risque : - F.C. 1 à 1,5 %

- erreur 1 %

• Intérêt : - gène ++++

- chs ++

- enzyme +++

Utérus

Embryon / Foetus

Chorion / Placenta

Pince

AMNIOCENTESE

• Date: 14 - 30 SA

• Cellules Amniotiques• Risque: - F.C. 0,5 %

- erreur 1/10000

• Intérêt: - gène ++

- chs ++++

- enzyme +++

- hormone ++++

aiguille

fœtus

utétus

CORDOCENTESE

• Date: 22 - 38 SA

• Sang Foetal• Risque: - F.C. 1 %

- erreur 1/1000

• Intérêt: - gène +

- chs +++

- enzyme ++

aiguille

Cordonombilical

utérus

fœtus

















• Diagnostic d’une “maladie d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic”

• Prise de décision multidisciplinaire – Néonatologiste

– Echographiste

– Obstétricien

– Généticien

• Organisé en Centre de Diagnostic Prénatal

• Références :

– Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN , AP READ, Flammarion Médecine-Sciences (2ème édition française 1998)

– Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale, 2004, MASSON

– Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale,

• http://college-genetique.igh.cnrs.fr/sommaire.html

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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES. 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic