ARTICLE ORIGINAL

Diagnostics biologiques de la coqueluche

Biological diagnosis of whooping cough

N. GuisoInstitut Pasteur, unité des Bordetella, 25, rue du Dr-Roux, 75724 Paris cedex 15, France

MOTS CLESCoqueluche ;Culture ;PCR ;Sérologie ;Diagnostic

KEYWORDSWhooping cough;Culture;PCR;Serology;Diagnosis

Résumé La coqueluche est une infection respiratoire sévère particulièrement pour lesnourrissons. Les agents de cette maladie sont les bactéries Bordetella pertussis etBordetella parapertussis. Avant la vaccination, la maladie touchait les nourrissons, maissurtout les enfants vers 4–5 ans. Les adolescents et les adultes avaient ensuite régulière-ment des rappels naturels, en raison de la circulation élevée de la bactérie. Quarante ansaprès la vaccination généralisée dans certains pays, on observe maintenant un change-ment dans la transmission de la maladie. Les enfants ne sont plus infectés entre 2 et5–10 ans (suivant les vaccins et les calendriers vaccinaux) car ils ont été vaccinés dansl’enfance. Mais les adolescents et les adultes sont devenus susceptibles, car ils n’ont paseu de rappel ni vaccinal, ni naturel. Ils peuvent donc être infectés, et surtout contaminerdes nourrissons trop jeunes pour être vaccinés. Les symptômes de la maladie sur desindividus antérieurement vaccinés ou infectés sont très diverses, et c’est pourquoi desdiagnostics biologiques sensibles et spécifiques sont maintenant nécessaires pour confir-mer l’infection. Ces tests sont la culture, la PCR et la sérologie.

© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract Whooping cough is a respiratory infection particularly severe for infants. Theagents of the disease are the bacteria Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis.Before vaccination, disease affected in majority children. Because of the high circulationof the bacteria, adolescents and adults were regularly in contact with the bacteria andhad natural boosters. Forty years after generalized vaccination in some countries, achange in the transmission of the disease is observed. Children are not infected between2 and 5–10 years of age (depending on the vaccine used and the vaccine calendar) becausethey were vaccinated in their infancy. However, adolescents and adults are becomingsusceptible because they do not receive any vaccinal or natural boosters. They can infectand contaminate infants too young to be vaccinated. Clinical symptoms in adolescentsand adults, previously vaccinated or infected, are very variable and for this reasonbiological diagnosis are now necessary to confirm infection. These diagnostics areculture, PCR and serology.

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Au moment où il est question d’éradication de lapoliomyélite ou de la rougeole, la coqueluche per-siste dans le monde. La vaccination a très nette-

ment réduit la mortalité et la morbidité dues àcette maladie dans les populations vaccinées, maiselle reste une maladie endémique chez les adoles-cents et les adultes, qui sont une source de conta-mination pour les jeunes nourrissons non encorevaccinés [14] et pour qui la maladie est très sévèrevoire mortelle [3].Adresse e-mail : nguiso@pasteur.fr (N. Guiso).

Journal de pédiatrie et de puériculture 16 (2003) 365–368

www.elsevier.com/locate/pedpue

© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.doi: 10.1016/S0987-7983(03)00015-X

Épidémiologie de la coqueluche dansles populations vaccinées

La vaccination a très nettement diminué la cir-culation de Bordetella pertussis, bactérie agent dela coqueluche. Cependant, la bactérie continue àcirculer, même dans les populations vaccinées, etla nouvelle caractéristique de ces populations estune relative augmentation de la maladie chez lesadolescents et les adultes. L’augmentation peutêtre réelle ou due à l’amélioration des techniquesde diagnostic biologique et aux connaissances épi-démiologiques concernant la transmission de la ma-ladie, ou plus vraisemblablement à un mélange detous ces facteurs. D’après les études sérologiquesréalisées dans différentes populations, il semble-rait que la proportion d’adultes susceptiblesd’avoir été infectés serait plus élevée dans lespopulations vaccinées par rapport aux populationsnon vaccinées [14]. Par ailleurs, lors de diversesétudes réalisées soit lors d’un essai d’efficacitéd’un vaccin adulte soit dans des populations adultesayant été vaccinées dans l’enfance, il a été récem-ment montré que l’incidence de la maladie sesituait entre 400 et 700 cas pour 100 000 [14]. Lorsd’une étude réalisée en France, dans la régionparisienne, l’incidence estimée était de 508 caspour 100 000 [5], ce qui est très semblable.L’ensemble des études réalisées ces 5 dernières

années dans le monde a permis de montrer quel’immunité, suite à l’infection ou suite à la vacci-nation dans l’enfance, ne dure pas une vie entière.On peut avoir la maladie plusieurs fois dans la vie[14]. Cependant, si les symptômes cliniques sonttypiques pour des patients non vaccinés et encontact pour la première fois avec le germe, ils lesont moins pour des individus anciennement vacci-nés ou ayant eu la maladie dans l’enfance [14]Erreur ! Signet non défini. Pour cette raison, desdiagnostics biologiques sont maintenant nécessai-res pour confirmer l’infection et stopper la trans-mission.

Les agents de la coqueluche et leursdéterminants de virulence

Les agents de la coqueluche sont principalementB. pertussis mais aussi Bordetella parapertussis.Les 2 espèces appartiennent au genre Bordetella[4]. Ce sont des bactéries à Gram négatif qui sontresponsables d’infections respiratoires. Ce sont desbactéries extracellulaires qui pénètrent dans l’ap-pareil respiratoire suite à des gouttelettes d’aéro-sols, adhèrent sur les cellules trachéales grâce àdes adhésines telles l’hémagglutinine filamenteuseou FHA, la pertactine ou PRN et les fimbriae ou Fim

2 et Fim 3. Ensuite, elles peuvent se multiplier etcoloniser l’arbre respiratoire en sécrétant des toxi-nes qui vont, d’une part détruire les cellules tra-chéales ciliées (toxine cytotrachéale ou TCT) etempêcher leur régénération, et d’autre part, leurpermettre d’échapper à la réponse immune del’hôte (toxine de pertussis ou PT et adényl cyclase-hémolysine ou AC-Hly). B. parapertussis synthétiseet sécrète les mêmes toxines et adhésines à l’ex-ception de la PT. Ces bactéries ne peuvent survivredans l’environnement, et la transmission ne se fe-rait que d’un hôte à un autre.En France, la majorité des cas de coqueluche

(99 %) est due à B. pertussis. Cependant, danscertains pays, la proportion des infections à B.parapertussis serait plus élevée et représenteraitentre 10 à 20 % des cas de coqueluche.

Diagnostics biologiques

Prélèvement biologique nécessaire àla détection du germe

Une aspiration nasopharyngée, un écouvillon-nage nasal ou des expectorations sont les différentsmatériels biologiques qui peuvent être utilisés pourisoler le germe. L’aspiration nasopharyngée est,cependant, le prélèvement qui donnerait lemeilleur résultat [8].

Isolement, culture et identification dugerme

C’est le diagnostic le plus spécifique. Le prélève-ment doit être inoculé sur des boîtes de milieu deculture (Bordet Gengou) le plus rapidement possi-ble. Il est recommandé de ne pas attendre plus de2 h avant d’inoculer le milieu de culture. Le milieude Bordet Gengou contient de l’amidon et du sangde mouton ou du sang de cheval frais. Ces substan-ces ne sont pas nécessaires à la croissance dugerme, mais servent à chélater les substances inhi-bant la croissance des bordetelles. Il est recom-mandé de toujours inoculer une boîte sans antibio-tique mais aussi une boîte avec antibiotique.L’antibiotique recommandé est la céfalexine. Lesisolats de B. pertussis sont résistants à cet antibio-tique le plus souvent. Cependant certains ont unecroissance inhibée, et il est donc recommandé dene pas subcultiver en présence de cet antibiotique.La température de croissance optimale est de35–36 °C. La bactérie croît lentement, et il estrecommandé de laisser les boîtes à l’étuve durantau moins 7 j. B. pertussis et B. parapertussis sontdes petits coccobacilles à Gram négatif. Leur iden-tification se fait grâce à quelques rares caractères

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biochimiques (oxydase, uréase, citrate réductase,la non acidification des glucides et l’aérobiestricte). La confirmation se fait à l’aide d’immun-sérums agglutinant spécifiquement chacune des es-pèces. Les procédures précises peuvent être obte-nues auprès du Centre national de référence de lacoqueluche et autres bordetelloses.La culture est la technique de choix pour les

patients non vaccinés ou vaccinés il y a plusieursannées, à condition que le prélèvement soit faitdans les 3 semaines qui suivent le début de la toux.Ce diagnostic est peu onéreux et remboursé par

la sécurité sociale. C’est aussi la seule méthode quipermet de surveiller l’évolution de la populationdes germes. Pour cette raison, les germes collectésdoivent être envoyés au Centre national de réfé-rence, qui analyse les isolats à l’aide de différentestechniques de typage, de séquençage des gènescodant toxines et adhésines, de détection des toxi-nes et adhésines exprimées très régulièrement[11,15]. Cette surveillance est très importante dansun contexte de changement de vaccin coquelu-cheux dans la plupart des populations vaccinées.Si la culture ne peut être réalisée, il est recom-

mandé de faire réaliser la technique d’amplifica-tion génique (PCR), qui se pratique dans plusieurslaboratoires d’analyse médicale ou hospitaliers [1]maintenant en France. Précédemment, la techni-que d’immunofluorescence directe était aussi pra-tiquée, mais cette technique manque de spécifi-cité.

Détection du germe par la réactionde polymérisation en chaîne ou PCR

Cette technique est plus rapide et plus sensibleque la culture, mais très délicate. Seul un labora-toire ayant des locaux adaptés et un personnelformé peut effectuer ce diagnostic.La réaction se fait à partir des mêmes prélève-

ments biologiques que la culture. À la différence dela culture, le prélèvement peut être envoyé aulaboratoire jusqu’à 24 h après son obtention. Il peutaussi être conservé à –80 °C avant d’être analysé sinécessaire.Il est conseillé de purifier l’acide désoxyribonu-

cléique (ADN) à partir du prélèvement avant deprocéder à l’amplification [5].La présence d’inhibiteurs doit être systémati-

quement recherchée et la spécificité de la régiond’ADN amplifiée doit être vérifiée.Plusieurs régions du chromosome ont été choisies

pour l’amplification. Certaines ont été choisies enraison d’un grand nombre de copies afin d’augmen-ter la sensibilité du test, telle la région répétée481, d’autres, comme le promoteur des gènes co-dant la PT [1,6] ou le gène codant la porine [10] ont

été choisies pour augmenter la spécificité. Le gènecodant l’AC-Hly [2] a aussi été utilisé avec unegrande sensibilité, mais ce test n’est pas spécifiqued’une espèce puisqu’il détecte à la fois B. pertus-sis, parapertussis et bronchiseptica.La spécificité de ces tests doit être régulière-

ment vérifiée. Il vient, en effet, d’être montré quela PCR fondée sur les séquences répétées pouvaitamplifier l’ADN de B. holmesii [12]. Pour cetteraison, il est conseillé d’utiliser le test fondé surl’amplification du promoteur des gènes codant lessous-unités de la PT pour un diagnostic spécifiqued’infections à B. pertussis.La PCR permet de rendre un diagnostic en 2 ou

3 j, ce qui est important surtout pour les adoles-cents ou les adultes dont les symptômes cliniquesne sont pas toujours typiques.La PCR est utilisée en routine en France dans

certains laboratoires mais n’est pas remboursée.Ceci pose un problème, car l’incidence de la mala-die est élevée dans la population des adolescents etdes adultes [5], et un diagnostic rapide est d’impor-tance afin de stopper la transmission de la maladiedans l’entourage.

Sérologie

La sérologie consiste à détecter des anticorpsspécifiques dans le sérum des personnes supposéesêtre infectées. Elle reste la technique de choix pourla surveillance épidémiologique, et surtout commediagnostic chez les adolescents et les adultes. Ellene peut être utilisée dans les 6 à 9 mois suivant unevaccination coquelucheuse.Ce diagnostic a toujours été rétrospectif

puisqu’il nécessite 2 sérologies prélevées à 1 moisd’intervalle (un sérum collecté en phase aiguëc’est-à-dire prélevé dans les 2 semaines suivant ledébut de la toux, et 1 sérum collecté en phase deconvalescence 1 mois après le premier sérum). Uncas est confirmé s’il y a augmentation ou diminu-tion du taux d’anticorps entre les 2 sérologies.Cependant, si le taux en anticorps est suffisammentélevé dans le premier sérum, pour 1 adolescent ou1 adulte, le test est de plus en plus considérécomme une confirmation de l’infection, surtout sides immunoglobulines G et A sont détectées.Le seul antigène spécifique de l’espèce B. per-

tussis est la PT. L’AC-Hly est spécifique des 3 espè-ces pertussis, parapertussis et bronchiseptica. Maiscomme la présence d’anticorps anti-PT peut êtrefugace, surtout chez certains anciens vaccinés ouanciens infectés, le taux d’anticorps anti-AC-Hly ouanti-FHA peut être mesuré. Dans ces cas, s’il y avariation du titre en anticorps entre les 2 sérolo-gies, cela signe une infection à Bordetella, car celapeut être B. pertussis ou B. parapertussis.

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La sérologie n’a pas d’intérêt pour des jeunesnourrissons en raison de la présence d’éventuelsanticorps maternels et d’une synthèse d’anticorpssouvent tardive. Cependant, dans leurs cas, si laculture ou la PCR ne peuvent être réalisées, lediagnostic peut se faire en comparant les sérologiesd’un sérum prépartum de la mère et d’un sérumprélevé au moment de la maladie du nourrisson [7].Les 2 tests sérologiques sont l’immuno-

empreinte [9], test semi-quantitatif qui permet dedétecter en une seule étape des anticorps dirigéscontre plusieurs antigènes et qui est remboursé, et1 test immuno-enzymatique réalisé avec des anti-gènes purifiés, l’enzyme-linked immunosorbent as-say (Elisa) [13], test quantitatif mais non rem-boursé. Il peut être exceptionnellement réalisé parle Centre national de référence de la coqueluche etautres bordetelloses.

Diagnostic épidémiologique

Ce diagnostic peut être fait si le patient estsusceptible cliniquement d’avoir une coqueluche,et a été en contact avec un cas prouvé par lelaboratoire dans les 3 semaines précédant sa toux.

Conclusion

Des diagnostics biologiques de la coquelucheexistent, mais leur utilisation varie suivant l’âge etl’état immun des patients.La culture est le diagnostic de choix pour les

nourrissons, qui sont généralement hospitalisés audébut de leurs symptômes.La PCR est la technique de choix pour les person-

nes infectées dans les 3 premières semaines detoux.La sérologie est la technique de choix pour les

adolescents et les adultes qui sont loin de leurvaccination coquelucheuse, et pour qui la présenced’anticorps signe une infection par une espèce deBordetella.Les séquences des génomes des 2 espèces bacté-

riennes responsables de la coqueluche viennentd’être terminées. Leur comparaison va permettrel’identification de gènes spécifiques de chaque es-pèce, et peut-être ainsi permettre des diagnosticsplus spécifiques.

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