École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II

Confinement moléculaire et Confinement moléculaire et organisation de la membrane des organisation de la membrane des

cellules vivantes: analyse de la diffusion cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de par spectroscopie de corrélation de

fluorescencefluorescence

Laure WAWREZINIECKLaure WAWREZINIECKÉcole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II Spécialité: Biologie des eucaryotes, option Immunologie

Sous la direction de:Didier MARGUET, Centre d’Immunologie de Marseille-LuminyUniversité Aix-Marseille II – CNRS – INSERMPierre-François LENNE, Institut FresnelUniversité Aix-Marseille III – CNRS

Journée des doctorants – 17 déc Journée des doctorants – 17 déc 0404

Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy bourse MENRT

http://www.ciml.univ-mrs.fr/

la membrane cellulaire: une structure très complexe! organisation dynamique: étude de la diffusion

différentes méthodes sont possibles: Suivi de particules uniques (SPT)Recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

Engelman, Nature, 2005

Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

I. Modèles d’organisation compartimentée de la membrane cellulaire

II. Un outil pour étudier la diffusion moléculaire: la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

III. FCS à rayon variable et lois de diffusion FCSWawrezinieck et al,

SPIE, 2004Wawrezinieck et al.,

Biophys J, 2005

IV. Lois de diffusion FCS mesurées dans les cellules vivantes COS-7 et nature du confinement membranaire

Lenne et al, EMBO J,

2006

V. Étude préliminaire de la réorganisation membranaire au cours de l’activation cellulaire

tiré de Singer & Nicolson, 1972

Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation


animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi


tiré de Jacobson et al., 1995

mise en contact rapide des différents acteurs d’une réaction organisation non aléatoire et non uniforme de la membrane

animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation

Structure du réseau de microfilaments d’actine

50 µ m 0,2 µm

Image obtenue par microscopie confocale de fluorescence de cellules CEF après marquage par rhodamine-phalloïdineWakatsuki et al., 2001

Image obtenue par microscopie électronique dans un lamellipode de fibroblaste REF-52Svitkina et al., 1987


Le réseau des microfilaments d’actine: un obstacle à la diffusion des protéines transmembranaires

équipe de Kusumi

Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK):confinement transitoire des protéines TfR dans les mailles du réseau d’actine:

taille des mailles: 260 nmtemps moyen de confinement: 55 ms

récepteur à la transferrine (TfR)

Fujiwara et al., 2002


Les protéines ancrées au cytosquelette: un obstacle à la diffusion des phospholipides

équipe de Kusumi

Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK):confinement transitoire des phospholipides DOPE :

taille des mailles: 230 nmtemps moyen de confinement: 11 ms Fujiwara et al.,

2002


Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”



pas d’observation directe (structures trop petites et trop nombreuses)

« membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)



Une définition biochimique:

• fractions de membranes résistantes à l’extraction par des détergents non-ioniques tels que le Triton X-100 à 4°C (ou le Brij 98 à 37°C)

• microdomaines enrichis en sphingolipides, cholestérol et certaines protéines

dans rafts hors rafts

GFP-GPI




Vers une définition physique ?

• utilisation des propriétés de diffusion différentes en présence et en l’absence de microdomaines

• mesure de la diffusion par des méthodes optiques



La FCS: montage de microscopie de fluorescence

laser miroir dichroïque

objectif de microscope

trou confocal

filtre

échantillon

photodiode à avalanches

I(t)

autocorrélation

volume confocal


Principe de la FCS: cas d’une molécule unique

Fonction d’autocorrélation:

2

2

tI

τtItIτg

Inte

nsi

té d

e fl

uo

resc

ence

I(

t)

temps t

fluctuation de fluorescence

=1+




2

2

tI

τtItIτg

= 1 + aire relative de recouvrement

Inte

nsi

té d

e fl

uo

resc

ence

I(

t)

temps t


I(t) copies I(t+)

recouvrement

délai

temps t

Inte

nsi

té d

e fl

uo

resc

ence

I(

t)

=1+




2

2

tI

τtItIτg

= 1 + aire relative de recouvrement

Inte

nsi

té d

e fl

uo

resc

ence

I(

t)

temps t


I(t) copies I(t+)

recouvrement

aire

rel

ativ

e d

e re

cou

vrem

ent

délai

délai

temps t

Inte

nsi

té d

e fl

uo

resc

ence

I(

t)


Principe de la FCS: cas de plusieurs molécules

0 10 20 30 40 50 60

300

350

Intensité de fluorescence

(kHz)

temps t (s)

105

délai τ (ms)

1

1.1

1.2

1.3

1.4

101 102 103 104

fon

ctio

n d

’au

toco

rré

latio

n

g(2

) (τ)

N

11

temps de diffusion dans le volume confocal

Utilisation de la FCS pour l’étude de la diffusion


La FCS traditionnelle:

temps de diffusion

http://www.jcb.org.gate1.inist.fr/content/vol140/issue5/images/large/JCB29327.f10.jpeg

Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire?


tem

ps d

e di

ffus

ion

τ d

aire du spot w2

La FCS à rayon variable:




tem

ps d

e di

ffus

ion

τ d

aire du spot w2





tem

ps d

e di

ffus

ion

τ d

aire du spot w2





tem

ps d

e di

ffus

ion

τ d

aire du spot w2


‘Loi de diffusion FCS’




tem

ps d

e di

ffus

ion

τ d

aire du spot w2


‘Loi de diffusion FCS’

tem

ps d

e di

ffus

ion

τ d

aire du spot w2



La FCS à différentes échelles spatiales

Le diamètre du spot peut être réglé entre 0,4 et 1,0 µm


Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7

selon axe z20

15

10

5

0100x10380604020

intensité détectée (cps)

cellule COS-7

30

μm

x

y

z

lamelle

noyau

volume confocal

posi

tion (

µm

)


Analogues lipidiques fluorescents et protéines de fusion utilisées dans les cellules COS-7

(1) glycérophospholipides: FL-PC et FL-PE(2) sphingolipides: FL-SM et FL-GM1

(3) protéines ancrées GPI: GPI-GFP et Thy1-GFP(4) protéines transmembranaires: GFP-TfR et GFP-DPPIV

1.08

1.06

1.04

1.02

1.00

fonct

ion d

’auto

corr

éla

tion

0.001 0.1 10 1000délai (ms)

1.20

1.15

1.10

1.05

1.00

fonct

ion d

’auto

corr

éla

tion

0.001 0.1 10 1000délai (ms)


Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7: étude de l’autocorrélogramme

GFP-TfRFL-GM1

diffusion libre 2D

τdiff

L’étude à une seule taille de volume confocal ne permet pas de conclure quant au type de diffusion


Lois de diffusion FCS mesurées sur les cellules COS-7

100

80

60

40

20

0

-20

tem

ps

de d

iffusi

on (

ms)

160140120100806040200

waist2 (x10

3 nm

2)

FL-GM1

GFP-TfR

Quels types d’organisation de la membrane permettent d’expliquer de telles lois de diffusion?


Simulations: modèles de diffusion

diffusion libre

aire du spot - w2tem

ps d

e di

ffusi

on

D

wd 4

2

obstacles imperméables

domaines isolés

partage dynamique

réseau


Simulations: paramètres

w

Modèle de réseau

P

Dmicro

2r

Dout

DinPin

Pout

r

Modèle des domaines isolés

w


Simulations: paramètres

Force de confinement (Sconf ):

P

P

rAS

diff

confconf

11

Temps de confinement (τconf ):temps moyen mis par une molécule placée au centre du domaine pour en sortir

r

P

avec : P : probabilité de sortie d’un domaine r : rayon du domaine : longueur moyenne du pas élémentaire diff : temps de diffusion à travers le domaine A : constante


Simulations du réseau: résultats


Simulations du réseau: résultats

diffconf

effd

t

D

wt

2

4

0

2

0

si Xc2>2:

Grandes tailles de spots confocaux


Simulations des domaines isolés: résultats


Simulations des domaines isolés: résultats

diffconf

effd

t

wD

t

2

4

1

0

20

: coefficient de partaget0: indice de confinement

Grandes tailles de spots confocaux

si Xc2>10:


Simulations: résumé des résultats

Aires accessibles domaines isolés t0 > 0

diffusion libre t0 = 0

réseau t0 < 0

0

réseau

domaines isolés

diffusion libre

Aire du spot confocal

tem

ps d

e

diff

usio

n



t0 = 0


Glycérophospholipides/Protéines ancrées GPI/Sphingolipides

FL-PC: glycérophospholipideGFP-GPI: protéine ancrée GPIFL-GM1: sphingolipide

Modification enzymatique de la membrane


cholestéroloxydase

sphingomyélinase

sphingomyéline


Analogues lipidiques fluorescents: traitements enzymatiques

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

FL-GM1 FL-SM FL-PCordo

nnée

à l'

orig

ine

(ms)

no treatment

+ COase 1 U/mL

+ SMase 0.1 U/mL

GFP-GPI

50

40

30

20

10

0

tem

ps

de d

iffusi

on (

ms)

120x103

80400

waist2 (nm

2)

FL-GM1

+ COase 1U/mL

+ SMase 0.1 U/mL

sans traitement


Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques mais pas dans les mailles du cytosquelette

modif actine

modif radeaux lipidiques


Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques

Les glycérophospholipides, sphingolipides et protéines ancrées GFP ne sont pas sensibles au confinement par le réseau d’actine

Cyto D


Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR

control



control



control

+ cytochalasine D (2 μM)



control




Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou les mailles du cytosquelette

modif actine

modif radeaux lipidiques

modif actine +modif radeaux lipidiques


Confinement transitoire des protéines transmembranaires dans les radeaux lipidiques et dans les mailles du réseau d’actine

Cyto DCyto D


Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou dans les mailles du réseau d’actine

caractéristiques des mailles du réseau d’actine:

caractéristiques des domaines isolés:

• taille des mailles: 2r = 240 ± 60 nm

• conf de l’ordre de plusieurs dizaines ou centaines de ms

• structure dépendante de la température

• taille des domaines: r < 60 nm

• conf de l’ordre de plusieurs dizaines de ms

• structures indépendantes de la température


Application à l’étude de l’activation des lymphocytes T

Principe:

mesures sur cellules Jurkat, dont on maîtrise l’activation par ajout dans le milieu de culture d’un anticorps anti-CD3 humain

Complexe TCR/CD3


Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation






Temps de diffusion et lois de diffusion FCS au cours de l’activation

Ajout del’anticorps

0 1 2 3 4 6 7 8 1095


Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation






Comment expliquer la loi de diffusion FCS mesurée au pic d’activation ?

loi de diffusion obtenue pour un confinement total dans un domaine de taille finie


Proposition de modèle…

activation


Conclusion et perspectives…

• étude qualitative: distinction entre deux types de confinement

• étude quantitative: mesure du temps de confinement et estimation de la taille

• 1ère mise en évidence de l’existence des radeaux lipidiques dans les membranes de cellules vivantes au repos

Federico Belloni PhD PACA/Zeiss

Fabien Conchonaud PhD

Laure Wawrezinieck PhD

Annie BonedAnnemarie LellouchArnauld Sergé

Didier Marguet

Nadia Djaker PhD

David Gachet PhD

Patrick FerrandPierre-François LenneSerge Monneret Jérôme Wenger

Hervé Rigneault

Un grand merci à:

H. Qasmi et N. Bertaux pour les simulationsN. Sandeau pour les calculs de volumes confocauxF. Conchonaud pour toutes les préparations de cellules et les mesures de FRAPO. Würtz et A. Boned pour la biochimieO. Hawchar et Y. Hamon et H-T He pour les mesures sur Jurkat

et P-F Lenne, H. Rigneault et D. Marguet pour leur soutien sans faille

http://apophis/

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