Ecologie microbienne de la digestion anaérobie : techniques de ...

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    05-Jan-2017

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  • cologie microbienne

    de la digestion anarobie

    Techniques de numhration et disolement (1)

    Jean-Louis GARCIA, Jean-Pierre GUYOT

    Bernard OLLIVIER, Monia TRAD, Claude PAYCHENG*

    Lfude de la mfhanisafion de rsidus cellulosiques solides dindustrie agro-alimenfaire (cassettes de betterave sucrire puises), a ncessit la mise au point ou llaboralion de techniques appropries pour la numration des principaux groupes bactriens impliqus dans le processus de digesfion anarobie. Les meilleurs rsultats ont t obtenus avec des milieux contenant 50 o/. de jus de digesteur.

    Divers inoculums ont t analyss. Pour le plus performant dentre eux provenant dune digestion de rsidus de tannerie, la population totale, estime au microscope en pifluorescence, est de lordre de 1OO bacfrieslml. La microflore dominanie est acidifiante et anarobie stricte et les souches isoles ont t essentiellement reconnues appar- tenir aux genres Bacillus et Clostridium.

    M~ts-dBs : Digestion anarobie -- Numrations ~-- Isolements - Bactries acidifiantes.

    MICROBIAL ECOLOGY OF ANAEROBIC DIGESTION. TECHNICS OF NUMERATION AND ISOLATION. During ihe study of melhane production from cellulosic solid by-products of agroalimenlary industry such as leached sugar-beet cassettes, various technics and culture media have been adapted or performed for numeration of main bacterial groups implicafed in ihe anaerobic digestion process. Enumeration media were significantly improved by addition (I/l, V/U) of Ihe supernatant liquid from the digesters. Various inocula were analysed. The more efficienl wilh respect to methane produclion was from a plant with tannery by-products; this inoculum confained about lOIo bacterialml counled by fluorescence microscopy. The dominant microflora was acidogenic and strictly anaerobic; characterization of acido- genic strains was performed. In the digesters inoculated with the tannery by-products, species of the Bacillus and Clostridium genus were principaly identified.

    Key worda : Anaerobic digestion - Numerations - Isolations - Xcidogenic bacteria.

    Introauction

    Les donnes sur lcologie microbienne des digesteurs anarobies sont encore peu nombreuses en ce qui concerne la numration des microflores spcifiques et la nature, lvolution et les inter- relations des populations microbiennes impliques (MAH et SUSSMAN, 1967; SIEBERT et coll., 1968; HOBSON et SHAW, 1973; SPOELSTRA, 1978; IANNOTTI et coll., 1978; TOUZEL et coll., 1981).

    Il est certain quune meilleure connaissance de ces microflores et des phnomnes intimes de la

    digestion anarobie permettrait de contrler la fermentation. Dans les annes venir, on peut rai- sonnablement esprer pouvoir utiliser dans les digesteurs des associations mixtes de bactries per- formantes qui serviront dinoculums pour un substrat dtermin.

    Pour tudier le processus de mthanisation des cassettes de betterave puises, nous avons effectu la numration des diffrents groupes bact- riens dans des inoculums de diverses origines et dans les cultures obtenues lors de la digestion anaro- bie des cassettes.

    (1) Cette 6tude a 8t6 ralis6e sur contrat COMES no 80.75.303. * Laborafoire de Microbiologie O.R.S.T.O.M., Centre de Recherches IRCHA, B.P. no 1, 91710 Vert-le-Petit, France.

    Cah. O.R.S.T.O.M., sr. Biol., no 45, 19X?: 3-1.;.

  • 4 .J. L. Garcia, J. P. Guyol, H. Ollivier, 31. Trad, C. Paycheng ~____ ._ ~ ~~~_. ._

    Des souches bactriennes dominantes ont t isoles et sommairement caractrises en vue de lexprimentation de cultures mixtes.

    Ma&ie1 et mthodes

    1. TECHNIQUES DK NUMRATION

    Lchantillon analyser est prlev sous N2, puis introduit dans une bote gants anarobie comportant un sas dentre (La Calhne, Bezons). Il est ensuite homognis dans un Potter et des suspensions-dilutions sont prpares laide de seringues striles de 1 ml dans des tubes de Hungate contenant de leau rduite (solution de K,HPO, A 6 g/l : 50 ml ; solution minrale de BALCH et coll. (1979) : 50 ml; NaHCO 3 : 5 g; solution de rsazurine 0,2 o/. : 0,2 ml ; eau distille : 900 ml) puis on ense- mence diffrents milieux de numration. En fin dopration, lchantillon homognis ainsi que les tubes de suspensions-dilutions sont sortis de la bote A gants pour la ralisation dautres numrations (fig. 1).

    DIGESTEUR i-1 ECHANTILLON

    Fig. 1. - Schma de r&alisation des diverses numkrations bactkisnnes.

    La population totale est estime directement au microscope en pifluorescence.

    Deux types de numrations sont raliss :

    ~~~ une estimation des populations de hact6- ries anarobies par mise en vidence de mtabolites produits et calcul du nombre le plus probable (MPN). Cest le cas des dnitrifiantes, des rnthanignes et des acidifiantes pour lesquels les mtabolites produits sont, recherchs par chromatographie en phase gazeuse (N,O, CH,, H, et acides gras volatils). Les bactries sulfato-rductrices sont estimes par la mthode des filtres Millipore (MolJnARwr 1970, 1971),

    ~ un dnombrement des bacl,ries en fonc- tion de leur sensibilit loxygne :

    - bactkries anakrobies facultatives et arobies ensemencees sur bot,es de PBtri g8loskes ct incubees en prsence dair ;

    - bactries anarobies non oxygne-sensibles ense- menckes en prkscnce dair en tubes-vanille gloss (tubes de I

  • cologie microbienne de la digestion anarobie 5

    L-cystine-HCl, H,O et de Na$, YH,O. Les tubes ensemencs dans la bote ti gants (5 tubes par dilution, 5 ml de milieu par tube) sont amens sur une rampe de gazage g 8 postes o lon effectue le vide puis un gazage avec un mlange renfermant 80 y0 dH, et 20 y0 de CO,. La pression dans les tubes est ajuste 2 bars puis on met en incubation pendant 3 semai- nes.

    Latmosphre des tubes prsentant une crois- sance est alors analyse par chromatographie en phase gazeuse pour dceler la prsence de CH.,. On utilise un chromatographe dtection en ionisation de flamme (FID) dans les conditions suivantes :

    Colonne: acier inox 1,s m x 1/8 remplie de 10 y0 carbowax 20 M sw chromosorb Q SO-100 mesh.

    lempratures: colonne : tempkraturc ambiante ; injecteur : 1150 ; dtecteur : 2500.

    DCbifs gaz: N, (vecteur) : 25 ml/mn ; H, : 30 ml/mn ; air : 300 ml/mn.

    Dans ces conditions, le temps dlution de CH, est de 16 s.

    1.3. Numralion des bactries acidifiantes

    Le milieu utilis est celui de ZEIKUS ef coll. (1980) auquel est ajout 1 Oloo dune solution de slnite de sodium 17,3 mg/l. Sa prparation est identique celle du milieu pour mthanignes mais on utilise un mlange renfermant 80 yo dN,, et 20 yo de CO, pour gazer les tubes. La pression dans les tubes est ajuste 0,5 bar.

    Aprs une incubation de 15 jours, latmos- phre des tubes prsentant une croissance est analyse par chromatographie en phase gazeuse pour dceler la prsence de H,. On utilise un chromatographe dtection par conductibilit thermique (TCD) dans les conditions suivantes :

    Colonnes : 2 colonnes acier inox 1,80 m x 1/8 remplies de carbosphre 60/80 mesh.

    Temp&atures: colonne : 850 isotherme ; injecteur : 1050 ; dtecteur : 1500.

    Courant filaments: 100 mA.

    Dbit gaz N, (vecteur): 45 ml/mn.

    Dans ces conditions, le temps dlution de H, est de 13 s.

    1.4. Yunlratiorl des bactries dnitrifianks

    La composition du milieu est la suivante : NaNO,, 0,5 g; Nutrient Broth (Difco), 8 g; Eau distille, 1 000 ml. Sa prparation est identique & celle du milieu pour mthanignes. On utilise de lazote pour gazer les Lubes de Hungate. La pression

    Cah. O.H..S.T.O.M., sr. Hiol., no 45, 1.982: 3-l.;.

    est ajute 0,5 bar environ. On introduit 1 ml dac- tylne dans chaque tube avant lincubation.

    Latmosphre des tubes prsentant une crois- sance est analyse par chromatographie en phase gazeuse pour dceler la production de N,O dont la rduction ultrieure se trouve bloque par lactylne (YOSHINARI et KNOWLES, 1976). On utilise un chromatographe dtection par conductibilit ther- mique (TCD) dans les conditions identiques aux prcdentes mais avec lhlium comme gaz vecteur et un couranl aux filaments de 250 mA. Le temps dlution de N,O est de 7 mn (fig. 2A).

    1.5. Numralion des baciries sulfalo-rductrices

    La numration des bactries sulfato-rduc- trices est une donne intressante, en raison de leur comptition avec les mthanignes pour le flux dlectrons servant la rduction des substrats. On filtre 50 ml dune dilution au centime de lchan- tillon sur filtre Millipore HA-O,45 p, puis le filtre est introduit dans un tube vis renfermant 50 mg de FeS et entirement rempli de milieu appropri (Kimax 125 x 16). On visse le bouchon sans laisser de bulle dair, puis on incube et on note le nombre de jours ncessaires au noircissement complet du filtre. On se rfre ensuite une courbe donnant en fonction de la dure dincubation observe, le log du nombre initial de bactries. Cette courbe a t tablie g partir de dilutions connues issues dune culture pure de Desulfooibrio oulgaris. La composition du milieu et sa prparation sont adaptes de celles du milieu de MOURARET (1971, 1972) :

    A (=VO,, 0,5 g; MgSO,, 7H,O, 2 g; Na,SO,, lOH,O, 1 g; CaCl,, 2H,O, 0,l g; NH,Cl, 1 g; lactate de sodium & 60 %, 6 ml ; eau distille, 800 ml) ; B (K,HPO,, 5 g; eau distille, 100 ml); C (sel de Mohr, 0,5 g; eau distille, 100 ml). Les solutions A et B sont strilises 20 mn 120 et la solution C par filtration. On mlange les 3 solutions aprs refroi- dissement; pH 7,l.

    1.6. Numration des bactries anarobies faculta- tives

    Sur des botes de Ptri renfermant de lagar nutritif (Difco) on tale 0,2 ml de chaque dilution. Les colonies sont comptes laide dune loupe binoculaire aprs quelques jours dincubation en arobiose.

    1.7. ~Vumration des bactries anarobies non oxy- gne-sensibles (non OS)

    La prparation du milieu et sa composition sont identiques k celles du milieu pour bactries

  • 6 J. L. Gurcia, J. P. Guyot, B. Ollivier, M. Trud, C. Paycheny

    A

    C2H2

    I ,

    18

    H,

    B

    4

    CO2

    ! 1 , , 1

    0 248

    iV

    ~

    iC

    1

    D

    AGV

    H

    __II- I I , , , , , , , , , ,

    0 8 12 18 24 30

    MINUTES

    ALCOOLS

    8

    I

    0 3 8 9 12

    E

    ACIDES ORGANIQUES

    S

    P

    F 33 0 L 0 8 12 1

    Fig. 2. Chromatogrammos des analyses dc gaz, alcools CL acides.

    Cah, O.H.S.T.O.M., A-. Biol., n 43, 1982: 3-15.

  • cologie microbienne de la digestion anarobie 7

    acidiflantes mais la rsazurine est remplace par 12 ml dune solution de bleu de bromothymol (1 g dans 25 ml de soude N/lO et 475 ml deau). De lagar (5 g/l) est incorpor au milieu, puis celui-ci est rparti en tubes de 16 (14 ml/tube) qui sont plongs dans leau bouillante puis maintenus dans un bain- marie Q 45O. Le milieu est alors ensemenc puis coul dans des tubes vanille de Raibaud en prsence dair. Les bactries ont donc t en contact avec 0, mais elles sont incubes en conditions anarobies strictes. Seules pourront crotre celles qui ne sont pas sen- sibles a loxygne. Les tubes positifs virent du vert au jaune. On peut galement compter les colonies dans les tubes contenant les dilutions extrmes.

    1.8. Numration des bactries anarobies oxygne- sensibles (OS)

    Le milieu est identique au prcdent mais les botes de Ptri sont prpares et ensemences en bote gants anarobie puis places dans un container muni dun manomtre, dun septum pour les prlve- ments de gaz et dun robinet de gazage (BALCH et coll., 1979) pour tre incubes labri de loxygne dans un mlange N,-CO, (SO-20 %). Le dnombre- ment des colonies permet de calculer le nombre total de bactries anarobies. Le nombre de bactries anarobies OS est obtenu par diffrence avec celui des bactries anarobies non OS.

    2. TECHNIQUES DISOLEMENT DES SOUCHES BAC- TRIENNES

    Des isolements de bactries ont t raliss au cours des numrations effectues sur divers inoculums et pendant la digestion anarobie des cassettes de betterave en msophilie et en thermo- philie. Pour cela on est parti de colonies obtenues sur botes de Ptri ou en tubes de Raibaud et de cultures provenant des dilutions ultimes positives pour lactivit recherche. Dans la plupart des cas, il sagit donc de bactries dominantes. Ces souches sont tudies sommairement puis les plus intressantes sont conserves en vue dtudes ultrieures en cultures mixtes pour la mise au point dinoculums appropris.

    2.1. Bactries anarobirs facullatiues

    Ce sont les plus faciles isoler, du fait de labsence de prcaution vis--vis de loxygne. Les colonies obtenues sur botes de Ptri sont tales sur de nouvelles botes.

    L,opration doit tre rpte plusieurs fois pour assurer la purification des souches qui sont

    Cah. O.R.S.T.O.M., sr. nio/., no 45, 1.982: 3-l;.

    ensuite conserves sur glose nutritive incline en pilulier vis 4 OC.

    Lidentification sommaire consiste effectuer la coloration de Gram et celle des flagelles selon la technique de Rhodes (1958)) la recherche de loxydase et de la catalase et lanalyse des produits de la fer- mentation du glucose par chromatographie en phase gazeuse. Les alcools, les acides gras volatils (AGV) et les acides organiques sont dtects en ionisation de flamme (FID) dans les conditions suivantes :

    AGI (COUPLET et coll., 1979)

    Colonne: acier inox de 2,70 m x 1/8" remplie de chromosorb WAW 80-100 mesh, imprgne do 25 y0 NPGA (Neopentylglycol adipatc) et 2 % HaPOo.

    TempCatures: colonne : 1900 isotherme ; injecteur : 2000 ; detecteur : 2450.

    Ddbils gaz: N? (vecteur) : 17 ml/mn ; H, : 30 ml/mn ; Air : 120 ml/mn.

    Injection: 2 pl de lchantillon dilue de moiti avec de lacide formique & 40 +&

    Ltalonnage est ralis laide dune solution talon contenant 1 ml de chacun des AGV pour 100ml deau. Cette solution est dilue de moiti dans lacide formique 40 %. La succession des pics est repr- sente sur la fig. 2 D.

    Alcools

    Colonne : acier inox de 2 m x 1 /S remplie de Porapak Q 80-100 mesh.

    Les conditions opratoires sont identiques celles qui sont utilises pour les AGV. Ltalonnage est ralis laide de solutions talon dalcools dilues au l/lOOe (thanol, propanol et butanol). La succession des pics est reprsente sur la fig. 2 C.

    Acides organiques

    La colonne et les conditions opratoires sont identiques celles qui sont utilises pour les AGV. On procde la mthylation pralable des acides organiques non volatils par le mthanol en milieu sulfurique. Le driv mthyl est extrait par le chloroforme. Des essais sont actuellement en cours pour amliorer la mthylation et la dtection. La succession des pics est reprsente sur la fig. 2 E.

    Si la souche tudie produit du gaz lors de la fermentation du glucose, on la teste sur une galerie AP1 20 E (AP1 SYSTEM, La Balme-les-Grottes) qui permet didentifier les entrobactries.

    2.2. Bactries anarobies strictes

    On les isole a partir des botes de Ptri incubes en containers anarobies, 1 partir des tubes de Raibaud employs pour la numration des bact-

  • 8 J. L. Garcia, J. P. Guyof, B. Ollivier, M. Irad, C. Paycheng

    ries non OS et 1 partir des tubes de numration des batteries acidifiantes.

    Pour les colonies en botes de Ptri, on opre comme pour les bactries anarobies facultatives mais en effectuant les manipulations dans lenceinte anarobie. Les souches pures sont conserves sur glose incline en tube de Hungate sous atmosphre de Ns-CO, (SO-20 %).

    Pour les colonies en tube de Raibaud, il suffit de couper le tube lgrement au-dessus de la colonie et de transfrer celle-ci laide dune pipette pasteur quipe dune (t propipette )), dans un milieu faible- ment glos en tube de Veillon dont le contenu est ensuite dilu dans plusieurs tubes successifs (RAIBAUD et coll., 1966). Aprs incubation, on prlve les colo- nies comme il vient dtre indiqu et on les tale sur glose nutritive en bote de Ptri. Lincubation est effectue en container anarobie.

    Pour lidentification sommaire de ces souches, on opre comme pour les bactries anarobies faculta- tives. Une identification plus pousse peut tre obtenue avec une galerie AP1 20 A.

    2.3. Bactries mfhanignes

    Lisolement de ces bactries est une opration trs longue et fastidieuse car leur croissance est lente et elles sont souvent mles dautres bactries quil est difficile dliminer.

    Il faut dabord effectuer plusieurs enrichisse- ments successifs sur le milieu de numration en tubes haute pression (BALCH et coll., 1979), par repiquages de 0,l ml dans 5 ml de milieu neuf. Lapparition de CH,, est suivie par chromatographie aprs 3 semaines dincubation sous atmosphre de H,-CO, (80-20 %) a la pression de 3 atm.

    Les colonies sont obtenues sur bote de Ptri aprs dilution et talement de la suspension sur milieux gloss incubs en container sous atmosphre dHa-CO, (SO-20 %) la pression de 3 bars, ou bien en roll-tubes aprs ensemencement dans la masse de milieux gloss a 2 o/O maintenus au bain-marie 450, ou encore en tubes de Raibaud contenant un milieu 0,5 o/O dagar pour les bactries utilisa- trices dactate.

    Les colonies sont repiques plusieurs fois dans les mmes conditions. La purification ultime des souches peut ncessiter lemploi dantibiotiques spci- fiques comme la cphalotine et la clindamycine (GODSY, 1980) ou la pnicilline G et la D-cyclosrine (ZINDER et MAH, 1979).

    2.4. Bactries sulfafo-rducfrices

    A partir des tubes inoculs avec le filtre Millipore et prsentant un net noircissement, on prlve 0,2 ml de culture que lon introduit dans 50 ml

    Cah. O.R.S.T.O.M., sr. Biol., no 45, 1982: 3-15.

    de milieu au lactate de sodium en flacon srum de 125 ml, dont latmosphre est constitue par un mlange de Ns et de CO, (SO-20 %). 1,es flacons sont placs ltuve 350 pendant 1 2 semaines. Cinq repiquages successifs sont effectus avant dtaler la culture sur botes de Ptri gloses qui sont ensuite incubes dans un container + Gaspak Anaerobic System o (Biomrieux, Lyon). Les colonies de bact- ries sulfato-rductrices sont rvles par lapparition de taches noires. La purification ncessite plusieurs repiquages dans les mmes conditions. Les souches pures sont conserves 4 OC sur glose incline en tubes de Hungate sous atmosphre de Ns-CO,.

    Des bactries utilisant lactate ou le pro- pionate peuvent galement tre recherches dans les mmes conditions (WIDDEL et PFENNIG, 1981). Elles pourront se rvler utiles pour les expriences de cultures mixtes.

    2.5. Bactries dnifrifianfes

    Leur importance est secondaire pour le processus de digestion anarobie. Mais la recherche de souches dnitrifiantes anarobies strictes est intressante car on ne connat actuellement aucune espce de ce type capable de rduire le nitrate en gaz.

    On ralise les isolements a partir des tubes de numration fortement positifs, par des enrichisse- ments successifs sur le mme milieu puis talement en bote gant anarobie sur botes de Ptri geloses qui sont incubes en anarobiose en container anaro- bie.

    Pour leur identification on procde comme pour les bactries anarobies.

    2.6. Bactries ufilisanf le propionafe

    Ces bactries qui sont encore assez mal connues peuvent tre indispensables pour lutter contre lempoisonnement dun digesteur conscutif a une accumulation trop importante de propionate. Leur isolement est tent partir de cultures denri- chissement en tubes de Hungate sous atmosphre N,-CO, (80-20 %) et sur milieu pour anarobies strictes dans lequel le propionate remplace le glucose comme source de carbone et o les concentrations de biotrypcase et dextrait de levure sont ramenes a 0,2 g/l.

    RBsnltats et discussion

    1. NUMERATION DES POIJULATIONS BACTERIENNES

    1.1. Mise au point des milieux

    La mise au point des milieux de numration a t effectue sur des chantillons prlevs dans un

  • cologie microbienne de la digestion anarobie Y

    digesteur de 1I.R.CH.A. fonctionnant en alimen- tation semi-continue avec des cassettes prtraites par la soude. Linoculum initial provenait dun digesteur fonctionnant avec des boues de station dpuration de rsidus de tannerie.

    Les 4 premires numrations (tabl. 1) ont t effectues avec des milieux de culture classique (BALCH et coll., 1979); les rsultats sont trs loigns de la population totale qui est de lordre de 1010 bac- tries/ml. Pour affiner la technique, diffrentes condi- tions de milieux ont t compares : (1) milieu classique, (2) remplacement de leau distille ajoute au milieu par une solution saline 0,15 M de Na,HPO, pour rtablir les conditions de salinit du digesteur et (3) remplacement de 50 o/. de leau distille par le jus

    du digesteur pralablement centrifug et strilis 45 mn 1100.

    Ladjonction de jus de digesteur amliore considrablement les rsultats (tabl. 1). Dautre part, les numrations dacidifiants producteurs dAGV et dacidifiants producteurs dH, sont identiques et correspondent probablement a une mme popula- tion. Dans les numrations ultrieures, le jus du diges- leur sera donc systmatiquement utilis et les acidi- fiants compts par lanalyse de lhydrogne produit. Pour les bactries thermophiles qui sont essentielle- ment reprsentes par des espces du genre Bacilles non productrices de gaz, les tubes positifs seront ceux qui prsenteront une croissance ou la prsence dAGV.

    Numrations bactriennes effectues sur un digesteur pilote de IIRCHA aliment en semi-continu avec des cosset.tes de betterave traites a la soude, et mis en route depuis le 16.1.81

    DATE a/4 3014 12/5 516 Il/6 19/6 3/7

    A. . V.

    y/ I

    Actate 484 34 408 146 237 2823

    .Prc~Jiorlate 352 0 0 0 0 1426

    ihltyrate 0 0 0 0 0 584

    Valrate 0 0 0 0 0 0

    Flore totale

    bab:cerie~/ml

    ..-- - -

    Sul.fator&wct.eurs 2.107 2.107 2.107 2.107 2.107

    _______ _ -

    Mthanigk&s

    Milieu 1 1,25.106 2,25.106 2,25.106 4.107 a.5.107 < 107

    Milieu 2 1,25.103 C 107

    Milieu 3 6,25.108 < 107 7.107 ----_. -__-______

    Acidif iants (AGV)

    Milieu 1 2,106 5,5.106 1.25.10 2.106 2.10* 3,5.108

    WiJ.i.er\ 2 8,5.109 1,25.10

    .Yil.icu 3 2.1010 2.109 10 g

    _- -- Acidifia&s (Hz)

    Milieu 1 2.106 5,5.106 1,25.1& 2.108 2.106 3,5.106

    Milieu 2 8,5.109 1.25.106

    Milieu 3 2.100 2.109 10 9

  • 10 J. II. tiarcia, -1. P. Guyol, B. Ollivier, Ll1. lrad, C. Paycheng

    La population de bactries anarobies facul- tatives sleve a 108 bactries/ml dans les chan- tillons (rsultat non rapport au tableau 1). La population dominante du digesteur est donc compose danarobies strictes avec une trs nette dominante des bactries acidiflantes. Le 18/6, un incident a entran la mise lair du digesteur pendant 2 heures. Cette opration sest rpercute sur lanalyse du lendemain (tabl. 1) qui a dmontr une chute de toutes les populations bactriennes except les sulfato- rducteurs qui sont non oxygne-sensibles (non OS).

    Les jus de quatre digesteurs diffrents ont t compars quant leur influence sur la numration des bactries mthanignes dans le digesteur prc- dent. Les rsultats sont quivalents : 4.10 avec le jus de digesteur de cassettes, 1,75.107 avec le jus de digesteur de fientes de poules inocul par un lisier de bovin, 1.10 avec le jus de digesteur de boues de station dpuration de rsidus de tannerie et 1,25.107 avec le jus de digesteur de fientes de dindes. Le choix de jus de digesteur pour la prpa- ration des milieux de numration ne semble donc pas influer sur le rsultat des numrations. Par la suite, nous avons utilis le jus du digesteur de cassettes puis un jus de rumen frachement prlev.

    1.2. .,l pplicalion divers inocultrms

    Trois inoculums dilfrents ont t analyss dans les conditions dcrites prcdemment : un eflluent du digesteur pilote de 1I.R.CH.A. aliment avec des boues de station dpuration de rsidus de tannerie (RT); le rumen dun buf frachement abattu ; une boue de la station dpuration de Colombes. Des numrations ont galement t effec- tues sur des cultures en fermenteur de 2 litres au cours de la digestion des cassettes ayant subi diff- rents prtraitements.

    Les rsultats sont rapports au tableau II. En msophilie, la population totale est de lordre de 10g 10r bactries/ml; dans presque tous les cas, la proportion de bactries anarobies facultatives est voisine de 1 70. Les bactries anarobies non oxygne- sensibles (non OS) sont relativement nombreuses et voisines de 10 pour 100. Les bactries acidillantes reprsentent la population la plus nombreuse dans les chantillons analyss, except pour la boue de station dpuration qui prsente une prdominance de bactries sulfato-rductrices lesquelles sont habi- tuellement peu nombreuses (1 pour mille). Les bact- ries mthanignes sont de lordre de 1 o/O dans lino-

    Numrations bactriennes effectues sur divers inoculums

  • cologie microbienne de la digestion anarobie 11

    Analyse sommaire des bactries anahobirs facultalivrs (digosteur avec rsidus de tannerie-Il?)

    a# Ftmentatfon

    Identi te

    : pr@sun&e

    .3 /-

    RT 1

    RT 2

    RT 3

    RT 4

    RT 5

    RT 6

    RT 7

    RT 8

    RT 9

    3T 10

    ?T 11

    IT 12

    ?T 13

    IT 14

    IT 15

    IT 16

    1T 17

    IT 18

    Il 19

    Il 20

    LT 21

    1T 22

    LT 23

    !T 24

    !T 23

    +

    +

    t

    t

    t

    +

    t

    +

    t

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    t

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    t

    t

    _

    _

    t

    +

    t

    BaCiltUS

    Baci 2 lus

    Bacill~e

    Bacittue

    Bacilltie

    Baci 1 Lue

    Baci 1 lus

    N. D.

    Bacillus

    Baci 1 lus

    Proteus VuLgari,

    Micrococcus

    Ba~itlue

    Baci 1 lue

    Ban 1 ztts

    Bacltue

    Akaligenes

    A8FCmoM.4

    Lietetia

    Bfzcilzus

    Bacillue

    Bacil lue

    LIUCo>u>G t4C

    LuuconostoC

    Lis teric

    ND : non determine. V Variable

    Cah. O.Zf.S.T.O..%Z., sr. Hiol., nu 45, IYS?: 3-1.5.

  • J. L. Gurcia, J. P. C;u!lot, B. Ollivier, AIf. irad, C. Pauchenu

    culum ou les fermenteurs inoculs avec lellluent de rsidus de tannerie ainsi que dans le jus de rumen mais moins nombreuses (1 o/,,,,) dans les boues de Colombes. Les bactries dnitrifiantes sont peu nombreuses mais atteignent cependant 1 Oloo dans le jus de rumen et la boue de Colombes.

    En thermophilie, lellluent de rsidus de tanne- rie ne renfermait pratiquement que des bactries acidifiantes.

    2. ISOLEMENT DE souc~m PU~S

    Tout au long des numrations prcdentes, des isolements de souches dominantes ont t effec- tus pour les diffrents groupes bactriens tudis.

    2.1. Bactries anarobies facultatives

    Ce sont les plus faciles & obtenir puisquelles croissent trs bien a lair. Elles sont essentiellement reprsentes par des bactries acidifiantes dont certaines fermentent le glucose avec production de gaz mais, aprs analyse dtaille des souches, on trouve galement quelques bactries arobies strictes.

    - -

    Les rsultats correspondant aux efIluents de digesteur fonctionnant avec des rsidus de tannerie, au jus de rumen frachement prlev et 5 une boue de la station dpuration de Colombes sont rapports respectivement aux tableaux III et IV. Pour les rsidus de tannerie, on trouve plus de 70 o/. de Bacillus et pratiquement une seule entro-bactrie, Proteus vulgaris. Dans le jus de rumen, nous navons pas dcel de bactries gram + mais deux souches dEscherichia coli. Sur les dix souches isoles dans la boue de station dpuration, cinq sont des cocci et une seule entrobactrie, Enterobacter agglomerans.

    Lanalyse des acides produits par les souches acidifiantes retenues, sur le milieu utilis pour lisole- ment, est rapporte au tableau V. La plus forte pro- duction a t obtenue avec deux souches thermo- tolrantes et surtout avec une souche de Bacillus qui a produit 3,6 g/l dacide lactique. A quelques excep- tions prs, laccumulation dactate semble prpon- drante pour la plupart des souches.

    2.2. Bactries anarobies strictes

    I,a presque totalit des souches isoles est reprsente par des espces sporules du genre

    TARIXAU IV

    Analyse sckmaire des bactkries anarobies facultatives isoles dl1 jus de Rumcn (JR) et des houes dc la station dpuration de Colombes (BC)

    BCI - + + - + - + + Listeria

    BCZ + - + Listeria

    8C3 - - + + Acinetobacter

    BC4 + + - - + + Pseudomonas

    BC5 - + + + Neisseria

    BC6 - + + Aerococcus

    BC7 - - + + + Mormel~a

    EC8 - - + + + Paracoccus deni'rificans

    BC9 - + + Pseudomonas

    BCIO + + + + Enterobacter aggZomerans

    Cah. O.R..S.l'.O.l~l., zr. Viol., nu 4.i, 1.982: 3-1-j.

  • cologie microbienne de la digestion anarobie --- 13

    No Souche % % J

    5

    .z .Y .F % 3 .o

    s k .r .F .z

    Lsolement collec- >zii 3

    u 2 u tien 2 2 8 ?8 2

    RT1 Al 0,20 0.22 NO ND NO 0,42

    RT2 A2 0,53 0.53

    RT3 A3 0.23 0,lO 0.33

    RT4 A4 0.22 0.29 0.51

    RT5 A5 0,25 0.25

    RT6 A6 0,28 0,28

    RT7 A7 0.30 0,30

    RT10 A8 0.34 0.34

    RT11 A9 0.57 0,57

    RT13 AlOT 1.29 0.65 0.05 - 1.99

    RT15 A1lT 0.84 0.67 0.04 - 1.55

    RT19 Al2 0,51 0.51

    RT20 A13 0.56 0.56

    JR2 Al4 0.51 0.51

    JR4 A15 0.47 0.47

    JRs A16 0.22 0,22

    Bcl A17 0.20 0.25 0.01 0.46

    ec4 A18 0,21 0,Ol 0.08 0,30

    %o A19

    0.19 0.03 0.45 0,06 0,73

    RT21 A20 0.38 0.61 0.02 0.10 0,Ol 1.12

    RT23 A21 0.41 0.09 3.63 0,03 4.16

    RT24 A22 0.08 0.21 0.01 0.30

    RT25 A23 0.25 0,28 0.69 0.01 0.01 1.24

    RT : rsidus de tannerie - JR : jus de t-urne" - BC : boue de COLOMBES -

    - NO : non determine -

    Clostridium pour la plupart productrices de gaz. Lanalyse des acides forms par les souches retenues est rapporte au tableau VI. Sur les 12 souches ana- lyses, 9 produisent de lacide butyrique.

    2.3. Autres bactries

    Les enrichissements et isolements de souches mthanignes, sulfato-rductrices, dnitrifiantes et syntrophiques (actate ou propionate) feront lobjet dautres publications.

    Cah. O.R.S.T.O.M., sr. Biol., na 45, 1982: 3-15.

    Conclusion

    Ces recherches prliminaires effectues dans le cadre de ltude de la mthanisation de rsidus cellu- losiques solides dindustrie agro-alimentaire tels que les cassettes de betterave sucrire puises, ont ncessit ladaptation ou la mise au point de tech- niques et milieux de culture pour mieux cerner lcologie microbienne de la digestion anarobie.

    Linfluence bnfique de ladjonction de jus

  • 14 .J. II. Garcia, .J. P. Guyot, B. Ollivier, Al. Trad, C. Paycheng

    TABLEAU VI

    Production d;mides (g/l) pnr Ins souches ncidifinnfcs :~naivobics strictns retcnrws

    N Souche

    % = 2 %

    tsolement collet- .F .E

    2

    .F z 2 .z .F .

    .Q; .z 5

    tion 2 w 4 z 2 A

    B : : 2 lz lz

    RTS1 AS1 0.11 0.03 0,lO 0,Ol 0.25

    RTS2 AS2 0.14 0.02 0.10 0.26

    RTS3 AS3 0.23 0,50 0.02 0.75

    RTS4 AS4 0,09 0.03 0.20 0,Ol 0,33

    RTS5 AS5 1.18 1.96 0.34 0,05 0,02 3.55

    RTS12 AS6 0,49 0.60 0.01 1.10

    RTS13 AS7 0.41 0.60 0,02 1.03

    RTS14 AS8 0,36 0,52 0,05 0.01 0,94

    RTS15 AS9 0.35 0,72 1.07

    RST16 AS10 0.34 0.56 0.07 0.01 0,Ol 0,99

    RTS 10

    AS11 0.42 0.73 0.01 0.01 1,17

    RTS1l AS12 0,36 0,90 1,26

    de digesteur ou de rumen dans les milieux, constate par plusieurs auteurs, est confirme par nos propres rsultats. Les bactries acidifiantes reprsentent la flore dominante des digesteurs, qui est principalement anarobie stricte. La sensibilit loxygne varie en fonction de linoculum.

    Ces techniques de numration couples

    de la digestion, permettent de suivre effkacement lvolution dun digesteur. Lisolement de bactries reprsentatives des diffrents groupes impliqus dans le processus devrait conduire la ralisation dexpriences de cultures mixtes pour la mise au point dun inoculum adapt au substrat digrer.

    lanalyse des acides gras volatils produits au cours Manascril rep na Seroice des I?ditions le 28 mai 1982

    Cah. O.R.S.T.O.M., sr. Biol., no 45, 1982: 3-l;;.

  • &ologie microbienne de la digestion artarobie 15

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