Chem.-Biol. Interactions, 35 (1981)297--300 297 © Elsevier/North-Holland Scientific Publishers Ltd.

EFFET D'ANESTHESIQUES LOCAUX SUR LE TRANSFERT DE MANNOSE DANS LES MEMBRANES MICROSOMIQUES D~SPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM

ROBERT LI~TOUBLON et RENI~ GOT

Laboratoire de Biologie et Technologie des Membranes, Universitd Claude Bernard, Lyon I, 43 Bd du II Novembre 1918, 69622 Villeurbanne C~dex (France)

(Re~u le 16 Decembre 1980) (Accept~ le 7 Fevrier 1981)

SUMMARY

The influence of various local anaesthetics has been studied on the mannose transfer enzymic system which is localized in Aspergillus niger van Tieghem microsomal membranes. The n-alcanes and tertiary amines do not seem to react on the first step of the reaction: i.e. the polyprenylphosphate-mannose biosynthesis. However two amines, the dibucaine and to a lesser extent the tetracaine, inhibit the mannose transfer from the polyprenylphosphate- mannose to the endogenous proteins.

RI~SUMI~

Nous avons ~tudi~ l 'action de divers anesth~siques locaux sur le syst~me membranaire de transfert de mannose dans les microsomes d'AspergiUus niger van Tieghem.

Les n-alcanes ainsi que les amines tertiaires sont sans action sur le transfert d e mannose au polyprenylphosphate; par contre, la tetraca'ine et surtout la dibcua'ine inhibe la deuxi~me partie du transfert de mannose aux prot~ines endog~nes.

INTRODUCTION

Le fonct ionnement de syst~mes enzymatiques membranaires est li~ intime- ment ~ l 'dtat physique de la membrane; son dtude permet de suivre l 'action d'agents chimiques varies intervenant sur ou dans la membrane.

Par exemple, de petites prot~ines basiques, polycations qui interagissent en surface avec les phospholipides, on t entrain~ une forte activation du transfert de mannose ~ des accepteurs glycoprot~iques endog~nes, dans les microsomes d'AspergiUus niger [1]. Le syst~me met en jeu deux mannosyl- transf~rases, situdes sur chaque face de la membrane du reticulum endoplas-

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mique, et un transport, ~ travers la membrane, de dolichyl-phosphoryl- mannose, substrat donneur de mannose pour la seconde transf&rase [2,3]; il peut donc servir ~galement ~ tester l'action de substances intervenant au niveau de la bicouche lipidique.

Or, il est admis que les anesth~siques locaux s'incorporent dans la bicouche et dtablissent ainsi des interactions hydrophobes [4--8], ce qui a pour rdsultat d'augmenter la fluidit~ membranaire et entra~ne des effets divers au niveau de la membrane.

Le but de ce travail est de comparer l'action d'anesth~siques non ionique et d'amines tertiaires, sur le syst~me complexe de transfert microsomique de m a n n o s e .

M A T E R I E L E T M E T H O D E S

La preparation des membranes microsomiques a ddjfi dt~ d~crite [2], ainsi que les cinfitiques d'incorporation [3]. Bri~vement, le milieu d'incubation contient 100/zl d'une suspension de microsomes (0.4 mg de prot~ines) dans un tampon Tri~--I-IC1 0.05 M (pH 8.5), 5 mM en MgCl2 et 10/~1 d'une solu- tion de GDP-[U-~4C] mannose ~ 2/~Ci/ml (Radiochemical Centre, Amersham; activit~ Sl~Cifique 143 mCi/mmol). Aux temps pr~vus, les fractions lipidiques et prot~iques sont obtenues selon la mdthode de Folch et al. [9]. Les anes- thdsiques sont ajout~s au ddbut de l'incubation, soit en concentration satu- rante pour les n-alcanes, soit fi une concentration de 1 mM pour les amines.

R E S U L T A T S E T DISCUSSION

Les n-alcanes, n-pentane, n-hexane et n-heptane, sont sans action sur le transfert de msunose aussi bien au polyprenyl-phosphate qu'aux prot~ines endog~nes (Tableau I).

Par contre, certaines amines ont un effet particuli~rement int~ressant. Les trois anesthfisiques locaux test~s, la procaine, la dibuca'ine et la t~traca'ine

T A B L E A U I

A C T I O N DES N - A L C A N E S S U R LE T R A N S F E R T DE M A N N O S E A U P O L Y P R E N Y L P H O S P H A T E ET A U X P R O T E I N E S

Les ch i f f res r ep r ~s en t en t la vi tesse de t r ans f e r t de m a n n o s e en d p m / m g p r o t . / m i n d ' i n c u b a t i o n . Les m i c r o s o m e s son t repr is darts les d i f f~rentes so lu t ions saturfies en n-a lcane e t les c o n d i t i o n s d ' i n c u b a t i o n s o n t celles d~cri tes dans Mater ie l e t Mfithodes.

Microsomes Microsomes Microsomes Mierosomes t ~m o i ns + n - p e n t a n e + n -hexane + n - h e p t a n e

T rans f e r t au p o l y p r ~ n y l p h o s p h a t e 1020 970 • 900 930

T rans f e r t aux p ro t~ ines endog~nes 450 470 480 440

2 9 9

'T 0

C).

c~ E X

E

oD 0

(a) (b)

2

0 I0 30 60 0 I0 30 60

MIN MIN

Fig. 1. Cin~tiques d'incorporation de [ '4C]mannose en l 'absence (=) et en pr~sence de procaine (e), de dibucaIne (o) et de t~traca~[ne (A) ~ une concentrat ion 1 raM. (a) Trans- fert au dolichyl-phosphate ~ part ir du GDP-mannose. (b) Transfert aux glycoprot@ines endogSnes d partir de dolichyl-phosphorylmannose.

sont 6galement sans action sur la GDP-mannose:dolichyl-phosphate man- nosyl-transf6rase, situ6e du cStd cytoplasmique de la membrane du reticulum. Au contraire, la dibuca'ine inhibe tout transfert aux prot~ines au bout de 5 rain, la procaine est toujours sans action et la t~traca'ine a un effet inter- m6diaire (Fig. 1). Ainsi, la dibuca'ine permet litt~ralement de d~coupler le deuxi6me transfert, sans modifier la cindtique du premier. Elle peut agir directement au niveau de la mol6cule de la dolichyl-phosphoryl-man- nose:glycoprot6ine mannosyl-transfdrase situde de l'autre cSf~ de la mem- brane. Mais elle peut agir 6galement sur le transport intramembranaire de

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dolichyl-phosphoryl-mannose, compos~ qui doit passer d'une face de la membrane ~ l'autre. Cette deuxi~me hypoth~se semble plus vraisemblable puisque les amines interagissent avec les phospholipides et modifient les interactions sp~cifiques hydrophobes entre lipides et prot~ines membranaires intrins~ques. Cette sp~cificit~ d'action pourrait ~galement expliquer les differences de comportement entre les trois amines qui pr~sentent cependant des caract~ristiques physico-chimiques voisines.

BIBLIOGRAPHIE

1 R. Lfitoublon et R. Got, Effet de prot~ines basiques de faible poids mol~culaire sur le transfert de mannose dans les microsomes d'Aspergillus niger, FEBS Lett., 80 (1977) 343.

2 R. L~toublon, J. Comte et R. Got, Transfert du mannose ~ partir de GDP-mannose des accepteurs lipidiques chez Aspergillus niger, Eur. J. Biochem., 40 (1973) 95.

3 R. Ldtoublon et R. Got, RSle d 'un interm~diaire lipidique dans le transfert du mannose ~ des accepteurs glycoprot~!ques endog~nes chez Aspergillus niger, FEBS Lett., 46 (1974) 214.

4 J.C. Metcalfe, P. Seeman et A.S.V. Burgen, The proton relaxation of benzyl alcohol in erythrocyte membranes, Mol. Pharmacol., 4 (1968) 87.

5 P. Seeman, S. Roth et H. Schneider, The membrane concentrations of alcohol anesthetics, Biochim. Biophys. Acta, 225 (1971) 171.

6 J. Cerbbn, NMR evidence for the hydrophobic interaction of local anesthetics, Bio- chim. Biophys. Acta, 290 (1971) 51.

7 P. Seeman, Effects of' anesthetics and tranquitizers on cell membranes, Pharmacol. Rev., 24 (1972) 583.

8 D. Papahadjopoulos, K. Jacohson, G. Poste et G. Shepherd, Effect of local anesthetic in membrane properties: I change in the fluidity of phospholipid bilayers, Biochim. Biophys. Acta, 394 (1975) 504.

9 J. Folch-Pi, M. Lees et G.H. Sloane Stanley, A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 226 (1957) 497.