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BIOCHIMIE, 1976, 58, 913-915. M6moires originaux l tude cindtique d'une nouvelle cdphalosporinase de Pseudomonas aeruginosa. R. LABIA ~, C. FABRE et M. GUIONIE. C.E.R.C.O.A.-C.N.R.S. 2 d 8, rue Henri Dunant, B.P. 28- 94320 Thiais (France). (23-4-1976). Summary. -- Pseudomonas aeruginosa strain RL 39 i~roduces an inducible cephalo- sporinase possessing an isoelectric point of 8,66. The 'kinetic constants have been measured by computerized microacidimetry. The results allc~w to differeneiate this enzyme from the one produced by Ps. aeruginosa GN 918 (Yaginuma et al. (1973) Jap. J. Microbiol., 17, 141-149) showing a similar isoelectric point. INTRODUCTION. Le Ps. aeraginosa est un germe habituellement r6sistant aux c6phalosporines traditionnelles. Une c6phalosporinase est impliqu6e dans ce m6ca- nisrne et c'est h Sabath et at. [1] que l'on doit, semble-t-il, les premibres 6tudes concernant cette enzyme. Par la suite, l'existence de diverses c6phalosporinases de Ps. aeruginosa a 6t6 d6mon- tr6e. Ces diff6rentes enzymes pr6sentent, toutefois, des analogies assez grandes, surtout au point de rue de leurs profils d'activit6 ; elles constituent la classe Id de Richmond et Sykes [2]. Nous rapportons ici quelques param6tres d'une nouvelle c6phalosporinase de Ps. aeruginosa. MATERIEL ET METHODES. 1 -- Souche bactdrienne. Le Ps. aeruginosa souche RL 39 a 6t6 iso16 au Service de Bact6riologie de l'H6pital Cochin (Paris) (Prof. Nevot) par le D r Philippon. 2 -- Culture bactdrienne et extraction de la laclamase. Nous avons respect6 le protocole exp6rimental pr6c6demment d6crit [3!, avec induction ou non par la pfnicilline G. 3 -- Constantes cindtiques. Les constantes cin6tiques (Kin et Vm) mesur@s par microacidim6trie coup16e h l'ordinateur [47. La stabilit6 enzymatique des substrats : T = Km/Vm [5] est 6galement d6termin6e. Les constantes d'inhibition sont d6termin6es selon le protocole pr6c6demment d6crit [6~. O A qui toute correspondance dolt ~tre adrcss6e. 4 -- Unite enzymatiqne. I1 convient de d6finir l'unit6 enzymatique comme 6rant la quantit6 d'enzyme capable d'hydrolyser 1 :!xmole de p6nicilline G par minute h pH 7 et 37°C. Le titre d'un extrait est donc le hombre d'unit6s par mg de prot6ines totales. En pratique, on utilise surtout mU/mg. 5 -- Eleetrofocalisation. Les points iso61ectriques (pI) sont d6termin6s sur un appareil LKB 8100, en pr6sence d'une gra- dient de sucrose et d'ampholines pH 3,5-10 ou 8- 9,5, h une temp6rature de 4°C. L'extrait enzymatique est focalis6 pendant environ 60 heures sous un potentiel variant de 200 A 600 v. de facon h limiter la puissance dissip6e dans la colonne h 1,5 watts. Aprbs collection, dans chaque fraction (environ 800 ld) on introduit 25 I~1 d'une solution de NaC1 h 10 g/l, ce qui aug- mente consid6rablement la conductivit6 61ectrique des solutions. La mesure des pH s'avbre ainsi plus rapide et plus pr6cise. RESULTATS. Les extraits enzymatiques obtenus h partir de cultures bact6rienncs r6alis6es en l'absence de tout agent inducteur ne pr6sentent pratiquement pas d'activit6 ~ lactamase. Au contraire, si l'on ajoute 3000 i~g/ml de p6nicilline G comme agent inducteur, l'activit6 ~ lactamase monte alors A environ 50 mU/mg. Dans ces conditions, l'61ectrofocalisation r6ali- s6e en pr6sence d'ampholines pH 3,5-10 met en 6vidence un seul pic d'activit6 enzymatique vers pH 8,7. Ce point iso61ectrique est pr6cis6 sur gra- dient 8-9,5, il vaut pI = 8,66 estim6 h ___ 0,04.

Étude cinétique d'une nouvelle céphalosporinase de Pseudomonas aeruginosa

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BIOCHIMIE, 1976, 58, 913-915. M6moires originaux

l tude cindtique d'une nouvelle cdphalosporinase de Pseudomonas aeruginosa.

R. LABIA ~, C. FABRE et M. GUIONIE. C . E . R . C . O . A . - C . N . R . S . 2 d 8, rue H e n r i Dunan t , B.P. 2 8 - 94320 Th ia i s (France) .

(23-4-1976).

Summary. - - Pseudomonas aeruginosa strain RL 39 i~roduces an inducible cephalo- sporinase possessing an isoelectric point of 8,66. The 'kinetic constants have been measured by computerized microacidimetry. The results allc~w to differeneiate this enzyme from the one produced by Ps. aeruginosa GN 918 (Yaginuma et al. (1973) Jap. J. Microbiol., 17, 141-149) showing a similar isoelectric point.

INTRODUCTION.

Le Ps. aeraginosa est un germe habi tue l lement r6sistant aux c6phalosporines t radi t ionnel les . Une c6phalosporinase est impliqu6e dans ce m6ca- nisrne et c'est h Sabath et at. [1] que l 'on doit, semble-t-il, les premibres 6tudes concernan t cette enzyme. Par la suite, l 'existence de diverses c6phalosporinases de Ps. aeruginosa a 6t6 d6mon- tr6e. Ces diff6rentes enzymes pr6sentent , toutefois, des analogies assez grandes, surtout au po in t de rue de leurs profils d 'activit6 ; elles const i tuent la classe Id de Richmond et Sykes [2].

Nous rappor tons ici quelques param6tres d 'une nouvelle c6phalosporinase de Ps. aeruginosa.

MATERIEL ET METHODES.

1 - - S o u c h e bac tdr ienne .

Le Ps. aeruginosa souche RL 39 a 6t6 iso16 au Service de Bact6riologie de l 'H6pital Cochin (Paris) (Prof. Nevot) par le D r Phi l ippon.

2 - - Cul ture bac tdr ienne et ex t rac t ion de la laclamase.

Nous avons respect6 le protocole exp6r imental pr6c6demment d6crit [3!, avec induc t ion ou non par la p fn i c i l l i ne G.

3 - - Cons tantes c indt iques .

Les constantes cin6tiques (Kin et Vm) mesur@s par microacid im6tr ie coup16e h l ' o rd ina teu r [47. La stabilit6 enzymat ique des substrats : T = Km/Vm [5] est 6galement d6termin6e.

Les constantes d ' i nh ib i t ion sont d6termin6es selon le protocole pr6c6demment d6crit [6~.

O A qui toute correspondance dolt ~tre adrcss6e.

4 - - Uni te e n z y m a t i q n e .

I1 convient de d6finir l 'uni t6 enzymat ique comme 6rant la quanti t6 d 'enzyme capable d 'hydro lyser 1 :!xmole de p6nic i l l ine G par minu te h pH 7 et 37°C.

Le titre d 'un extrait est donc le hombre d 'uni t6s par mg de prot6ines totales. En prat ique, on uti l ise surtout mU/mg.

5 - - E lee t ro foca l i sa t ion .

Les points iso61ectriques (pI) sont d6termin6s sur un appare i l LKB 8100, en pr6sence d 'une gra- dient de sucrose et d ' amphol ines pH 3 ,5-10 ou 8- 9,5, h une temp6rature de 4°C.

L 'extrai t enzymat ique est focalis6 pendan t env i ron 60 heures sous un potentiel var ian t de 200 A 600 v. de facon h l imiter la puissance dissip6e dans la colonne h 1,5 watts. Aprbs collection, dans chaque f ract ion (environ 800 ld) on in t rodu i t 25 I~1 d 'une solution de NaC1 h 10 g/l, ce qui aug- mente cons id6rablement la conduct ivi t6 61ectrique des solutions. La mesure des pH s'avbre ainsi plus rapide et plus pr6cise.

RESULTATS.

Les extraits enzymatiques obtenus h pa r t i r de cul tures bact6r ienncs r6alis6es en l 'absence de tout agent induc teur ne pr6sentent p ra t iquement pas d 'act ivi t6 ~ lactamase. Au contraire , si l 'on ajoute 3000 i~g/ml de p6nic i l l ine G comme agent inducteur , l 'activit6 ~ lactamase monte alors A env i ron 50 mU/mg.

Dans ces condi t ions , l '61ectrofocalisation r6ali- s6e en pr6sence d 'amphol ines pH 3 ,5-10 met en 6vidence un seul pic d 'activit6 enzymat ique vers pH 8,7. Ce point iso61ectrique est pr6cis6 sur gra- dient 8-9 ,5 , il vaut pI = 8,66 estim6 h ___ 0,04.

914 R. Labia, C. Fabre et M. Guionie.

Le tableau I r6sume les constantes cin6tiques Km, Vm et r, de diverses p6nic i l l ines et c6pha- losporines. L 'ampic i l l ine , la carb6nic i l l ine et la

TABLEAU I.

Constantes cin~tiqnes : K m ¢~/M), Vm (r~[drence : p~nieilline G) et • (rd[~rence : pduicilline G).

P6nieilline G P6nieilline V Ampieilline Carb6nieilline Tieareilline Cloxaeilline C6phalotine C6phaloridine C6phalexine C6fazoline C6famandole

Km Vm (~M) (rel) (tel)

1,1 100 100 0,84 60 127

hydrolyse dimeilement d~teetable

39 800 443 57 I 535 1 968

2,8 33 l 771 400 6400 1 568

2,6 4,11 5765

c loxaci l l ine qui ne sont pas hydrolys6es de fa~on d6celable ont ~t6 6tudi6es en tant qu ' inh ib i - teurs [6].

TABLnAU II.

Coustantes d'inhibitions. Pour l'ampicilline et la cloxacilline k~ et k~ n'ont pas pu dlre mesur~s.

Ampieilline . . . . . . . . . . . Cloxaeilline . . . . . . . . . . Carb~nieilline . . . . . . . . . Tleareilline . . . . . . . . . . .

k4 (t.mole -l.

S-1)

248 000 383 000

k s IS -t)

4,05.10 ~ 6,74.10 -3

Ki pM

0,32 2.10-3 1,6.10 -3 1,84.10 ~

Le tableau II r6sume les Ki ainsi que les eonstantes k 4 et k 5 (Ki = k J k 4) de la r6act ion :

k4 E + I ~ E - I

k5 Cette r6aet ion repr6sentant la fo rmat ion rever- sible du eomplexe enzyme (E) - Inh ib i t eur (I).

Cependant k 4 et k 5 u 'ont pas pu 5tre d6termin6s pour l ' ampic i l l ine et la c loxaei l l ine en raison de la rapidi t6 plus grande de cet 6qui l ibre vis-h-vis de ees ant ibiot iques.

DISCUSSION.

La souehe de Ps. aeruginosa RL 39 p rodu i t une seule ~ laetamase induet ib le de type e6phalospo- rinase.

La eompara i son de eette enzyme avee quelques e6phalosporinaSes d6erites dans la l i t t6rature est ins t ruct ive. Dans le tableau III, nous avons regroup6 quelques parambtres earaet6r is t iques de e inq e6phalospor inases d6jh connues, ainsi que les param6tres cor respondants de notre nouvel le enzyme. Cette n ouvelle enzyme est nomm6e type C faisant suite aux types A et B d6erits pr6c6dem- ment [31.

On peut d 'a i l leurs constater que les constantes ein6tiques de l ' enzyme type C se r app rochen t tr~s for tement de celles de l ' enzyme type A [3], plus pa r t i eu l i6 rement pour la c6phalot ine et la c6pha- lor idine. Cependant , les points iso61ectriques per- met tent de les d i f f6rencier sans aucune ambiguit6.

La not ion de stabilit6 enzymat ique [5] • = K m / V m caraet6rise va lab lement le eompor t emen t enzyme-substrat , puisque • est p ropor t ionne l h la demi-vie du substrat aux faibles concent ra t ions , en pr6sence &enzymes. Sous eel aspect, on v6rifie

TABLEAU III. Comparaison de einq edphalosporinases de Ps. aeruginosa

ddcrites et de la cdphalosporinase type C.

Souche ou enzyme

NCTC 8203 Bobrowski souche 28 Yaginuma souehe GN 918 Type A Type B Type C

pl

7,5

?

8,7

9,2 6,67 8 , 6 6

P6nicilline G Km(~M)

13

?

12

2,4 0,9 1,1

C6phalotine

Km (~M) Vm

450 420

- - 140

132 53

41 890 8,5 780

39 800

C6phaloridine

Km (izM) Vm

130 700

400 290

156 770

51 605 18,9 740 57 535

Cloxacilline Ki (rzM)

0,03

0 , 18

0,023

0,015 0,003 0,002

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 8.

E t u d e d 'une nouve l l e cdpha lospor inase de Ps . a c r u g i n o s a . 915

que la c6pha lo t i ne , la c ~ p h a l o r i d i n e , la c6pha le - x i n e et la c6 fazo l ine ont des c o m p o r t e m e n t s ~qu iva len t s p u i s q u e l eurs x ne v a r i e n t que d ' u n f a c t e u r deux , t end i s que leurs Vm v a r i e n t d ' u n f ac t eu r vo i s in d:e d e u x cents. Une c o m p a r a i s o n de ces an t i b io t i ques , bas6e u n i q u e m e n t su r les Vm a n r a i t d o n c c o n d u i t ~t des c o n c l u s i o n s t o t a l e m e n t e r ron6es . Le c6famar tdo le p r~sen te un c o m p o r t e - mer i t assez s ingu l i e r , son Km est fa ib le (2,6:uM), ma i s son V m e x t r ~ m e m e n t bas e n t r a i n e un e n v i r o n d i x lo is s u p 6 r i e u r h ce lu i des au t res c 6 p h a l o s p o r i n e s . Cet te r~s i s t anee a c c r u e h ee t te

l a c t a n m s e n 'es t p o u r t a n t pas suff isante p o u r r e n d r e le c 6 f a m a n d o l e ac t i f sur le Ps. aernginosa.

Not re e n z y m e t y p e C p r~sen te un p o i n t iso~lec- t r i q u e ana logue h ce lu i de la c ~ p h a l o s p o r i n e p ro- du i te p a r la s o u c h e GN 918, d~cr i t e p a r Y a g i n u m a et al. [10] : 8,66 c o n t r e 8,7.

C e p e n d a n t les eons t an t e s c in6 t iques s ' avb ren t d i f f6rentes , en p a r t i c u l i e r p o u r la c6pha lo t ine . Le Vm de la c ~ p h a l o t i n e vis-h-vis de la s o u c h e GN 918 ~tant p a r t i c u l i ~ r e m e n t has.

De t0utes facons , i l est t ou jou r s d61icat de corn- p a r e r des p o i n t s i so61ect r iques mesu r6s dans des l a b o r a t o i r e s d i f f6rents . Un e x e m p l e r 6 e e n t i l l u s t r e ce fair : le R - f a c t e u r RGN 14 c o d e une p6n ic i l l i - nase d o n t le p o i n t i so61ect r ique a at6 donn~ p o u r 5,1 [7]. Cet te va le u r a ensu i te ~t~ co r r ig~e "5 5,4 [8].

Une c o m p a r a i s o n p lus p r e c i s e des cSpha lospo- r i na se s p r o d u i t e s p a r les souches GN 918 et RL 39 n 'a , h~las, pas 6t~ poss ib le .

CONCLUSION.

Nous cons t a tons que l ' ~ven ta i l des c6pha lospo- r inases de Ps. aeruginosa s ' e n r i c h i t d ' u n e n o u v e l l e e n z y m e . Cet te e n z y m e p r~sen te des ca rac t6 r i s t i - ques qu i p e r m e t t e n t de la p l a c e r dans la classe Id

de R i c h m o n d et Sykes E2] c o m m e c 'es t d ' a i l l eu r s le cas de toutes les c 6 p h a l o s p o r i n a s e s de Ps. aern- ginosa a e t u e l l e m e n t connues .

La m u l t i p l i c i t 6 de ces c ~ p h a l o s p o r i n a s e s n ' e s t pas O o n n a n t e p u i s q u e ces e n z y m e s sont essen t ie l - l e m e n t de n a t u r e c h r o m o s o m i q u e . Un seul cas de c ~ p h a l o s p o r i n a s e t r an s f6 r ab l e a lou te fo i s 6t~ s igna l6 [9], i l s ' ag i t d ' u n t r a n s f e r t de P. mirabiIis h E. coll. Toute fo i s , ce t te d e r n i ~ r e c 6 p h a l o s p o r i - nase s 'es t iden t i f i6e h une c 6 p h a l o s p o r i n a s e ch ro - m o s o m i q u e de E. coll. Le p r o b l b m e des c6pha lo - s p o r i n a s e s p l a s m i d i q u e s res te d o n c e n c o r e en suspens .

R ~ s v ~ .

Le Ps. aeruginosa souche RL 39 produit une c~pha- losporinase inductible de point isodlectrique 8,66, dont les constantes cin~tiques ont 6t~ ~tudi~es par micro- acidim~trie coupl~e h l 'ordinateur. Les donn6es cin~- tiques permettent de diff6rencier cette enzyme de celle produite par le Ps. aeruginosa GN 918 (Yaginuma et al. (1973), Jap. J. Microbiol., 17, 141-149) qui prdsente un point iso~lectrique voisin.

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BIOCIIIMIE, 1976, 58, n ° 8.