Wilhelm Roux's Archives 184, 57 73 (1978) Roux's Archives of Developmental Biology �9 by Springer-Verlag 1978

Etude de la migration des cellules somitiques dans le m~soderme somatopleural de l'6bauche de raile*

A1ain Chevallier

Equipe de recherche associbe au C.N.R.S. n ~ 621: ~<Morphogen&e exp6rimentale~>, Laboratoire de Zoologie et Biologie animale, Universit6 scientifique et m6dicale de Grenoble, B.P. 53, F-38041 Grenoble Cedex, France

Migration of Somitic Cells Into the Somatopleural Mesodcrm of the Limb Anlage

Summary. In chick embryos, observations were made on serial semithin transverse sections of the wing level. In addit ion homo- or heterotopic replacements of the wing or leg somitic mesoderm by labelled somitic or non- somitic mesoderm were made in 2-to 2.5-day embryos. The nuclear label used was either natural (quail donor embryos in heterotopic transplantat ions) or isotopic (chick donors labelled with tritiated thymidine).

Histological examinat ion revealed that the first somitic cells to leave somite 15 apparent ly did so at the 20 to 22 somite stage, while the last ones to leave somite 20 apparent ly did so shortly before the 36 somite stage.

Transplanta t ion experiments with labelled donor cells revealed the routes of migra tory somitic cells and the t ime-course of their invasion into the outgrowing limb bud (non-somitic graft cells did not noticeably invade the limb anlage). They showed fur thermore that the somitic mesoderm is not regionalized with respect to its limb myogenic properties.

These results are compared with those obtained in other classes of verte- brates.

Key words: Somitic mesoderm - Limb development - Migrat ion - Origin of limb musculature.

Introduction

La part icipat ion du m & o d e r m e somitique dans le d~veloppement du bourgeon de membre chez les Vert~br& t&rapodes a fait l 'objet de nombreux travaux,

* Ce travaiI a 6t~ subventionne en partie par la D.G.R.S.T. et le C.N.R.S.

Ce memoire constitue une partie de la th&e de doctorat d'Etat qui sera soutenue par l'auteur devant l'Universit6 scientifique et m6dicale de Grenoble

0340-0794/78/0184/0057/$ 3.40

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rant vers la fin du si6cle dernier que depuis une quinzaine d'ann6es. Chez les Batraciens, les exp6riences d'Amano (1960) et de Finnegan (1963) sur Faxo- lotl, puis plus r6cemment de Bourgeois et Houben (1975) sur le pleurod61e, ont montr6 la participation effective des cellules du somite /t l'6dification du membre.

Chez les Reptiles, d'anciens travaux de Mollier (1893, 1895) et de Corning (1900), qui avaient aussi 6tabli cette participation, ont 6t6 confirm6s par les r~sultats plus r6cents de Raynaud (1962, 1971, 1972a) et de Raynaud et Vasse (1968-1969). Ces auteurs ont par ailleurs sugg6r6 que le m6soderme somitique exerce sur la prolif6ration des cellules somatopleurales une influence stimulante (Raynaud, 1972b; Raynaud et Vasse, 1971; Vasse, 1974).

Chez les Mammif~res cette participation a d'abord ~t6 contest6e (Butcher, 1929; O'Rahilly et Gardner, 1975; Milaire, 1956, 1963, 1965), malgr6 quelques travaux anciens (Fischel, 1895; Lewis, 1901; Zechel, 1924) qui l'admettaient chez l'homme. Mais les travaux recents de Milaire (1976) et de Houben (1976) chez la souris et la taupe, ainsi que les experiences in vitro d'Agnish (1976) ont montr6 qu'il y avait effectivement des coul6es de cellules somitiques en direction du m6soderme somatopleural.

Chez les Oiseaux, malgr6 les travaux de Maj (1901) qui montraient une colonisation diffuse du bourgeon de membre par des celtules originaires du m6soderme somitique, on a pens6 longtemps, ~i la suite des r6sultats exp&imen- taux de Hamburger (1938) et de Saunders (1948), que cette participation n'exis- tait pas, bien que le m6soderme somitique exewfit une influence inductrice pr6coce et s61ective stimulant la morphogen6se des 6bauches comme Font montr6 les travaux de Murillo-Ferrol (1963, 1965), de Pinot (1969-1970) et de Kieny (1969-1970-1971). I1 faut attendre les travaux de Gumpel-Pinot (1974), de Christ, Jacob et Jacob (1974) etnos propres exp6riences (Chevallier et al., 1976) pour que les premi&es d~monstrations exp6rimentales d'une colonisation du m6soderme somatopleural par des cellules de m6soderme somitique soient r~ali- s6es en utilisant le marquage /t la thymidine triti6e ou la technique des greffes h6t6rosp6cifiques caille-poulet.

Dans nos exp6riences d'implantation de m6soderme somitique de caille dans un h6te poulet et inversement, de m6soderme somitique de poulet dans un h6te de caille (Chevallier et al., 1977), les embryons ont 6t6 fix6s apr6s un temps d'incubation relativement long (8 jours apr6s l'op6ration) et les r6sultats ont permis de montrer, en particulier, que dans ces combinaisons h6t6rosp6cifi- ques, les cellules somitiques participaient/L l'6dification de la musculature intrin- s6que du membre en dormant naissance, en totalit6 ou en pattie, ~ la portion charnue du muscle, tandis que les tendons 6taient d'origine somatopleurale. Pour compl6ter ces r6sultats, il m'a sembl6 indispensable d'entreprendre, d'une part, une 6rude descriptive d6taill6e de la morphogen6se pr6coce du m6soderme somitique au niveau du bourgeon d'aile pour tenter de mettre en 6vidence,

l'aide de coupes semi-fines s6ri6es faites chez des embryons de poulet de 19 /t 36 paires de somites, l'existence d'un passage de cellules somitiques vers le mbsoderme somatopleural et, d'autre part, de suivre, par des fixations 6chelon- n6es de 1 /t 6 jours apr6s l'op6ration, la destin6e de ces cellules ~t l'int6rieur de l'6bauche de membre non seulement dans des combinaisons h6t6rosp6cifiques

Migration des cellules somitiques dans le m6soderme de l'aile 59

c a i l l e / p o u l e t , m a i s a u s s i d a n s d e s t r a n s p l a n t a t i o n s h o m o s p ~ c i f i q u e s p o u l e t / p o u -

le t , off le g r e f f o n e s t p r 6 a l a b l e m e n t m a r q u 6 fi la t h y m i d i n e t r i t i~e .

Matbriel et m6thodes

Les exp6riences ont bt6 faites sur des embryons de poulet de race Leghorn blanche, ou sur des embryons r6sultant d 'un croisement de race Wyandotte x Rhode Island Red, et sur des embryons de caille japonaise (Coturnix coturnix.japonica).

L'~tude descriptive de la morphogen+se pr6coce de l'aile en coupes semi-fines a 6t6 effectu6e sur des embryons de poulet figbs de 2 / t 2,5 jours d'incnbation (19 g 36 paires de somites; stades 13 fi 15 de Hamburger et Hamilton, 1951), tandis que les exp+riences de transplantation ont +t+ r~alis6es fi l'aide d'embryons de poulet, fig6s de 16 5. 28 paires de somites et d 'embryons de caille d'fige ~quivalent.

Les exp6riences ont consist6/t exciser un fragment de m6soderme somitique par transplantation ortho- ou h6t@otopique, et / t le remplacer, soit par un tron?on de m6soderme somitique de m6me longueur (s~ries exp@imentales), soit par un fragment de tissu non somitique, en l'occurrence de tube digestif d 'embryon de caille de 5 jours d'incubation (s~rie t6moin), Figure 1.

Dans les s~ries exp@imentales, deux types de marquage nucRaire ont 6t+ utilis6s pour distinguer les cellules greff+es de celles de l'hbte.

1. Marquage ~ la thymidine tritiOe

Les embryons donneurs ont re?u 12 h avant l 'op6ration une injection de 6 gCi de thymidine triti6e dans 0,05 ml de solution aqueuse (thymidine m+thyle-3H, activit+ sp~cifique 25 Ci/mM; service des moRcules marqu6es, C.E.N. de Saclay).

2. Marquage naturel des cellules de caille

L'embryon donneur est un embryon de caille, l 'embryon h6te un embryon de poulet. Le Douarin et Barq (1969) ont montr6 que dans cette combinaison, apr6s coloration par le r6actif de Schiff, les cellules de caille et de poulet peuvent 6tre distingu6es les unes des autres grfice 5' leurs caracteres nucl6aires.

Le greffon de caille est constitu6 par un trongon d'une longueur 6gale/t 6 somites ou somites pr6somptifs. I1 est pr~lev~ entre le niveau du 56me et du 326me somite ou somite pr6somptif et est implant6, soit au niveau du territoire pr~somptif de l'aile (niveau des somites 15 20), soit au niveau du territoire pr6somptif de la patte (niveau des somites 2 6 - 3 2 ; tableau I). Le greffon est implant6 de telle sorte que ses 3 axes soient en concordance avec ceux de l'hbte.

Le greffon marqu6 fi la thymidine triti6e provient de la r6gion <<aiR>> ou <<patte>> d'embryons dont les figes s'6chelonnent entre 14 et 21 paires de somites et est implant~ au niveau ~<aile>> uniquement, sur des embryons de 11 fi 19 paires de somites. Les embryons ont ensuite 6t6 fix6s apr+s un temps d'incubation compris entre 8 et 96 h apr6s l'opbration.

Dans le cas des associations utilisant la thymidine triti6e, les embryons ont 6t6 fix6s ~ l'alcool acetique. Puis, d6paraffin+es et hydrat~es, les coupes ont subi l'action de l'acide perchlorique /t 2,5% pendant 30 mn fi 4 o C. Apr~s avoir ~t~ lav~es fi l'eau distilRe, elles sont plong6es selon la m6thode du <<dipping~> dans l'6mulsion nucRaire (K5 de Ilford). Apr+s une exposition de 3 mois et le d6veloppement de l'6mulsion, les coupes ont +t6 color6es /t l'h6malun-+osine. Darts le cas des associations caille-poulet, les tissus ont 6t6 fix6s au liquide de Helly, coup6s fi 7,5 ~tm, puis color6s par la r6action nucl6ale de Feulgen et Rossenbeck.

Les fragments d 'embryons destin+s aux coupes semi-fines ont 6t6 fix6s pendant 15 mn dans une solution fi 2% de glutarald~hyde dans le tampon de Michaelis (pH 7,7), puis lav6s pendant 3 h darts le tampon seul, postfix6s dans une solution /~ 1% de t6troxyde d'osmium dans le tampon Michaelis pendant 1 h fi 4 ~ C. Puis Ies pi6ces sont d6hydrat+es/t l'6thanol et incluses dans l 'Epon. Elles sont ensuite coup6es et dispos6es de faqon s~ri6e puis color6es fi 60~ par le bleu azur I-bleu de m6thyRne, s6ch6es et mont+es ~ l'Euparal.

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TD

Tube diges~if de coille de 5 jours

14 15~

14.. t I~1~1V embryon de cail[e

\t~ " ~ oo

5

16

A. Chevallier

Migration des cellnles somitiques dans le mesoderme de l'aile 61

Tableau 1. Repartition des cas experimentaux en fonction de l'origine du greffon et du lieu d'implantation

Niveau de Numero Niveau de Nombre prelevement de la l'implanta- de cas du greffon serie tion (en p. totanx (en paires de somites) de somites)

Temps de fixation apr~s l'operation

8 h 18h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h

5 - 1 0 1 15-20 12 - 6 6 15 20 2 15-20 35 6 1 17 - 4

3 ~ 15-20 50" 13 ~ 15 ~ 22 ~ 20 26 4 15 20 5 1 2 6 - 3 2 5 15-20 14 6 3 - 1

6 ~ 15 - 2 0 20 ~ 6 ~ 7 ~ 7 ~ 15-20 7 2 6 - 3 2 2 2 20 - 26 8 26 - 32 2 2 2 6 - 3 2 9 2 6 - 3 2 1 1

1 1 - 5

1 I 1 1 1 1 1 1

Les chiffres suivis d'un " representent le cas des embryons marq@s /t la thymidine tritiee

R6sultats

I. Etude descriptive de Ia morphogen&e pr&oce du membre ant&'ieur

Je ne reprendrai la description de la diff6renciation du somite et de la formation du myotome, qui ont fait l'objet de ptusieurs travaux recents (Pinot, 1974; Christ et al., 1974-1977; Mestres et Hinrichsen, 1975), que dans la mesure off elle est n6cessaire pour illustrer la relation entre l'6tat de diff6renciation du somite et le moment off les cellules du bord lat6ral du dermo-myotome ~migrent en direction du mesoderme somatopleural.

Cinq stades ont bt6 6tudi~s.

Stade 13 (19 paires de somites). Les somites 15-20, correspondant au territoire presomptif de l'aile, forment chacun un massif cellulaire plein et grossidrement cylindrique. Au niveau du 206me somite presomptif, ce massif possede encore des cellules toutes semblables (fig. 2a), mais ~ un niveau anterieur (somites 15-19) les cellules p6ripheriques de ces massifs acquierent une structure 6pithe- liale tandis que des cellules d'aspect mesenchymateux en occupent le centre.

Fig. l a et b. Schemas des operations. Les operations consistent /t remplacer sur un embryon de poulet, de fa~on orthotopique ou heterotopique, un tron~on de mesoderme somitique adjacent au territoire presomptif de l'aile (ou de la patte, non repr~sente), par un fragment de tube digestif de mame longueur pr61ev6 sur un embryon de caille de 5 jours d'incubation (fig. Ia) ou par un tron~on de m6soderme somitique preleve sur un embryon de poulet marque fi la thymidine tritiee ou sur un embryon de caille (fig. lb). E: ectoderme 61imin& Zone hachure: territoire pr6somptif de l'aile de l'h6te. Les chiffres indiquent la numerotation des somites ou des somites presomptifs

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Les somites,/t ce stade, sont nettement d~limitSs part rapport aux tissus environ- nants; on ne voit s'en d~tacher que des prolongements cellulaires, mais aucune cellule nuctSe (fig. 2b).

Stade 14 (22 paires de somites). Les 3 somites post6rieurs du niveau de l'aile (18 -20) prhsentent un dispersement de la rSgion ventrale de l'~pithhlium somiti- que. Seule la r4gion dorsale, le dermo-myotome et la r~gion tourn6e vers le tube neural conservent une structure 6pithhliale. Le dermo-myotome est shpar6 par une cavite de la rhgion sous-jacente; celles-ci est d'aspect m~senchymateux, et constitue le scl6rotome. Dans les 3 somites antbrieurs du niveau de l'aile (15-17) , la r6gion dorsale du somite donne naissance au dermatome propre- ment dit et au myotome; celui-ci se diffSrencie/t partir du bord dorsal mhdian du dermatome et en-dessous de lui. La localisation et l 'orientation de certaines cellules du bord lathral du dermatome suggSre qu'elles entreprennent par dessus le canal de Wolff une migration en direction lat~rale off elles se perdent tr6s rapidenent parmi les cellules du m~soderme somatopleural (fig. 2c).

Stade 15 (25 paires de somites). Tous les somites du niveau pr~somptif de l'aile ont acquis l'+tat de diff6renciation atteint par les somites 1 5 - 1 7 du stade pr6c6dent et la migration de cellules somitiques y est visible de fagon plus accentu6e (fig. 2d).

Stade 17 (30 paires de somites). Au niveau de l'aile, la formation du dermatome et du myotome se termine. Un rudiment de myoc4le est encore pr6sent au niveau des somites 18-20 . Des cellules paraissent continuer /t se d4tacher du bord lateral du dermatome en direction du mbsoderme somatopleural (fig. 2e).

Au niveau des somites 15 - 17, la croissance du myotome en direction ventrale fait compl~tement disparaitre le myoc~le et la r~gion somitique dorsale est alors constitu6e de deux couches superpos4es : une couche externe, le dermatome, form6e de cellules orienthes perpendiculairement /~ l 'ectoderme et une couche interne, le myotome dont les cellules sont orient6es perpendiculairement/t celles du dermatome (Mestres et Hinrichsen, 1975). A c e moment, la limite lat6rale entre le dermatome et le mhsoderme somatopleural et celle entre le myotome et le mbsenchyme scl6rotomal sont tr~s nettes et on n'y voit plus gu~re de cellules suceptibles de quitter le dermatome, tandis que cette migration en direc- tion du m6soderme somatopleural est encore visible (bien que difficilement) tant que le myocSle reste pr4sent au niveau des somites t 8 - 20.

Stade 18 (36 paires de somites) T o u s l e s somites de la zone pr6somptive de l'aile ont fini leur diff6renciation en dermatome et en myotome. Le myoc61e a completement disparu et le bord ventral du myotome est enti@ement constitu~ de myobtastes. Toute migration en direction lat@ale a apparemment cess~ (fig. 2r).

On peut conclure de ces observations que des celhfles indiffSrenci~es se deta- chent du bord lat6ral du dermo-myotome ~t partir du stade off celui-ci est individualis8 par rapport fi la r6gion ventrale sclhrotomale et jusqu'au moment off la disparition du myoc61e marque la s6paration distincte du dermatome

Migration des cellules somitiques dans le m+soderme de l'aile 63

Fig. 2 a - f . Coupes transversales d'embryons de poulet, color6es au bleu azur l-m6thyl6ne, illustrant les modifications histologiques du m~soderme somitique au niveau de l'6bauche de l'aile, a Embryon de 19 paires de somites: niveau du somite pr~somptif 20. A c e niveau, le cordon somitique (CS) appara~t sous la forme d'un massif cellulaire homog6ne, grossi~rement cylindrique, b Embryon de 19 paires de somites: niveau du somite 19. Ce somite pr6sente une zone centrale d'aspect m6senchymateux, tandis que les cellules p6riph&iques acqui6rent un aspect 6pith6lial. Aucune cellule somitique n'est visible en dehors des limites du somite, e Embryon de 22 paires de somites: niveau du somite 17. La rfigion inf&ieure du somite a perdu son organisation 6pith+liale, tandis que les premi&es cellules somitiques (fl6ches) semblent quitter le bord lat&al du dermo-myotome (DM). d Embryon de 25 paires de somites : niveau du somite 17. De nouvelles cellules somitiques semblent se diriger vers le m~soderme somatopleural (fl6che) tandis que les cellules myotomales (M) se diff&encient sous le dermatome (D). Le myoc61e est bien visible (My). e Embryon de 30 paires de somites: niveau du somite 19. La couche de cellules myotomales (M) s'6tend sous la majeure partie de la largeur du dermatome (D), r+duisant consid6rablement le myoc+le (My). Des cellules somitiques paraissent toujours quitter le dermatome (fl+che). f Embryon de 36 paires de somites: niveau du somite 19. Le myoc~le a compl~tement disparu car les celkfles myotomales (M) forment une couche qui double enti6rement le dermatome (D). L'aspect relativement c l o se t arrondi du bord lat&al du dermatome et du myotome sugg&e que toute migration lat&ale a cess6. Grossisse- ment: toutes les photographies sont au manae grossissement et la barre repr6sente 500 ~tm

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et du m y o t o m e , En d ' au t r e s termes, il a p p a r a i t que les premieres cellules ~t qui t ter le somi te 15 le font entre les s tades 20 et 22 paires de somites , t andis que les de rn i6 re s / t qui t ter le somite 20 le font entre les s tades 30 et 36 paires de somites.

Ces donnbes restent cependan t entach6es d ' une cer ta ine impr6cis ion, car il est imposs ib le d ' a f f i rmer , sur la base de ces observa t ions stat iques, que la mig ra t ion des cellules somit iques s 'effectue s t r ic tement p e n d a n t la p6r iode dblimi- t6el.

H. ROsultats exp~rimentaux

Le t ab leau 1 mon t r e les diverses t r ansp lan ta t ions h o m o - o u h6t6ro topiques qui ont 6t6 r6alis~es. Celles-ci ont 6t6 prat iqu6es au niveau p r6sompt i f de l 'ai le ou de la pat te . Quel que soi l le type de greffe r6alis6e, les r6sultats h i s to log iques ont 6t~ les mames. C 'es t pou rquo i j ' a i 6t6 amen6 g regrouper les r~sultats en t ro is ensembles : (1) h n p l a n t a t i o n d 'un t rongon de tube digest i f de cail le dans un h6te pou le t (s6rie t6moin). (2) I m p l a n t a t i o n de m6soderme somi t ique de caille dans un h6te poulet . (3) I m p l a n t a t i o n de m6soderme somi t ique marqu6 /~ la t hymid ine triti6e dans un h6te pou le t non marqu6.

1. Implantation d'un tronfon de tube digestif de caille dans un hbte poulet (skrie t~moin). Le t ron~on de tube digest i f a 6tb implant6 au n iveau de la zone p r6somp- t i re de l 'a i le (niveau des somites 1 5 - 2 0 ) . Des f ixat ions pr6coces ont permis d 'obse rver , 24 h apr6s l ' op6ra t ion , que le greffon a pris l ' a spec t d ' u n tube creux

lumi6re 6troite et g pa ro i 6paisse d 'of l l ' on ne volt gu6re se d6tacher de

Fig. 3a - f . R6sultats histologiques de ['implantation, au niveau du territoire pr6somptif de ['aile d'un embryon de poulet, d'un fragment de tube digestif d'embryon de caille de 5 jours d'incubation (figs. aet b) ou d'un tron~on homologue de m~soderme somitiq?,le prelev~, sur un embryon donneur de caille, au niveau des somites 15 -20 (greffes orthotopiques, Fig. c) ou des somites 26-32 (greffes hSt6rotopiques, Figs. d, e elf). a,b Respectivement, h6te 15 et 13 paires de somites; fixation 5 et 6 jours apr6s l'op6ration. Les cellules de caille du greffon (C) forment un amas dense autour du tube digestif (TD) et co/onisent, fi proximhe immediate de la zone d'implantation, entre le tube neural (TN) et le futur humerus (H), le m6senchyme de la base du bourgeon d'aile (a, ,) Cependant quelques cellules de caille issues du greffon ont migr6 plus loin et sont visibles le long des trajets nerveux od elles participent ~t la formation de la gaine de Schwann (b, fl6ches). Ces cellules tirent vraisemblablement leur origine des 61~ments nerveux ganglionnaires entourant le tube digestif au moment de l'excision, e H6te 15 paires de somites; donneur 23 paires de somites; fixation 24h apr6s l'op6ration. Les cellules de caille provenant du somite (S), encore peu nombreuses, sont dispers6es dans le m6senchyme somatopleural (fl6ches). Quelques-unes sont regroup6es autor d'un capillaire sanguin (,). d HSte 10 paires de somites; donneur 20 paires de somites; fixation 72 h apr6s l'op+ration. La coupe montre le massif musculaire de caille (Muc), limit8 par deux lignes pointill6es, qui s'est form8 dans le m6senchyme de poulet (Mep) • proximit8 du futur humerus (H). e, f H6te 12 paires de somites; donneur 18 paires de somites; fixation 96 h apr6s l'opSration. La rue d'ensemble (e) permet de situer les deux 6bauches musculaires (Muc), form6es de cellutes de caille, par rapport au massif cartilagineux qui donnera l'hnm6rus (/4) et au m6senchyme (Mep) constitues de cellules de poulet (f). Le massif musculaire constitu6 essentiellement de cellules de caille est limite par deux lignes pointill6es. Grossissement: la barre reprSsente 500 ~tm

Migration des cellules somitiques dans le m~soderme de l'aile 65

66 A. Chevallier

D

V

Fig. 4. R~sultats histologiques de l 'implantation orthotopique, au niveau du territoire prbsomptif de l'aile, d'un trongon homologue de m~soderme somitique pr61ev~ sur un embryon donneur de caille. H6te 16 paires de somites; donneur 17 paires de somites; fixation 48 h apr~s l'op6ration. La coupe longitudinale du bourgeon d'aile permet de voir la r6partition des deux blast6mes pr&muscu- laires de type caille (Muc) de part et d'autre de l'axe du bourgeon qui est encore occupb par un m~senchyme lfiche de type poulet (Mep). Grossissement: la barre repr6sente 500 ~tm

cellules migrantes. Par contre, des fixations plus tardives (5 et 6 jours apr6s l'op6ration) ont permis de pr6ciser que si la ptupart des cellules de caille sont rest6es group&es en une structure tubulaire 5- paroi 6paisse, un certain nombre d'entre elles ont subi une migration localis6e et ont colonis6 le m6senchyme lfiche de la base de l'~bauche de l'aile, 5- proximit6 imm6diate du lieu d'implanta- tion (fig. 3 a), tandis que d'autres encore ont migr6 plus loin et ont 6t6 retrouv6es, dispersdes en petits amas de quelques cellules, autour des vaisseaux sanguins ou le long du trajet de certains cordons nerveux (fig. 3b) mais en aucun cas elles n'ont form6 de condensations de grande taille comparables 5- celles qui se sont d6velopp~es chez des embryons de m~me 5-ge, 5. partir d 'un greffon constitu6 d'un fragment de m6soderme somitique (figs. 3 e et f).

2. Implantation de m&oderme somitique de caille dans un hOte poulet (tableau 1, saries 1 5- 9, saries 3 et 6 except6es). Soixante et onze cas ont 6t6 6tudi6s, dont 35 correspondent 5- des transplantations orthotopiques et 36 5- des transplanta- tions het6rotopiques. Ils ont ~t6 fix6s de 8 5- 96 h apr~s l'op6ration.

Fig. 5 a - h . Coupes transversales d'embryons de poulet ayant subi une greffe orthotopique (Figs. e, d et e, f) ou h6t6rotopique (Figs. a, b, et g, h) de m6soderme somitique marqu6 5. la thymidine tritibe au niveau de l'~bauche de l'aile. Les photographies de gauche sont prises en lumi+re transmise, celles de droite en lumi&e r6fl6chie, a, b, et e, d respectivement, h6tes 13 et 21 paires de somites, donneurs 21 et 17 paires de somites, fixation 24 h apr~s les operations. De nombreuses cellules marquees sont encore group6es/t proximit6 du bord lat6ral du somite (ae t c,*), mais les premi6res cellules somitiques radioactives commencent 5. migrer, en suivant de pr6f+rence le bord ventral du m6soderme somatopleural (les figures a e t b e n montrent quatre (fl6ches)), puis elles se dispersent, tout en se multipliant (noter la diminution de l'intensit~ du marquage pour certaines d'entre elles), dans le m6senchyme de l'~bauche de l'aile (e et d). e, f, et g, h respectivement, h6tes 13 et 16 paires de somites, donneurs 21 et 20 paires de somites, fixation 36 et 48 h apr~s l'op+ration. Les cellules somitiques, beaucoup plus nombreuses, par suite de leur prolif&ation (le marquage est devenu relativement faible) envahissent progressivement la r6gion centrale du bourgeon d'aile jusqu'aux 2/3 de sa longueur, ce qui repr6sente le maximum de leur aire de r~partition distale. Grossissement: la barre repr~sente 500 lam

Migration des ce]lules somitiques dans le m@soderme de l'aile 67

68 A. Chevallier

8 h apras l'operation, le greffon s'est bien integr6 dans l'embryon, mais aucune cellule de caille ne para]t s'en 6chapper.

18 h apr~s l'operation, dans 2 cas sur 13, quelques rares cellules somitiques de caille ont eta retrouvaes parmi les cellules du mesoderrne somatopleural, /t une distance d'environ 150 gm du lieu d'implantation.

24 h awes l'operation, le somite greffe a repris le cours de sa differenciation et l'on peut voir (dans 20 cas sur 27) des cellules de caille dispersees entre les cellules somatopleurales du bourgeon d'aile, soit de fagon isolee, soit par groupes de 2 ou 3 ~ proximit6 de lacunes ou de vaisseaux sanguins (fig. 3c).

36 et 48 h awes l'operation, c'est-~t-dire chez des embryons de 4 et de 4,5 jours d'incubation, tous les embryons fixes ont prasent6 des cellules de caille darts leur bourgeon de membre. On peut alors observer que les cellules de caille d'origine somitique, dont le hombre a considarablement augmente, ont tendance/t se regrouper dans certaines zones situees lateralement par rapport /t l'axe du bourgeon de membre alors occup6 par un mesenchyme lfiche (fig. 4).

60 et 72 h apres l'oparation, chez des embryons qui ont alors 4,5 et 5 jours d'incubation, on peut reconnaitre (fig. 3 d) une condensation cartilagineuse prefi- gurant l'6bauche de l'humarus, flanque des deux cetes par des condensations encore relativement peu etendues et constituees presqu'exclusivement de cellules de caille.

12 et 24 h plus tard, c'est-fi-dire chez des embryons de 5,5 et 6 jours d'incuba- tion, ce phenom~ne s'est accentu& On volt alors tres nettement au milieu d'un mesenchyme lfiche l'6bauche cartilagineuse du futur humerus et les deux conden- sations musculaires, formees de cellules de caille, qui ont acquis un developpe- ment plus grand (figs. 3 e et f).

Les stades ulterieurs n'ont pas ete &udies, car dans nos experiences precedentes (Chevallier et el., 1977) nous avons detaill6 la structure de la musculature chez des embryons fixes 8 jours apras l'operation (c'est-fi-dire fi 10 jours d'incubation) dans lesquelles les cellules de caille constituaient la totalite de la pattie charnue des muscles alors que les tendons etaient constitues de cellules de poulet.

3. Implantation de mOsoderme somitique marqu~ ~ la thymidine tritiOe dans un hate poulet non marquO (tableau 1, serie 3 et 6). I1 s'agit d'associations homospeci- fiques, ortho-ou hetarotopiques oti les greffons ont ere implantes au niveau de l'aile et ont ate fixes 24, 36 et 48 h awes l'operation.

Dans ces series experimentales, les associations homospecifiques poulet/poulet ont confirme les resultats obtenus avec les series hetarospecifiques caille/poulet.

24 h apres l'operation, comme precademment, on peut voir que les cellules marquees sont encore en assez grand nombre b, proximite de l'extremite du somite (figs. 5c et d) bien que certaines d'entre elles aient dej/~ migre darts le mesoderme somatopleural; ainsi dans les figures 5a et 5b on peut en voir quatre qui ont migre dans la region profonde du mesoderme somatopleural /t proximite de l'epithelium ceolomique, tandis que dans les figures (5c et d) ces cellules radioactives plus nombreuses que dans le cas precedent sont plut6t reparties irregulierement dans l'axe du bourgeon de membre. D'autre part, la difference d'intensite de leur marquage indique que certaines d'entre elles se sont dej/t divisees.

Migration des cellules somitiques dans le m6soderme de l'aile 69

36 h apr6s op6ration, le nombre de cellules radioactives qui ont envahi l'6bau- che du bourgeon d'aile est beaucoup plus grand tandis que t'intensit6 du mar- quage a encore diminu~. Les figures 5 e et 5 f montrent que ces cellules restent cependant toujours group6es de pr6f6rence dans la r6gion axiale du bourgeon de membre, ne colonisant pas ou tr6s peu la r6gion du m6senchyme lfiche p6riph6rique.

Ce ph6nom6ne se retrouve chez les embryons fix6s 48 h apr6s l'op6ration, dans lesquels les cellules marquees envahissent toute la r6gion centrale du bour- geo n d'aile jusqu'aux 2/3 proximaux (figs. 5 g et h).

Discussion et conclusion

Des 6tudes morphologiques sur des embryons de poulet /t l'aide de coupes semi-fines et des 6tudes exp6rimentales utilisant des greffes de m6soderme de caille ou de poulet marqu~ /t la thymidine triti6e ont permis de pr6ciser la contribution cellulaire du m6soderme somitique /t la morphogen~se de l'aile.

L'examen de coupes semi-fines a r6v616 que des cellules du mbsoderme somiti- que se d6tachent effectivement du bord lat6ral du somite. Cette migration cellu- laire, autant que des observations statiques permettent de le penser, d6bute au niveau du somite 15 chez des embryons gtge's de 20 fi 22 paires de somites, puis progresse de somite en somite dans le sens ant6ro-post6rieur pour atteindre le niveau du somite 20 chez des embryons fig6s de 23 fi 25 paires de somites. Elle se termine apparemment de la m6me fagon au niveau du somite 15 chez des embryons de 28 paires de somites et au niveau du somite 20 peu avant le stade de 36 paires de somites. Chaque somite est donc capable de fournir des cellules qui migrent dans le m6soderme somatopleural pendant le temps nbcessaire fi la formation d'une dizaine de somites, soit environ une dizaine d'heures, ce moment 6tant d6cal6 dans le temps en fonction de la position du somite le long de l'axe c6phalo-caudal de l 'embryon.

Ces rbsultats sont en accord avec ceux de Fischel (1895), de Grim (1970) et de Christ et al. (1974, 1977) qui mettent en bvidence l'existence de trMn6es cellulaires somitiques mais sans pr6ciser ni le point de d6part de la migration ni sa fur6e.

Les r6sultats exp6rimentaux ont permis de suivre les cellutes issues soit du m6soderme somitique, soit d'un tissu non somitique comme le tube digestif au cours de la morphogen6se du membre et de pr6ciser Ie moment off elles ont at6 dStectSes parmi les cellules du m6soderme somatopleural, leur localisation, variable avec l'fige, et leur destin6e. La s6rie t6moin montre d 'abord que l'implan- tation d'un fragment de tube digestif au niveau du territoire prbsomptif de l'aile n'est suivie que d'une migration de tr6s faible amplitude, la plupart des cellules restant localis6es au niveau de la zone d'implantation du greffon, les rares cellules migrantes se trouvant sur le trajet de certains nerfs ou de vaisseaux sanguins. I1 est donc peu probable que dans ces conditions, elles puissent partici- per / t la formation des muscles. Les cellules accompagnant les nerfs pourraient 6tre de futures cellules de la gaine de Schwann provenant d'616ments nerveux ganglionnaires pr6sents dans la paroi du tube digestif greff6. Par contre, les

70 A. Chevallier

cellules issues du m6soderme somitique sont capables de migrer tr~s t6t fi l'int6- rieur de l'6bauche du membre. Ces cellules, que leur marquage a rendues facili- ment identifiables, ont 6t6 en effet d6tect6es parmi les cellules du m~soderme somatopleural d+s 18 h apr6s l'op6ration, bien que dans la plupart des cas il faille attendre 24 h. Les premi6res cellules sont visibles, comme les travaux de Pinot (1974) et de Milaire (1976) le montrent aussi, soit dans la partie ventrale du m6senchyme somatopleural pr6s de l'Spith61ium coelomique, soit le long des vaisseaux sanguins. Puis, par multiplication intense, phbnom6ne qui se traduit sur les coupes par une perte de l'intensit~ de marquage, elles envahissent progressivement le m6senchyme du bourgeon de membre qui, lui- m6me fi ce stade de 28 paires de somites, commence ~t prolif6rer et fi devenir visible ext6rieurement. Ces r6sultats sont en tous points en accord avec ceux d6duits de l'examen des coupes semi-fines. En effet, les embryons fix6s 24 h apr6s l'op6ration, poss+dent de 25 fi 35 paires de somites et prbsentent, comme le montrent les coupes semi-fines d'embryons d'fige 6quivalent, de nombreuses cellules somitiques encore situ6es /~ proximit6 du somite et qui sont en train de s'en d6tacher. Mais ces exp6riences ont permis, en outre, de d~celer certaines cellules qui se sont probablement d&ach6es plus t6t et qui sont d6j/t loin dans le m6senchyme somatopleurat. Les cellules du m6soderme somitique migrent donc hors du dermo-myotome ~t peu pr6s au m6me moment chez les embryons op6r6s que chez les embryons t6moins non op6r6s. Au cours des stades ult6rieurs (24 et 48 h apr6s t'op+ration) ces cellules envahissent les 2/3 proximaux de la r~gion axiale du bourgeon de membre. I1 est int6ressant de noter que le niveau off elles s'arratent correspond ~ la zone pr~somptive de l'articulation zeugo-autopodiale et que chez l'adulte les masses musculaires sont principale- merit situ6es en arri6re de cette zone, l 'autopode ne poss6dant qu'une muscula- ture tr6s r~duite; on peut penser qu'/t partir de ce moment, ces cellules somitiques, futures cellules musculaires, ont atteint la limite de leur aire d'expansion distale. Au cours du stade suivant ces cellules se rassemblent en blast6mes denses autour de condensations cartilagineuses, pr6figuration des massifs musculaires primaires qui se diviseront ult6rieurement pour donner la musculature intrins+que de l'aile. C'est alors que leur myogen6se d6bute, comme le montrent les travaux de Hilfer, Searls et Fonte (1973).

Dans les premiers stades de leur migration, ces cellules sont encore largement indiff6renci~es bien que, chez la souris, Houben (1976) ait montr6 des indices ultrastructuraux pr6sumant de leur future diff~renciation myogbne et que Ray- naud et Adrian (1975 aet b) aient d6clar6 pouvoir, chez les Reptiles, les distinguer par la pr6sence, dans leur cytoplasme, de mitochondries denses et de nombreuses gouttelettes lipidiques, caract6res que ne possSdent pas les cellules somatopleura- les.

Ces cellules indiff6renci6es ne quittent pas pour autant le m~soderme somiti- que fi un moment quelconque. Car c'est au moment of~ les somites acqui+rent leur segmentation, subissent de grandes modifications biochimiques (Lanot, 1971), se diff6rencient en dermo-myotome et en scl6rotome, que se situe prbcis6- ment le d6but de la migration des cellules somitiques en direction du m+soderme somatopleural, chez les Oiseaux. Si l 'on observe que cette migration survient au stade terminal de la diff~renciation des myotomes chez les Amphibiens,

Migration des cellules somitiques dans le m~soderme de l'aile 71

apr~s la diff6renciation du dermo-myotome chez les Poissons et les Reptiles, au moment de l'individualisation du myotome chez les Mammif~res, on peut en conclure que le d6part des premieres cellules parait command6 dans l'ensemble des Vert~br6s d'une fagon g~n~rale par l'~tat de diffSrenciation du somite.

Par contre, ce ph6nom6ne semble 8tre ind6pendant de l'~tat de diff6renciation du mbsoderme somatopleural puisque si, chez les Oiseaux, la migration des cellules somitiques pr~cSde de peu l'apparition du bourgeon de membre, chez les Mammif6res, cette migration ne survient que tardivement aprSs l'apparition du bourgeon de membre. Le mScanisme responsable de cette migration, qui in vivo se produit uniquement au niveau des membres, est encore inconnu. Le mbsoderme somatopleural a-t-il un rSle attractif, le somite est-il d~termin+ /t fournir la musculature de l'aile ou de la patte? Si l'on se r6f~re aux travaux de Pinot (1974), le m6soderme somatopleural de niveau << aile >> ou << patte >> n'aurait pas de rSle attractif puisque des cellules somitiques peuvent migrer aussi bien dans le m6soderme somatopleural du niveau flanc que du niveau <<aile>> ou <<patte>>. Par contre, les cetlules somitiques du niveau cou en seraient incapables, ce qui plaiderait en faveur de leur dbtermination; cependant, ces r6sultats sont en desaccord avec ceux qui ont 6t6 obtenus dans mes exp6riences de greffes h6t6roto- piques dans lesquelles j'ai constat~ la presence de cellules somitiques dans le bourgeon de membre apr~s avoir greff6 / tce niveau du m6soderme somitique provenant soit de la r6gion cervicale, soit de la r6gion thoraco-lombaire, soit enfin de la region lombaire. La divergence entre les r6sultats peut s'expliquer si l'on tient compte de t'fige de l 'embryon au moment de l'op6ration. En effet les somites du niveau cervical doivent 8tre pr~lev~s sur des embryons suffisam- ment jeunes pour que les cellules aptes fi migrer n'aient pas d~j/t quitt6 le somite au moment du pr616vement.

Le m6soderme somitique n'est donc pas encore r6gionalis6 au cours du 2~me jour d'incubation puisqu'il peut, lorsqu'il est pr~lev~ tout le long de l'axe c6phalo-caudal de l 'embryon et implant~ au niveau du territoire pr6somptif du membre, fournir des cellules dont la destin~e sera de donner la musculature de l'aile, bien que in vivo seul le m~soderme somitique de ce niveau le fasse effectivement, les autres niveaux ~tant responsables de la musculature du tronc, comme le montrent des exp6riences d~j/~ anciennes (Straus et Rawles, 1953) et d'autres plus r6centes qui seront publiSes ult6rieurement. Le mbsoderme somi- tique joue donc au moins deux r61es dans le d~veloppement du membre, /t savoir un r61e stimulateur dans le d~clenchement de la morphogenSse (Kieny, 1960), et un r61e plus tardif dans l'~dification de la musculature intrinsSque du membre par la participation effective de ses propres cellules.

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