GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation

1- Présentation de la galerieGalerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.

Cupule

La galerie API 20 E

Microtube contenant le milieu déshydraté

1- GALERIE API 20E :

son ensemencement

1- Présentation de la galerieGalerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.

Cupule

La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés.

La galerie API 20 E

Microtube contenant le milieu déshydraté

2- Préparation de l’inoculum

Prélèvement d’une souche pure

sur GNI

1 seule colonie sur GO

5 mL d’eau distillée stérile

isolement

Souche pure sur GNI

5 mL d’eau distillée stérile

Préparation de l’inoculum pour ensemencer la galerie API 20 E

3- Ensemencement de la galerie API 20 EIntroduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ouverte, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles

Pour certains caractères:

Remplir le tube de suspension puis Recouvrir d’huile de paraffinePour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE

Ensemencement de la galerie API 20E

Remplir de suspension le tube et la cupulePour les tests :

CIT VP GEL

2- GALERIE API 20E :

sa lecture

2-1- Les réactifs à ajouter pour la lecture

4- Lecture de la galerie API 20 E

Après 24h d’incubation à 37°C, cupules ans lesquelles on doit rajouter des réactifs

Napht-1-ol Naphtyl-1-amine

Chlorure de fer III

2-2- Aspect des résultats positifs et négatifs

4- Lecture de la galerie API 20 E

Les 10 premiers tests

+ Réactif TDA

+ Réactif Kovacs

+ Réactifs VP 1 et 2

+ Réactif TDA

+ Réactif Kovacs

+ Réactifs VP 1 et 2

Tests négatifs

Tests positifs après ajout des réactifs utiles

Tests négatifs

Tests positifs

Après ajout des réactifs Nit 1 et Nit 2 : lecture de la NR (ici NR +)

Les 10 derniers tests

2-3- Explication des résultats positifs

ONPG

Mise en évidence de la béta-galactosidase

Substrat : ONPG

Réaction : ONPG + eau

Galactose + orthonitrophénol jaune

ADH, LDC, ODCMise en évidence de :- l'arginine désaminase- lysine décarboxylase- ornithine décarboxylase

Substrats : - arginine (dans ADH),- lysine (dans LDC) - ornithine (dans ODC)

Réactions : dégradations libérant des produits basiques

Révélateur : rouge de phénol

Rouge/Rose = +Jaune/Orangé = -

Rouge/Orangé = +Jaune = -

Citrate

Mise en évidence de la dégradation du citrate comme seule source de carbone.

Réaction : dégradation consommant des H+, donc responsable d’une alcalinisation.

Substrat : citrate

Révélateur : BBT

Mise en évidence de production de sulfure

Substrat : thiosulfate de sodium

Révélateur : Fe3+

Résultat positif : présence d’un précipité noir de sulfure de fer

H2S

Mise en évidence de la présence d'une uréase

Substrat : urée

Réaction : urée + eau CO2 + 2 NH3, d’où alcalinisation.

Révélateur : Rouge de phénol

Lecture : attention un orange clair sera -, un orange foncé sera considéré comme +

Urée

Mise en évidence d'une tryptophane désaminase

Substrat : Tryptophane

Produit obtenu : Acide indol pyruvique

Révélateur : -

Réactif ajouté : Chlorure de fer III donnant un produit marron foncé en présence d’acide indol pyruvique

TDA

Indole

Mise en évidence d'une tryptophanase

Substrat : Tryptophane

Produit : Indole

Révélateur : -

Réactif ajouté : Kovacs (ou James)

Voges Proskauer

Mise en évidence de la production d'acétoïne, de 2,3 butane diol et de butane dione

Substrat : Pyruvate

Révélateur : -

Réactifs ajoutés : VP1 et VP2

(1- naphtol et KOH)

TABLEAU DE LECTURE DE LA GALERIE MINIATURISÉE API 20E

Microtube Substrat : Caractère recherché  RévélateurLecture directe ou

indirecteTest (si nécessaire)

Résultat-

Résultat +

ONPGONPG = Ortho-Nitro-Phényl-Galactoside

ADHLDCODC

ArginineLysineOrnithine

Rouge de phénol

CIT Citrate

H2SThiosulfate de sodium

Fe III

URÉ Urée

TDA Tryptophane

IND Tryptophane

VPPyruvate de sodium

GEL GélatineParticules de charbon

GLU à ARA

= zymogramme

Substrat carboné (glucide)

NO2- / N2 Nitrates (NO3

-)

Béta galactosidase

Lecture directe

Arginine DihydrolaseLysine DécarboxylaseOrnithine Décarboxylase

BBT

Lecture directe

Lecture directe

Lecture directe

Lecture directe

Lecture directe

Utilisation du citrate

Production d’H2S

Uréase Rouge de Phénol

Tryptophane désaminase

Tryptophanase ou production d’indole

production d’acétoïne (3-hydroxybutanone

gélatinase

Utilisation de substrats carbonés (glucides)

Nitrate réductase

BBT

Lecture directe

Lecture indirecteAjouter une goutte de réactif chlorure de fer III

Lecture indirecteAjouter une goutte de réactifKovacs

Lecture indirecteAjouter 1 goutte de VP1 et VP2 Attendre 10 minutes

Lecture indirecteAjouter 1 goutte de NIT1 et NIT2 et zinc éventuellement

BBT

3- GALERIE API 20E :

son interprétation (identification de la souche)

Validation et possibilité d’interprétation si :

– Cupule Glu +

– Ou 3 autres cupules au moins positives

Démarche d’identification :- apporter la preuve que la bactérie appartient bien à la famille des Enterobacteriaceae (montrer qu’elle a les 7 caractères définissant la famille)- identifier le genre, voire l’espèce :

* approche dichotomique, ou utilisation de tableaux des caractères

* codage API* approche probabiliste utilisant

un logiciel informatique

5 2 1 5 7 7 3 5

+ +-

Code n°: 5 215 773 (55)

++

5

5- Identification de la souche

Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code

Lecture des résultats de la galerie :

Résultats reportés sur la fiche d’identification

5- Identification de la souche (suite)

Méthode d’identification probabiliste (p340 DTK)

• Le nom du micro-organisme est obtenu par un calcul de probabilité

• A chaque caractère d’un micro-organisme donné fait référence une probabilité d’être + ou –

• La probabilité que ce soit un taxon donné correspond aux produits des probabilité attribué à chaque caractère (si + = % de positivité ou si - =100%-% de positivité)

= Le logiciel classe tous les résultats pour donner le ou les taxons les plus probables.

typicité

Indice de typicité : comparaison entre le profil trouvé et le profil réel de la souche