grand pa, grand ma, etc ...

mom dad

génome

Qu'est ce que la vie ?

Mêmes atomes, mêmes principes physico-chimiques

histoire

et

fonctions

Qu'est ce qu'un génome ?Génome: (1920 Hans Winkler, Hamburg) ensemble des déterminants héréditaires (gènes) propres à une espèce donnée.

1944: l'ADN est le support de l'hérédité

1953: les propriétés de la molécule d'ADN expliquent la dualité de son rôle:

- instructions fonctionnelles pour l'organisme: séquence des nucléotides

- reproduction (formation du semblable): appariement des nucléotides

Génome: ensemble de l'information héréditaire d'un organisme. Cette information est présente en totalité dans chacune des cellules de l'organisme. Lorsqu'une cellule se divise l'information est copiée et transmise aux deux cellules filles.

Génome: contient les instructions nécessaires au développement, au fonctionnement, au maintien de l'intégrité et à la reproduction des cellules et de l'organisme.

La dualité fonctionnelle de l'ADN est intrinsèque à sa structure

L'information génétique (le message) est fournie par la

succession des nucléotides le long des brins d'ADN

Double hélice

Fourche de réplication

Deux double hélices filles

adeninecytosine guaninethymine

NH2

O

sucre

N

N

C 1

23

4

5 6

sucre

NH2

N

N

N

NA 1

23

4

5 6

78

9

O

sucre

N

NH2

G

N

N

NH1

23

4

5 6

78

9

O

O

sucre

CH3

NH

N

T 1

23

4

5 6

C

C C

C

O

OH H

HH

CH2

P

O -

O

O

O

Base

HH 1’

2’3’

4’

5’

désoxyribonucléotides

La reproduction des organismes est assurée par l'appariement des nucléotides.

Les deux molécules filles sont identiques à la molécule mère et donc identiques entre elles

Complémentarité des nucléotides

Séquence des nucléotides

GénomiqueCombinaisons possibles = 4n

n = 50 > nbre particules de

l'univers

Le "dogme central" de la biologie moléculaire

19531953

ARN

Protéine

Réplication

Transcription

Traduction

ADNlanguage à 4 lettres: nucléotides

language à 20 lettres: acides aminés

LE CODE GENETIQUE (1966)

TTT phe F TCT ser S TAT tyr Y TGT cys CTTC phe F TCC ser S TAC tyr Y TGC cys CTTA leu L TCA ser S TAA ochre TGA opaleTTG leu L TCG ser S TAG amber TGG trp W

CTT leu L CCT pro P CAT his H CGT arg RCTCleu L CCC pro P CAC his H CGC arg RCTAleu L CCA pro P CAA gln Q CGA arg RCTGleu L CCG pro P CAG gln Q CGG arg R

ATTile I ACTthr T AAT asn N AGT ser S ATCile I ACCthr T AAC asn N AGC ser SATAile I ACAthr T AAA lys K AGA arg RATG met M ACGthr T AAG lys K AGG arg R

GTT val V GCT ala A GAT asp D GGTgly G GTCval V GCC ala A GAC asp D GGC gly GGTAval V GCA ala A GAA glu E GGA gly GGTGval V GCGala A GAG glu E GGG gly G

Gène

Fonction

"intermédiaire"

Fonction 1

Fonction 2

x xmutation

ADN

Déterminisme génétique (version élémentaire)

Taille des génomes et séquençage: bases de la génomique

Homo sapiens 2 900 000 000 23 000

Drosophila melanogaster 160 000 000 14 000

Caenorhabditis elegans 98 000 000 19 400

Saccharomyces cerevisiae 12 500 000 5 800

Escherichia coli 4 600 000 4 300

Taille du génome(nucléotides)

Nbre de gènes(protein-coding)

Vitis vinifera 487 000 000 30 400

Arabidopsis thaliana 115 000 000 28 000

Amoeba dubia ~ 670 000 000 000 ?

Psilotum nudum ~ 250 000 000 000 ?

Fritillaria assyriaca ~ 100 000 000 000 ?

Necturus lewisi ~100 000 000 000 ?

1 10 102 103 104 105 106 107 108 109

kilobases = kb mégabases = Mb gigabases = Gb

Echelle de taille des molécules d’ADN et des génomes

paires de bases

distance =1 paire de

bases

1010 1011

virusbactéries

champignonslevures plantes

animauxmammifères

homme

Les génomes sont (trop) grands

archaea

en général, les génomes sont trop grands pour le nombre de protéines qu'ils codent

les génomes d’espèces proches peuvent différer considérablement en taille

la complexité des génomes n'est pas en relation directe avec la complexité des organismes et le nombre de gènes

Le paradoxe de la valeur CC = complexité du génome = nombre total de nucléotides du génome haploïde (taille du génome)

1012

amibes

ADN purifié Fragmentation

1

Copies incomplètes partant d'un

point fixe

Sens de la copie -->

Fragment d'ADN à séquencer (matrice)2

Se

ns

de

la m

igra

tion

é

lect

rop

ho

rétiq

ue

3

Détection du signal de fluorescence à la sortie

du séquenceur

Séquence reconstituée

4

séquençage

Le séquençage des génomes

1 10 102 103 104 105 106 107 108 109

paires de bases1010 1011

virusbactéries

champignonslevures plantes

animaux

archaea

1012

amibes

5 assemblage

contig

contig 1 contig 2 contig 3 0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6 8 10 12Nombre de séquences (c = NL/G)

Nom

bre

de

cont

igs

(G

/L)

3X: exploratoire

6X: ébauche

12X: qualité "finale"

Type de séquence Caractéristiques Utilisation

Exploratoire Très nombreux contigs, petite taille Variations polymorphiques, biodiversitéEbauche (draft) Nombreux contigs, taille variable Premières analyses globalesFinale Peu de contigs, grands Analyse génomique fonctionnelle

Le séquençage des génomes (suite)

6 Finition (supercontigs)

Ossature de supercontigs (scaffolds)

8 Annotation: ensemble de procédures informatiques qui:1- prédisent (± efficacement) les limites des gènes, des éléments de contrôle et de tout autre élément du génome2- suggèrent les fonctions des gènes à partir des comparaisons avec ce qui est déjà connu

7 Finition (remplissage des trous et zones de basse qualitévérification des assemblages, examen des séquences répétées, … )

Séquence finie, complète et de haute qualité

Le séquençage des génomes (fin)

Les premiers génomes séquencés1995 Haemophilus influenzae 1.8 Mb

Mycoplasma genitalium 0.6 Mb

2004 Homo sapiens 2ème ébauche (99,9 % de l' euchromatine) 2008 Deux individus

Projet "1000 genomes" Consortium international 1000 individus à travers le monde

1998 Caenorhabditis elegans 98 Mb (Premier organisme multicellulaire)

2000 Arabidopsis thaliana 115 Mb (Première plante)

Drosophila melanogaster 160 Mb (ébauche)

Homo sapiens 2 900 MB Annonce internationale

1ère ébauche 90 % (150 000 trous)

1996 Mycoplasma pneumoniae 0.8 MbSynechocystis sp. 3.6 Mb

Methanococcus jannaschii 1.7 Mb (Première Archae)

Saccharomyces cerevisiae 12.3 Mb (Premier Eucaryote)

Bactéries

812 génomes complets et publiés

1766 génomes bactériens (en cours)

936 génomes eucaryotes (en cours)

90 génomes d'archaea (en cours)

130 métagénomes

http://www.genomesonline.org/

L'accélération des "projets génomes"

Banques de données publiques

Février 2008: 108 635 736 141 nucléotides 27 439 206 fichiers "génomes entiers"

bactéries

eucaryotes

archaea

Pourquoi séquencer les génomes ?

Biotechnologies fermentations et bioconversions (acetate, acetone, butanol, éthanol, hydrogène ….)

additifs alimentaires (alginate, succinate, glutamate … )production d'enzymes (cellulase, biocatalyse ….) et protéines

Environnement: cycles naturels (carbone, azote , conversion de la biomasse …)traitements (pesticides, fongicides, algicides, …)énergie, pétrole, détergentstraitements des eaux, détoxification des sols

Alimentation: produits laitiers, fromages, suppléments diététiques, fermentations alimentaires …

Agronomie: animaux, plantes, et leurs pathogènes, résistance …

Santé humaine: pathogènes, cancer, vaccins, infections nosocomiales, insectes vecteurs …

Connaissance: éducation, évolution, origine de la vie, arbre de la vie, compréhension des mécanismes fondamentaux de la vie, biodiversité …

Biologie et écologie marine: pêche, aquaculture, algues, plancton ….

Pharmacie: vitamines, antibiotiques, acides aminés, acide lactique ….

Saccharomyces cerevisiae (1996)Schizosaccharomyces pombe (2002)

Ascomycota

La génomique comparative (Eucaryotes)

Plasmodium falciparum (2002)Plasmodium yoeli yoeli (2002)Cryptosporidium hominis (2004) Cryptosporidium parvum (2004) Theileria annulata (2005) Theileria parva (2005) Toxoplasma gondi

Apicomplexa

Paramecium tetraurelia (2006)Tetrahymena thermophila (2006)

Ciliophora

Leishmania major (2005)Trypanosoma brucei (2005)Trypanosoma cruzi (2005)

Euglenozoa

Entamoeba histolytica (2005)Dictyostelium discoideum (2005)

Conosa

Cyanidioschyzon merolae (2004) Galdieria sulphuraria (2005)

Rhodophyta

Ostreococcus tauri (2006)

Chlorophyta

Thalassiosira pseudonana (2004)

Stramenopiles

Strongylocentrus purpuratus

Echinodermata

Arabidospis thaliana Oryza sativaPopulus nigraVitis vinifera

ViridiplantaeMammalia

Homo sapiensPan troglodytesMus musculusRattus norvegicusGallus gallusTetraodon negroviridsFugu rubripes

Drosophila melanogaster (2000)

Arthropoda

Caenorhabditis elegans (1998)Caenorhabditis briggsae (2003)Oscheius tipulae (2006)Meloidogyne incognita

Nematoda

Ernst Haeckel, 1866

Baldauf (2003) Science 300: 1703-1706

Qu'apprenons nous dans les génomes ?

Catalogue complet des gènes et autres éléments

Présence de nombreux gènes et autres éléments de fonctions inconnues

Processus dynamiques de modification (altération et évolution) du génome

ADN

ARN

Protéine

Transcription

Traduction

Réplication

1970-19801970-1980

Transcription réverse

EpissageEdition

19531953

ARN

Protéine

Réplication

Transcription

Traduction

ADN

Le "dogme central" de la biologie moléculaire (1ère révision)

Gène

Fonction

Informationgénétique

Catalyse

= 5-méthyl uracile

ARN

C

C C

C

O

OH H

HH

CH2

P

O -

O

O

O

base

HH 1’

2’3’

4’

5’

C

C C

C

O

OH OH

HH

CH2

P

O -

O

O

O

base

HH 1’

2’3’

4’

5’

ribonucléotides

désoxyribonucléotides

GèneADN

adeninecytosine guaninethymine

NH2

O

sucre

N

N

C 1

23

4

5 6

sucre

NH2

N

N

N

NA 1

23

4

5 6

78

9

O

sucre

N

NH2

G

N

N

NH1

23

4

5 6

78

9

O

O

sucre

CH3

NH

N

T 1

23

4

5 6

sucre

NH2

N

N

N

NA 1

23

4

5 6

78

9

O

sucre

N

NH2

G

N

N

NH1

23

4

5 6

78

9

NH2

O

sucre

N

N

C 1

23

4

5 6

O

O

sucre

NH

N

U 1

23

4

5 6

adeninecytosine guanineuracile

AD

NA

RN

GèneADN

ARN précurseurtranscrit du gène

Intron 2 Intron 3Intron 1

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4

Epissage des ARN

protéine

dégradation

+ Introns excisés

Phase codante

Jonctions des exons

régulation5' UTR 3' UTR

ARN épissé

Exon shuffling

~ 19 % des exons des génomes eucaryotes proviennent de ce processus

exon

Exon 1 Exon 2Intron

nouvel exon

Nouvel épissage ou perte de l'intron

Evènements évolutifs dépendant des ARN

~ 4 % des nouveaux exons du génome humain proviennent de ce processus

Insertion d'un élément mobile

élement

mobile

Exon 1 Exon 2Intron

Formation de nouveaux sites d'épissage ou perte des introns

Nouvel exon

Formation de rétrogènes

1 % des gènes humains, plus de nombreux pseudogènes, sont issus de ce processus

ADNc

rétrogene

fusion de gène

ou

ARN

gène ancestral

Exonisation d'éléments mobilesGène humain RPE2-1

1 2 3 4 5 63' UTR5' UTR Alu J

exon 3

Partie de séquence Alu J devenant un exon codant

intron

Ribulose-5-phosphate-3-épimerase

SaguinusLemur Eulemur Tarsius Saimiri Macaca Colobus Hylobates Pongo Pan Homo

Réversion

Alu J insertion / fixation

Alu J exonisation

Strepsirrhini

Tarsioidea

Platyrrhini

CercopithecoideaHominoidea

ca. 10 MYr

Mutations au site 3' d'épissage

Les gènes se dupliquent et se perdent

Gène ancestral

Le génome n'est qu'un cliché instantané de processus continuels de duplications et de perte de gènes au cours des générations successives

Susumu Ohno, 1970

Copies de gènes paralogues

nouvelles fonctionsspécialisation fonctionnelleredondance

mutations

Ex.: Le génome de la paramécie (49 000 gènes) révèle les traces de trois évènements successifs de duplication (ancêtre ~ 6 000 gènes)

Duplication totale du génome

Perte de gènesEx.: génotypage de trios parents-enfant normaux révèle 30-50 délétions nouvelles (> 5kb) à chaque génération (total 550 -750 kb)

Duplication de segments du génome

Ex.: le génome humain montre plusieurs centaines de segments dupliqués (> 5kb) totalisant ~ 150 Mb (5 % du génome). Source d'instabilités génomiques.

Les éléments des génomes

levure homme

Gènes (codant des protéines) 5 770 ~ 23 000

Introns 280 > 100 000

Pseudogènes 10 > 25 000

Éléments mobiles ~ 50 > 1 100 000

Nombre de familles de protéines ~ 4 100 ~10 000

Redondance (gènes paralogues) 1,4 x 2,3 x

Exons codants

Introns, UTR, pseudogènes

Eléments mobiles

Autres régions

régulationsévolution

fonctions

Buts et outils de la génomique fonctionnelle

Buts: connaître les fonctions de tous les gènes

comprendre leurs interactions

prédire les phénotypes à partir du génotype

Puces à ADN et quantification des ARN

Principes pour l'interprétation des résultats

2- les gènes qui participent à une même fonction doivent avoir des expressions corrélées

Gènes dont l'expression est corrélée

1- l'expression des gènes dans différentes conditions est révélatrice de leur fonction

Condition 1

Con

ditio

n 2

Zone des variations non significatives

Gène

Fonction

ARN

Nombreux gènes

Complexe fonctionnel

Nombreux ARN

RNA

proteins

La grande sous-unité du ribosome

ARN

Protéines

Les interactions fonctionnelles

Identifier les interactions des protéines

1- purification biochimique des complexes

Marquage de chaque gène par une étiquette moléculaire facilitant la purification de la protéine dans des conditions non dénaturantes

Analyse des complexes purifiés par spectrographie de masse

2- identification des interactions binaires par artifice génétique (double hybride)

XY

OFF

YX

ON

A B

I

J

K

Mutant 1 de J

Mutant 2 de J

Saccharomyces cerevisiae

5 770 gènes (protéines)

Collections de délétions avec marquage moléculaire (barcoding). Recherche de phénotypes et d'interactions.

Collections de fusions de gènes pour produire les protéines fluorescentes. Localisation intracellulaire.

Collections de gènes surexprimés (augmentation de la quantité de protéine). Recherche de phénotypes et d'interactions.

1- Collections complètes de mutants

Identifier les interactions fonctionnelles des gènes

2- Phénotypes synthétiques

Mutant A Mutant B Mutant A+B

Mutants --->

Mutants --->

fonctions inconnues

fonctions identifiées

Nom

bre

de g

ènes

temps

Integration des résultats des différentes approches : vers la connaissance complète du

fonctionnement d'une cellule

ARN

Génomique comparative

Interactions des produits des gènes

Localisation intracellulaire

Génétique Prédire le phénotypeReplacer les mécanismes dans l'évolution

Et maintenant ?

ADN

ARN

Protéine

Transcription

Traduction

Réplication

1970-19801970-1980

Transcription réverse

EpissageEdition

19531953

ARN

Protéine

Réplication

Transcription

Traduction

ADN

Le "dogme central" de la biologie moléculaire (actuel)

20082008

ADN

ARN

ProtéineS

Transcriptionmultiple

Traduction

Réplication

Transcription reverse

EpissageEditionRégulation

EvolutionFormation de gènesEpigénèse

Gène

Fonction

ARNLe génome fonctionnel

Le génome séquencé

Séquencer le transcriptome

Les fonctions étudiées

Qu'est qu'un gène ?

Gerstein et al., 2007 Genome Res. 17: 669-681

ENCODE Project Consortium 2004 Science 306: 636-640

ADN

Transcrits primaires

Transcrits épissés

Produits fonctionnels

Gènes

Protéines

ARN nc

Les nouvelles techniques de séquençage

Méthode longueur des nombre de total par coût relatiflectures lectures tour (run) par nucléotide

Sanger ~700 nuc. 96 70 Kb 1

Pyroséquençage ~250 nuc. 400 000 100 Mb 0,1

Phase solide 25-35 nuc. 40 000 000 1 000 Mb 0,0180 000 000 2 000 Mb 0,01

Combinaison des technologies:vers le séquençage des individus et des populations entières

Quelques grands projets en cours ou annoncés

1000 genomes Consortium internationalBut: cartographier le polymorphisme génétique de la population humaine (1000 individus)

Origine de la multicellularité NHGRIBut: identifier les gènes et complexes impliqués dans l'apparition de la vie multicellulaire (animaux, champignons, protistes)

Microbiome humain Plusieurs centres de séquençage américainBut: identification exhaustive de la flore microbienne commensale de l'homme

Encyclopédie génomique des bactéries et archaea JGIBut: étudier toutes les branches phylogénétiques de l'arbre de la vie (procaryote)

Bar coding of life 130 organisations, 43 paysBut: attribuer une signature moléculaire standard à chaque espèce identifiée

ENCyclopedia Of DNA Elements (ENCODE) Universités américaines, NHGRIBut: identifier tous les éléments fonctionnels du génome humain

génome

Qu'est ce que la vie ?

principes physico-chimiques + hérédité