Inventaire moléculaire d'un écosystème microbien de digestion anaérobie

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    30-Sep-2016

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    Inventaire molculaire dun cosystmemicrobien de digestion anarobie

    Jean-Jacques Godon Emmanuelle Zumstein. Patrick Dabert.Frdric Habouzit Ren Moletta

    Laboratoire de biotechnologie de lenvironnement, Institut nationalde la recherche agronomique, Avenue des tangs, 11100 Narbonne, France

    Abstract - Molecular inventory of an anaerobic digestion microbial ecosystem.The bacterial community structure of a fluidised bed reactor fed by vinasses wasanalysed by molecular identification. After polymerase chain reaction (PCR) amplifi-cation, three 16S ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA) clone libraries of Bacteria,Archaea and Procarya populations were established. Community structure was deter-mined by phylogenetic analysis of 556 partial rDNA sequences (about 500 bp long).One hundred thirty-nine operational taxonomic units (OTUs) were found, amongwhich were 133 and 6 from the Bacteria and Archaea domains respectively. BacterialOTUs are not closely related to all other hitherto-determined sequences (more than4 % of divergence). The Archaea represent 25 % of the prokaryotic sequences andthe most frequent bacterial OTU represents less than 5 % of the bacterial sequences. Inra/Elsevier, Parisanaerobic digestion / biodiversity / microbial ecology / phylogeny / 16S rRNA

    Rsum - Linventaire molculaire de la microflore dun racteur en lit fluidisaliment par des vinasses a t ralis partir de trois banques de clones dADNr16S (bactries, archaea et procaryotes) amplifis par PCR. Lanalyse phylogntiquede 556 squences partielles (environ 500 pb) dcrit la communaut microbienne.Cent trente neuf OTU (Operational Taxonomic Unit) ont t identifis dont 133appartiennent au domaine des bactries et six celui des archaea. La plupartdes squences sont phylogntiquement loignes (plus de 4 % de divergence) dessquences dj connues. Les archaea reprsentent 25 % des squences procaryoteset lOTU bactrien le plus frquent moins de 5 % des squences bactriennes. Inra/Elsevier, Parisdigestion anarobie/ biodiversit/ cologie microbienne/ phylognie/ ARNr 16S

    * Correspondance et tirs partTl : 33 (0)4 68 42 51 54; fax : 33 (0)4 68 42 51 60; E-mail : godon@ensam.inra.fr

  • 1. INTRODUCTION

    La digestion anarobie est un procd biologique simple et efficace pourtraiter la pollution carbone. Cependant notre connaissance de la communautmicrobienne implique dans la chane complexe trophique de la digestionanarobie reste limite. En effet, on ne sait isoler et cultiver quune fractionde ces microorganismes, lautre fraction demeurant inconnue. Les techniquesmolculaires, notamment celles qui utilisent la molcule de la petite sous-unitdes ARN ribosomiques (ARNr 16S), permettent de saffranchir des techniquesculturales pour dcrire et suivre un cosystme (Amann et al., 1995). Eneffet, la squence de lARNr 16S (environ 1500 nuclotides) est spcifiquede chaque organisme et de son volution depuis un anctre commun. Deplus, le grand nombre de squences actuellement disponibles (plus de 6000squences de procaryotes) permet de dessiner un vaste arbre phylogntiquedes microorganismes et dy placer chaque nouvelle squence. A partir desalignements de squences il est ensuite possible de choisir des sondes nucliquesqui permettront de cibler une espce, un genre ou un phylum. Il devient alorspossible thoriquement de suivre cette espce, ce genre ou ce phylum dans uncosystme complexe sans jamais lavoir isol en culture pure.

    Des sondes nucliques ont dj t utilises sur un digesteur anarobie (Ras-kin et al., 1994). Cependant ces sondes ont t cres partir des squencesdARNr 16S de microorganismes ou de groupes de microorganismes prcdem-ment isols en culture pure. Dans ce cas, la puissance de ces outils demeureencore limite par les contingences de lisolement. Linventaire molculaire ap-parat donc comme un outil nouveau pour dcrire un cosystme microbiendonn et suivre son volution.

    Le travail prsent dans cet article est linventaire molculaire, aussi ex-haustif que possible, des microorganismes composant le biofilm dun digesteuranarobie lit fluidis.

    2. MATRIEL ET MTHODES2.1. Racteur anarobie tudi

    Le racteur tudi est un lit fluidis, aliment par des vinasses provenantdune distillerie locale. Ce polluant industriel est le rsidu de la distillation devin et de marc. Il prsente lavantage dtre quasiment strile, vitant ainsique des microorganismes en transit ne perturbent limage de lcosystme.Le racteur est tubulaire avec un volume de 0,6 L. Le support colonis parle biofilm est de la pouzzolane (poudre de roche volcanique) et la fluidisationproduit une extension du volume de 25 %. Le carbone organique total (COT)de la vinasse est en moyenne de 10 g L-1 et la demande chimique en oxygne(DCO) de 25 g L-1. La charge organique applique est de 5,5 g de DCO/L/j.Le pH et la temprature sont maintenus respectivement autour de 7 et de 35 C.Les quantits de COT et dacides gras volatils se maintiennent rgulirementrespectivement autour de 800 mg L-1 et 250 mg L-1. Le racteur a t inocul 100 % du volume partir de boues issues dun racteur similaire ( lit fluidis)

  • aliment avec le mme substrat et qui fonctionnait depuis plus dun an encontinu (Buffire et al., 1995). Lchantillon analys a t collect 40 jours aprslinoculation.

    2.2. Mthodes pour un inventaire molculaire

    Les tapes sont successivement : (i) lextraction de lADN total des micro-organismes composant lcosystme ; (ii) lamplification par PCR de la rgion delADNr 16S grce des amorces spcifiques choisies dans les rgions conservesde la molcule; (iii) lisolement par clonage des molcules ainsi amplifies;(iv) le squenage du fragment dADN clon. Toutes ces techniques ont tprcdemment dcrites (Godon et al., 1997; Sambrook et al., 1989).

    Trois banques dADNr 16S ont t ralises : ADNr 16S archaea total (E. coliposition 6 1509 (Brosius et al., 1981)), ADNr 16S bactrien total (E. coliposition 8 1509) et ADNr 16S procaryote partiel (E. coli position 778 1509). Une squence partielle denviron 500 pb qui reprsente un tiers de lamolcule ARNr 16S a t ralise pour chaque clone (E. coli position 812 1307). Chaque squence a t compare avec les autres squences produites etavec les squences dARNr 16S disponibles dans les bases de donnes Genbanket Ribosome Database Project (Maidak et al., 1994).

    3. RSULTATS ET DISCUSSION

    3.1. Diversit de la microflore et concept dOTU

    Pour analyser la diversit, la notion dOTU (Operational Taxonomic Unit),quivalent molculaire de lespce, a t utilise pour regrouper les squencesles plus proches (Moyer et al., 1994). Ce regroupement se heurte plusieursproblmes. Dune part, les 556 clones analyss prsentent un continuum de di-vergence de 0 30 % et, dautre part, des squences dARNr 16S diffrentespeuvent provenir soit de deux microorganismes diffrents, soit de deux co-pies diffrentes dARNr 16S issues du mme chromosome. Par exemple, chezHaloarcula marismortui deux copies de lARNr 16S prsentent 5 % de diver-gence (Mylvaganam et Dennis, 1992). Ainsi, il est dlicat de fixer un seuilde divergence entre OTU et selon le seuil fix, le nombre dOTU peut varierfortement (figure 1 ) .

    Arbitrairement, les 556 squences ont t regroupes sur les bases de 96 %de similarit au sein dun OTU formant ainsi 139 OTU. Ce nombre diffresensiblement de la figure 1 car certains OTU comprennent des squences quidivergent de plus de 4 % mais qui sont relies par un continuum de squencesdivergeant entre elles de moins de 4 %.

    Les clones bactriens reprsentent la plus grande diversit avec 133 OTUidentifis parmi 460 clones bactriens analyss alors que seulement six OTUarchaea ont t identifis parmi 96 clones analyss. Les squences des 139 OTUsont disponibles dans les bases de donnes EMBL, Genbank et DDBJ sous lesnumros daccession : U81640 U81778.

  • 3.2. Diversit phylogntique (approche qualitative)La distribution phylogntique des 139 OTU parmi les phylums majoritaires

    est prcise sur la figure 2. 79 % des OTU appartiennent trois phylumsmajeurs des bactries : les protobactries, les bactries Gram positive basGC % et le groupe Cgtophaga-Flexibacter-Bacteroides (CFB). Les autres OTUsont rpartis parmi des phylums mineurs et certains peuvent difficilement treaffilis un phylum connu.

    Aucun ADNr 16S bactrien squenc a moins de 3 % de divergence avecune squence prsente dans les bases de donns. Les squences dADNr 16Sdes archaea mthanognes sont en revanche, quasiment similaires (moins de3 %) avec celles de Methanosarcina barkeri (1,2 %), Ms. frisius (0,2 %) etMethanobacterium formicicum (3 %). linverse, les trois autres OTU archaeasont trs atypiques. La figure 3 prsente le positionnement phylogntique desOTU procaryotes.

    3.3. Rpartition des clones (approche quantitative)Lanalyse phylogntique prsente dans le chapitre prcdent dcrit la

    diversit de la population sur la base des OTU. Dans ce chapitre les rsultatssont prsents au niveau des clones et estiment leur rpartition au sein de lapopulation.

    Parmi les clones analyss, 460 et 96 appartiennent respectivement auxdomaines des bactries et des archaea, la rpartition des clones bactriens partir des banques bactries et procaryotes tant similaire. La figure 4 indiquela frquence des clones dans les groupes phylogntiques.

  • Parmi les OTU bactrien, le plus frquent comprend 22 clones ce qui corres-pond 5 % de la totalit des clones bactriens. Quatorze OTU comprennentneuf clones ou plus et ont une frquence suprieure 2 %. Dix sept OTU com-prennent de cinq huit clones et ont une frquence entre 1 et 2 %. Trente-neufOTU comprennent deux quatre clones et ont une frquence entre 0,2 et 0,9 %.Enfin, soixante OTU comprennent seulement un clone et ont une frquenceinfrieure 0,2 %.

    Le plus frquent des OTU archaea comprend 43 clones ce qui correspond 44 % des clones archaea et 11 % des clones procaryotes.

  • 3.4. Image de la populationCet cosystme apparemment stable et clos est compos de plus de

    139 microorganismes diffrents classs comme procaryotes. Cet inventaire nest

  • pas exhaustif, le nombre total despces demeure inconnu et encore hors deporte. Aprs lanalyse de 460 clones, la dcouverte de nouveaux OTU est demoins en moins frquente : ce point de lanalyse, on identifie un nouvel OTUpour dix nouveaux clones squencs (,figure 5). On peut estimer que les OTUayant une frquence suprieure 1 % donc majoritaires dans lcosystme ontt dcris.

    3.5. Biais due la mthode

    La pertinence des rsultats dpend du biais introduit par les techniquesemployes. Plusieurs paramtres peuvent modifier les rsultats : le contenuen GC de lARNr 16S, des sensibilits diffrentes des parois cellulaires lalyse, certaines spcificits de la Taq polymrase, la spcificit des amorces, la

  • formation de molcules chimres ou le nombre de copies des gnes codant pourlARNr 16S. Cependant la grande diversit observe modre limpact de cesfacteurs sur les rsultats. Le problme le plus gnant demeure la formation demolcules chimres pendant lamplification par PCR dune population dADN,une molcule chimre dADNr tant compose de fragments dADNr issusdorganismes diffrents. Cette molcule est en effet difficilement identifiable.Ce dlicat problme peut tre partiellement rsolu par la comparaison dunnombre important de squences provenant de PCR indpendantes. Vingt-sixchimres ont ainsi t dtectes et retires des clones bactriens (5,4 %).

    Ainsi la frquence des microorganismes dans lcosystme fournie par cetteapproche nest probablement pas lexacte image de la ralit mais ces rsultatspeuvent tre utiliss comme point de dpart pour une analyse plus pousse delcosystme.

    Ce travail donne une description microbiologique qualitative et quantita-tive de la biodiversit dun cosystme de digestion anarobie en utilisant lasquence des ADNr 16S. Un trs grand nombre dorganismes nouveaux sontprsents au sein de cet cosystme commun. Cette diversit apparente doit tremodre car seulement quelques organismes majoritaires semblent reprsenterlessentiel de la population. Ces rsultats sont compatibles avec la description delcosystme de digestion anarobie par des mthodes classiques. Lidentifica-tion molculaire par lADNr 16S retrouve des membres des genres ou des taxonsattendus pour lesquels la fonction dans la chane trophique est connue : exempleBacteroides, Eubacterium, Clostridium, Proteobacteria delta (bactrie sulfato-rductrice), syntrophomonas, archaea mthanognes, etc. Dautre part, cetteapproche indpendante de lisolement des microorganismes, rvle des membresappartenant des genres dont la fonction est inconnue comme les Spirochaetes,les green non-sulfur , les Planctomyces et les Archaea non mthanognes.

  • Ces rsultats soulvent le problme de la mesure de la diversit chez lesprocaryotes. Le grand nombre de squences analyses aborde par une approchemolculaire (divergence de la molcule dARN 16S) la question de lespce .Or, des liens cohrents restent encore tablir entre une vision molculaire etune vision fonctionnelle de lespce .

    REMERCIEMENTS

    Nous tenons remercier P. Bellenand pour sa contribution lanalyse desrsultats.

    RFRENCESAmann R.L, Ludwig W., Schleifer K.H., Phylogenetic identification and in situ

    detection of individual microbial cells without cultivation, Microbiol. Rev. 59 (1995)143-169.

    Brosius J., Dull T.J., Sleeter D.D., Noller H.F., Gene organisation and primarystructure of a ribosomal RNA operon from Escherichia coli, J. Mol. Biol. 148 (1981)107-127.

    Buffire P., Moletta R., Fonade C., Continuous operations of fluidized bed bioreac-tor for anaerobic digestion : residence time effect on degradation kinetics, Biotechnol.Lett. 17 (1995) 833-838.

    Godon J.-J., Zumstein E., Dabert P., Habouzit F., Moletta R., Microbial SSUrDNA diversity in an anaerobic digestor, Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 2802-2813.

    Jukes T.H., Cantor C.R., Evolution of protein molecules. In : Munro H.N. (Ed.),Mammalian protein metabolism, Academic Press, New York, 21-132, 1969.

    Maidak B.L., Larsen N., McCaughey M.J., Overbeek R., Olsen G.J., Fogel K.,Blandy J., Woese C.R., The Ribosomal Database Project, Nucleic Acids Res. 22(1994) 3485-3487.

    Moyer C.L., Dobbs F.C., Karl D.M., Estimation of diversity and communitystructure through restriction fragment length polymorphism distribution analysisof bacterial 16S rRNA genes from a microbial mat at an active hydrothermal ventsystem, Loihi Seamount, Hawaii, Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994) 871-879.

    Mylvaganam S., Dennis P., Sequence heterogeneity between the two genes encoding16S rRNA from the halophilic archaebacterium Haloarcula marismortui, Genetics 130(1992) 399-410.

    Raskin L., Poulsen L.R., Noguera D.R., Rittmann B.E., Stahl D.A., Quantificationof methanogenic groups in anaerobic biological reactors by oligonucleotide probehybridisation, Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994) 1241-1248.

    Saitou N., Nei M., The neighbor-joining method : a new method for constructingphylogenetic trees, Mol. Biol. Evol. 4 (1987) 406-425.

    Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning : A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

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