Isolement et identification des bactries anarobiesPlan du chapitre1 - Contextes cliniques 2 - Objectifs 3 - Mthodes de mise en vidence 4 - Sensibilit aux antibiotiques Les bactries anarobies sont responsables d'une grande varit d'infections localises ou gnralises. Dans plus de 80 % des cas il s'agit d'une infection mixte, associant bactries arobies ou aroanarobies et anarobies strictes. La plupart de ces bactries se dveloppent lentement. Leur isolement et leur identification demandent un certain dlai. Leur mise en vidence reste toujours dlicate. Un certain nombre d'indices permettent de suspecter prsence : * mauvaise odeur des chantillons, prsence de gaz dans la lsion, * localisation de la suppuration (abcs sous maxillaire ou cervical, pleursie purulente, pritonite, abcs de la sphre gyncologique). Les checs de culture sont frquents, les principales causes en sont : mauvais prlvements, mauvaises conditions de transport, mthodes de culture inadaptes, malgr l'utilisation d'enceintes anarobies ( jarre ou chambre).

1 - Contextes cliniquesDeux grands types d'infections : Les infections Clostridium scrteurs de toxines. Ils sont gnralement d'origine exogne. . Ils survivent dans la nature grce leur spore. On distingue : - les toxi-infections (Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium difficile). Le germe pntre dans l'organisme l'occasion d'une blessure (Clostridium tetani), il se dveloppe localement, scrte sa toxine qui provoque la maladie (ttanos).

C. perfringens responsable des gangrnes gazeuses (myoncroses, cellulites, fasciites), pntre l'occasion de blessures mais peut tre d'origine endogne secondaire des lsions de la paroi digestive. Clostridium difficile pntre dans l'organisme par voie digestive mais dans des conditions normales il ne peut se dvelopper dans le tube digestif. La destruction d'une flore de barrire par une antibiothrapie permettra sa multiplication et la scrtion des toxines. - les intoxinations (Clostridium botulinum). C'est l'ingestion de la toxine prforme qui est responsable de la maladie. *

Les infections mixtes : elles se dveloppent au voisinage des muqueuses. Les anarobies strictes

sont associes d'autres bactries, elles peuvent se compliquer de mtastases infectieuses distance.

2 - Objectifs* Isolement et identification des bactries anarobies strictes : - La recherche des anarobies ne se pratique ni pour les intoxications ni pour les toxi-infections d'origine exogne. Le diagnostic est essentiellement clinique. - L'origine des infections anarobies est essentiellement endogne, la composition de ces flores est importante considrer car de sa connaissance dpende la nature des espces isoles dans leur voisinage (tableau 1). * Les bactries anarobies sont surtout recherches dans les prlvements suivants : - hmocultures, - liquides de ponction (pleurale, pricardique, articulaire), - abcs du poumon : dans la mesure o le prlvement a t ralis grce une technique protgeant le prlvement de la contamination bucco-dentaire), - ostite, - abcs du cerveau, - pritonite, - abcs abdominaux ou gyncologiques. Les anarobies ne doivent pas tre recherchs dans un prlvement hbergeant habituellement une flore

commensale : crachats, selles, prlvements vaginaux. La recherche de C. difficile lors d'une diarrhe au dcours d'un traitement antibiotique est un cas particulier.

Tableau 1 : les anarobies de la flore endogne (d'aprs SM Finegold)Peau Propionobactrium acnes +++ Peptostreptococcus spp

Flore buccale Prevotella pigmentes Porphyromonas spp Prevotella groupe oralis Fusobacterium nucleatum Peptostreptococcus spp Eubacterium spp Actinomyces spp Flore vaginale Lactobacillus +++ Prevotella bivia, P. disiens PrevoteIla pigmentes Peptostreptococcus Flore colique Bacteroides groupe fragilis +++ Bilophila wadsworthia Leptostreptococcus spp Clostildium spp Bifidobacterium spp

Eubacterium spp +++ germe dominant

3 - Mthodes de rnise en vidence des anarobies1- Prlvement et transportL'une des principales causes d'chec d'isolement des bactries anarobies est la mauvaise qualit du prlvement et/ou du transport. La recherche de ces bactries peut se faire soit sur un prlvement aspir : seringue ou pipette (les pipettes en plastique ont des proprits oxydantes qui les rendent toxiques pour les bactries anarobies), soit sur un couvillon (couvillon d'alginate ou en dacron), il doit tre obligatoirement plac dans un milieu de transport. Le mieux est d'utiliser une seringue purge d'air. Les prlvements la seringue ou la pipette ont deux avantages par rapport aux prlvements sur couvillon : * ils permettent de prlever le pus au niveau du foyer infect, en vitant la contamination par les flores du voisinage, ce qui est plus dlicat avec un couvillon, * ils vitent la dessiccation ou la rtention de bactries dans l'couvillon, et l'exposition l'oxygne. * ils permettent de noter les caractres organoleptiques. En pratique cependant, l'couvillon demeure un moyen de prlvement utilis.

Aprs prlvement, il faut veiller : * empcher la dessiccation du produit pathologique, * protger les bactries de l'oxygne de l'air. Le milieu de transport idal doit prserver la multiplication ultrieure des anarobies, mais aussi des arobies. Il doit contenir des substances rductrices. La plupart des milieux de transport commercialis ont pour base le milieu de Stuart. Les meilleurs milieux sont gloss : Portagerm (bioMrieux), TGV anarobie (Sanofi-Pasteur), Port A Cul (Becton Dickinson).

2 - Mthodes d'orientation rapideL'isolement et l'identification demandent un dlai de quelques jours quelques semaines. Il importe de signaler rapidement la prsence des anarobies dans un prlvement. * L'aspect du pus est souvent trs vocateur : pus abondant d'odeur nausabonde.

* L'examen du frottis aprs coloration par la mthode de Gram. * La flore bactrienne est abondante et polymorphe associant des bacilles et des cocci Gram positif et ngatif. Trois aspects peuvent se rencontrer : - le pus est trs vocateur avec une flore polymorphe typique (60 % des suppurations), - la flore peu abondante mais associant plusieurs catgories de bactries (20 30 % des suppurations), - l'examen direct non vocateur, les cultures sont monomicrobiennes (10 15 % des cas). * On peut utiliser des mthodes immuno-enzymatiques pour Clostridium difjicile pour mettre en vidence les toxines dans les selles. * La localisation de la suppuration permet de prjuger des anarobies que l'on peut isoler (tableau 2).

3 - Mise en culture* Les milieux L'isolement ncessite des milieux gloss, contenant de nombreux facteurs de croissance et rendus slectifs grce l'addition d'antibiotiques. Il est important de toujours utiliser des milieux dsoxygns (rgnrs), frachement prpars et conservs en anarobiose avant leur utilisation. Diffrents milieux ont t proposs, ils peuvent tre limits : * Milieu glos pour les bacilles Gram ngatif (exemple Schaedler au sang avec vancomycine (7,5 mg/1) et nomycine (75 mg/1)). Ce milieu permet l'isolement des Bacteroides du groupe fragilis, des Prevotella, des Fusobacterium. * Glose Columbia au sang et au phnylthyl-alcool (4,2 g/100 ml) spcifique des bactries gram positif et des Phorphyromonas. * Pour les Clostridium : TSN, glose au jaune d'oeuf et nomycine, Columbia au sang avec cyclosrine et cefoxitine pour C. difficile. Certaines bactries peuvent avoir des difficults se dvelopper sur une glose au sortir de l'organisme. Il faut toujours associer un bouillon anarobie un milieux glos. Ce bouillon est repiqu aprs 48

72 heures sur des gloses slectives. * Les conditions d'anarobiose Il existe actuellement des sachets permettant de faire l'anarobiose en moins d'une demi heure sans catalyseur. Elle est ralise dans des jarres ou des sacs en plastique ferms hermtiquement. Les chambres anarobies sont trs utiles, mais pas indispensables pour l'isolement des anarobies, elles ncessitent une surveillance constante. L'alternative peut tre ralise par un systme permettant de faire le vide dans une jarre et d'injecter un mlange gazeux. Il est ncessaire de bien vrifier l'anarobiose ralise l'aide d'un indicateur d'oxydo-rduction 3 (bande de papier buvard imprgn de bleu de mthylne ou de rsazurine).

Tableau 2 : Rpartition des anarobies dans les suppurations mixtesAbcs du Pneumonie Tte Suppurations Pus poumon Tissus de et abdominales gyncologiques Pleursie mous dglutition cou purulente Bacteroides fragilis +++ (+) / + (+) + B. du groupe ++ (+) (+) + (+) + fragilis Prevotella bivia / +++ / 0 0 Prevotella oralis / + +++ +++ ++ + Porphyromonas / + (+) (+) + ++ spp Fusobacterium / + ++ +++ ++ / nucleatum Fusobacterium / / / / ++ / necrophorum Peptostreptococcus + ++ ++ ++ ++ ++ spp Actinomyces spp / ++ + ++ ++ (+) Clostridium ++ / + / 0 + perfringens+++ : espce prsente dans la majorit des prlvements + ++ : prsence dans 20 80 % des prlvements (+) : espces isoles dans 10 20 % des prlvements

4 - Identification L'identification s'effectue en deux temps : - Identification prsomptive Elle utilise des mthodes simples accessibles par tous les laboratoires : * tude de la mobilit entre lame et lamelle en contraste de phase, * coloration de Gram, * recherche d'une oxydase et d'une catalase, * croissance en prsence d'antibiotiques (kanamycine, colistine, vancomycine) ou d'inhibiteurs (bile, vert brillant), * tude de la fermentation des sucres, de la production d'indole et d'une glatinase l'aide d'une galerie miniaturise, * tude des caractres enzymatiques grce une galerie d'identification rapide. Les bactries les plus frquentes sont identifies par ces mthodes simples mettre en oeuvre : Bacteroides fragilis, Bacteroides ureolyticus, Prevotella melaninogenica, Prevotella hivia, Fusobacterium nucleatum, F. necrophorum, Porphyromonas gingivalis, Bilophila wadsworthia, Clostridium perfringens, Clostidium dijficile, Propionibacterium acnes, Actinomyces meyeri. Cette orientation prsomptive permet la dtermination du genre bactrien de la grande majorit des anarobies (ce qui est souvent suffisant). * Identification dfinitive L' identification prcise de certaines espces est plus dlicate et ncessite des examens complmentaires : chromatographie en phase gazeuse, biologie molculaire.

4 - Sensibilit aux antibiotiquesLes bactries anarobies provoquent un nombre important d'infections qui ncessitent une thrapeutique spcifique. Les Bacteroides du groupefragilis sont rsistants de nombreux antibiotiques. Certaines espces sont scrtrices de bta-lactamases, d'autres sont rsistantes au mtronidazole. L'isolement,

l'identification et la dtermination de la sensibilit aux antibiotiques sont aussi importants pour ces bactries que pour les autres pathognes (tableau 3).

Tableau 3 : Antibiotiques tudier pour une bactrie anarobie

Bacteroides du groupe fragilisamoxicilline amoxicilline + ac. clavulanique cphamycine (cfoxitine ou cfottan) cfotaxime imipnme clindamycine mtronidazole

Autres bacilles Gram ngatif ( Prvotella,Fusobacterium)amoxicilline

amoxicilline + ac. clavulanique mtronidazole

Cocci Gram + et Bacilles Gram + non sporul (Propionibacterium, Actinomyces)Actinomyces) pnicilline

mtronidazole vancomycine ofloxacine (pour Propionibacterium)

Clostridiumampicilline amoxicilline + ac. clavulanique

mtronidazole vancomycine clindamycine

ECHNIQUES DE STERILISATIONA/ Strilisation par la chaleur : I / Chaleur sche ( oxydation des protines ):o chauffage direct :

- Effectuer trois ou quatre passages lents des objets striliser dans la flamme bleue du bec Bunsen afin de dtruire sa surface toute matire organique - A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes de verre...), pour certains objets en mtal (anse , pince), ne convient pas pour le plastique, les objets tranchants, les instruments de chirurgie dlicats ...o strilisateurs air chaud ( fours Pasteur, Poupinel, de type Jouan ) :

- Emballer le matriel dans du papier aluminium, les rcipients et tubes col doivent tre bouchs avec du coton card - Les spores et germes sont dtruits en chaleur sche, par un chauffage de : 4 heures 140 C ; 2 heures 30 160C ; 30 min 180C - A utiliser pour la verrerie, porcelaine et instruments mtalliques ( indispensable pour les parties des objets qui ne peuvent pas tre atteintes par la flamme ) - Ne convient pas pour les objets en matire plastique ou caoutchouc ou objets dlicats. II / Chaleur humide ( dnaturation des protines ) :o autoclavage ( mthode de strilisation la plus efficace )

- Dans une atmosphre de vapeur d'eau exempte d'air, toutes les bactries y compris les spores sont tues en 20 min 121C. Pour un volume donn, la temprature est fonction de la pression ; on obtient la temprature requise de 120C, trs suprieure la temprature normale d'bullition de l'eau, en chauffant en surpression, c'est dire en vase clos. L'appareil utilis est l'autoclave. - La prparation du matriel se fait selon l'indication du fournisseur de l'autoclave, savoir de faon gnrale que la verrerie sera bouche au coton et recouvert de papier aluminium, les rcipients contenant un milieu de culture seront remplis aux 3/4, les instruments mtalliques sont dposs sur un plateau de boites spciales contenant une solution de carbonate de soude 2% contre la rouille ...

- Ne convient pas pour les produits liquides dlicats ( milieux albumineux, lait, glatine ... ) - A utiliser pour les milieux de culture, matriel en caoutchouc, la verrerie, les instruments de prlvement et la strilisation du matriel aprs son utilisation.o bullition

- Un chauffage de 30 minutes 100C par bullition ou un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit dtruire toutes les formes vgtatives. Dans ces conditions les spores ne sont pas dtruites : on peut amliorer ce moment l l'efficacit de l'bullition en ajoutant l'eau des solutions salines concentres ( augmentation du point d'bullition ) ou en prolongeant le chauffage. - A utiliser pour la strilisation des produits liquides dlicats : milieux albumineux, lait, glatine, solutions concentres de glucides, ... III / Pasteurisation et tyndallisation :o pasteurisation

- Conservation des produits naturels pendant un temps limit, ne dtruit que les formes vgtatives mais pas les spores. - Le liquide est port rapidement 90C pendant 30s, par exemple,puis on le refroidit brusquement 10C. - Conservation des produits alimentaireso tyndallisation

- Chauffage 70-100C plusieurs reprises ( 1 heure tous les jours pendant 3 jours ) dans un bain marie thermostat. - Utilisation trs limite aux substances thermolabiles non filtrables (mulsion de jaune d'oeuf, vaccins), prparation de milieux base de srum ou de jaune d'oeuf. B/ Strilisation par filtration: Plusieurs types de filtration existe : - les bougies de type Chamberland : tubes fond arrondi dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la dimension de ces pores varie de quelques m au 1/10 me de m. - disques : disques en verre fritt de porosit de 150 1 m. - membranes : membranes plastiques minces comportant des millions de pores par cm2 dont la taille, trs uniforme, varie de 8 0.01 m et occupant environ 80% du volume du filtre.En bactriologie, on utilise surtout les filtres de 47 mm de diamtre dont les

pores 0.45 m de diamtre retiennent peu prs tous les microorganismes en dehors des virus. Striliser des liquides altrables par la chaleur : srums, solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines ... C/ Action des agents chimiques : L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espces bactriennes dtermines au sein d'une flore poly-microbienne. I / Antiseptiques - Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantanne. Ils agissent l'intrieur de l'organisme ou sa surface : teinture d'iode, mercryl lauryl, permanganate de potassium, eau oxygne ... - Utilisation locale chez les tres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses II / Dsinfectants - Empche les contaminations humaines et animales - vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'thylne ) - liquides ( phnols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permangante de potassium ) - solide ( chaux vive ) - Utiliser pour tous les milieux extrieurs l'Homme : eau, air, sol ( objets inanims, dsinfection du matriel plastique utilis en microbiologie ) III / Antibiotiques Substances d'origine naturelle ou obtenues par synthse chimique. On distingue : - les antibiotiques bactriostatiques qui stoppent la multiplication des bactries sans les dtruire - les antibiotiques bactricides qui tuent les bactries Utilisation in vivo. D/ Action des radiations :

- C'est la lumire U.V qui est le plus souvent utilise ( lampes germicides ou strilampes ) : strilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux ou des hottes, servant aux manipulations en atmosphre strile ( hottes flux laminaire ). - Utilisation en virologie, cultures cellulaires, prparation et conditionnement des produits pharmaceutiques, ensemencements bactriens, prparation de milieux. L'irradiation prcde et suit la manipulation. - Les rayons X ou y sont utiliss pour la conservation de certains produits alimentaires.

TECHNIQUES D'ENSEMENCEMENTLensemencement consiste dposer dans un milieu neuf des germes prlevs dans un milieu de culture mre. Le transport est en gnral effectu avec une anse ou une pipette Pasteur. 1 / Ensemencement avec une anse:

- prendre les prcautions ncessaires pour travailler dans de bonnes conditions daseptie ( nettoyage paillasse, mains ... ) - veiller travailler dans la zone strile autour du bec Bunsen - tenir le tube contenant la culture mre dans la main gauche, dboucher prs de la flamme et garder le coton dans la main. - flamber louverture du tube. - striliser lanse en la portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone strile. - prlever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage : . repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prlev lintrieur de la boucle . repiquage sur milieu solide : repiquer en dplaant en zig zag laiguille sur la surface de lagar, du fond du tube vers louverture, en prenant soin de ne pas rafler la glose

- repasser dans la flamme laiguille ensemencer en la portant au rouge. Laiguille est prte pour un nouvel ensemencement . - flamber louverture des tubes, flamber lgrement les cotons, boucher. 2 / Technique d'ensemencement avec la pipette Pasteur : Les manipulations se diffrencient des prcdentes par quelques dtails : - la pipette est passe rapidement dans la flamme. - l'effilure est casse la pince dans la zone strile. - on aspire les bouillons de culture ( viter que le bouillon de culture souille le coton, danger d'infection pour le manipulateur, pas plus que la salive du manipulateur, danger d'infection pour la culture ) - on souffle pour ensemencer dans le tube strile. - la pipette ne sert qu'une fois.

TECHNIQUES D'ISOLEMENTPour tudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilises : - la mthode des stries - la mthode des dilutions 1 / Mthode des stries : Cas d'un ensemencement en surface partir d'un prlvement liquide ou solide : - prendre les prcautions habituelles pour un ensemencement ( n'ouvrir que le temps ncessaire l'excution des stries et n'entrebailler alors la boite que devant un bec Bunsen ) - porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone strile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture ( solide ) ou le tube ( liquide ) - prlever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge

- ensemencer de la faon suivante :

- partir de 1 en ensemenant selon le sens des flches jusque vers 2. Flamber l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement la direction prcdente 1-2 jusque vers 3. - les boites de Ptri sont mises en position renverse l'tuve 30C. Observer aprs 24 48 heures selon le cas ( la position renverse permet l'eau de condensation de s'vaporer ). 2 / Mthode des dilutions : Cas d'un ensemencement en surface par talement d'un milieu liquide : Cette technique permet, aprs un talement sur milieu solide, d'valuer le nombre de colonies par ml de suspension. Elle peut permettre galement, si l'on ne dispose pas de lame numration, la dtermination du nombre de cellules par unit de volume ou du nombre de cellules prsentes dans une colonie. - les dilutions sont faites dans de l'eau distille ou dans un liquide physiologique de type Ringer - numroter des tubes essai de 1 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de dilution - dans le tube 1, l'aide d'une pipette strile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois fois. - homogniser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prlever 0.1 ml et verser dans le tube 2. Ainsi de suite jusqu' l'obtention de la dilution n10. - fabrication de l'taloir en verre : - la flamme d'un bec Bunsen, plier la partie capillaire environ la moiti de sa longueur de faon en faire un angle de 120

- procder de mme pour plier la moiti le segment prcdent de faon ce qu'il fasse un angle aigu - replier de la mme faon l'extrmit vers le haut sur un demi centimtre environ - l'taloir est maintenu dans un flacon d'alcool - dposer sur une boite de Ptri contenant un milieu nutritif glos, 0.1 ml de chacune des dilutions indiques - taler avec l'taloir de faon uniforme par un mouvement de balayage et de rotation sur l'ensemble de la surface de la glose ( ne pas ratisser la surface de la glose ). - laisser scher les boites 10 min, les dposer ensuite l'tuve, aprs les avoir retournes, observer 24 heures plus tard. - compter les colonies apparues aux dilutions de 3-300 colonies, faire la moyenne des chiffres obtenus en ramenant tout la mme dilution. Evaluer alors le nombre de colonies par ml de suspension donne.