La Pathologie Molculaire - Roche Diagnostics - smpf.info ? Type dchantillon primaire Tissus

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    13-Sep-2018

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  • La Pathologie Molculaire - Roche Diagnostics

    Journe du SMPF 18 juin

    Nathal Menras

  • Sommaire

    A- Prsentation de la socit

    B- Principe de la mthode

    C- Ralisation de lanalyse

    D- Principaux points critiques et maitrise

    E- Performance de la mthode

    F- Maitrise de la qualit des rsultats

    G- Modalits pratiques

    H- Rendu du rsultat

    CONCLUSION

  • A- Prsentation de la socit

    Sige social :

    ROCHE DIAGNOSTICS

    2 avenue du Vercors BP59

    38240 MEYLAN

    Rpartition en France Equipe Pathologie molculaire

    Nombre de commerciaux : 15

    Nombre de techniciens : 9

    Certification / Accrditation

    ISO 13485 ISO 14001 ISO 9001

    OHSAS 18001 autres

  • B- Principe de la mthode

    Principe de la mthode

    Le test cobas EGFR repose sur deux procdures majeures :

    (1) prparation manuelle des chantillons pour obtenir de l'ADN partir de plasma ou de tissus FFPE ;

    (2) amplification par PCR et dtection de l'ADN cible l'aide de paires d'amorces complmentaires et de

    sondes oligonuclotidiques marques par des fluorophores.

    Type dchantillon primaire

    Tissus FFPE et/ou plasma

    Rcipient / ractifs (selon Fiches Techniques)

    Tampon de lyse, Protinase K, Tampon de liaison, Tampons de lavages, Tampon dElution, tubes de

    filtration, tubes de prlvement, Master Mix, Acetate de Magnesium, Contrle mutant, diluants

    Pr-traitement de lchantillon

    Dparaffination de lchantillon selon protocole

    Marquage CE-IVD & FDA oui non avec validation clinique des tests

    Codage CNQ oui non mais participation EQA externes

  • C- Ralisation de lanalyse

    Description de la phase pr-analytique

    Une coupe dparaffine de 5m de tissus FFPE est lyse, les acides nucliques sont librs. Fixation de cet

    ADN sur filtre de verre, lavages et Elution dans un tampon.

    La quantit dADN gnomique est dtermine par spectrophotomtre et ajuste

    Revue de contrat / critres dacceptation

    Un contrle mutant du test cobas EGFR (EGFR MC) et un contrle ngatif (NEG) sont inclus dans

    chaque run d'un maximum de 30 chantillons. Un run est valide si le contrle mutant EGFR (EGFR MC) et

    le contrle ngatif (NEG) sont valides. Si un contrle mutant EGFR (EGFR MC) ou un contrle ngatif

    (NEG) est invalide, tout le run est invalide et doit tre rpt.

    Description de la phase analytique (exemple EGFR)

    Le test cobas EGFR Mutation Test v2 est une PCR en temps rel spcifique dallles pour la dtection

    qualitative et l'identification de mutations dans les exons 18, 19 , 20, 21 du gne de l'EGFR . Pour les

    chantillons plasmatiques, une information semi-quantitative est galement fournie pour le suivi dans

    le temps des mutations dEGFR dtectes dans lADN tumoral circulant.

  • D1- Principaux points critiques et maitrisePhase pr-analytique

    Points critiques

    Contamination

    Intgrit

    Elimination dchets

    Prlvements

    Transport

    Quantit

    Conservation, stabilit

    Quantification de lADN

    FICHE TECHNIQUES TESTS

  • D1- Principaux points critiques et maitrisePhase pr-analytique

    Points critiques Maitrise

    Contamination Organisation du flux, Amprase (annexe 1)

    Intgrit

    Elimination dchets

    Prlvements

    Transport

    Quantit Coupe dparaffine de 5 m de tissus

    Conservation, stabilit

    Quantification de lADN Mesure de lintgrit, du rendement

    dextraction, ajustement de la quantit

    ncessaire pour la PCR pour viter le taux

    dinvalide

  • D2- Principaux points critiques et maitrisePhase analytique

    Points critiques

    Sensibilit Analytique Limite de dtection

    Contenu Tumoral Minimal

    Spcificit

    Interfrence

    Tissus ncrotique

    Rptabilit

    Reproductibilit

    Points critiques

    Reproductibilit Clinique

    Corrlation avec echantillons essais EURTAC

    phase III

    Donnes de rsultats cliniques

    Phase clinique

    FICHE TECHNIQUES TESTS

  • D2- Principaux points critiques et maitrisePhase analytique

    Points critiques Maitrise

    Sensibilit Analytique Limite de dtection Couverture des mutations et sensibilit de chacune delles. Index de quantification pour lADN tumoral Circulant

    Contenu Tumoral Minimal Macrodissection si contenu tumoral 10%

    Spcificit

    Interfrence

    Tissus ncrotique Pas deffet jusqu 60%

    Rptabilit

    Reproductibilit

    Points critiques Maitrise

    Reproductibilit Clinique

    Corrlation avec echantillons essais EURTAC

    phase III

    Donnes de rsultats cliniques

    Phase clinique

  • E- Performances de la mthode

    Sensibilit

    Couverture

    Robustesse dans le temps

    Rapidit de mise en uvre / Simplicit dinterprtation

  • Sensibilit Avantages Inconvnients

    SEQUENCAGE

    SANGER~20%

    Detection de toutes les mutations

    Faible cot

    Technologie couramment utilise

    Pas sensible necessite un ratio mutant/wt lev

    Technique longues avec beaucoup dtapes

    manuelles

    PYROSEQUENCAGE ~5-10%Peu de matriel ncessaire

    4 heures aprs extraction

    Cots levs

    Compliqu, demande de personnel qualifi

    Interprtation des rsultats difficile

    ANALYSES

    DE FUSION (HRM)~5-10%

    Mthode rapide pour distinguer des variants

    Temps de manips rapides

    Cots faibles

    Interprtation des rsultats difficile

    (Difficult pour dfinir des variants spcifiques)

    SEQUENCAGE DE

    NOUVELLE-

    GENERATION (NGS)

    ~1-5%Dtection de toutes les mutations

    Bonne sensibilit et spcificit

    Prix lev

    Difficile standardiser. Artefacts FFPE

    Process trs long

    Personnels hautements qualifis

    Analyse des donnes complexe : big data

    PCR

    ALLELE-

    SPECIFIQUE

    ~0.1-1%

    Kits ddis valids disponibles

    Trs hautes sensibilit/spcificit

    Temps de manip rapide, facile dutilisation,

    Facilit dinterprtation

    Dtection des mutation est slective; Certains

    variants rares peuvent ne pas tre dtects

    Source: Bronte, et al. New findings on primary and acquired resistance to anti-EGFR therapy in metastatic colorectal cancer:

    do all roads lead to RAS? Oncotarget. 2015 Sep 22;6(28):24780-96.

    Sensibilit des techniques

    A partir de tissus FFPE

  • Couvertures des mutations on oncologie Molculaire

    Approche cible par Biomarqueurs

    Approche par Squenage Haut Dbit

    tests ExonsNombres Mutations

    Dtail

    BRAF 15 3 V600 E, K D

    KRAS 12,13,61 19Exon 2: G12 (S, R, C, D, A, V); G13 (S, R, C, A, V); G13D; Exon 3: codon 61

    EGFR 18,19,20,21 42

    Exon 18: G719 (A, S, C)Exon 19: 29 DeletionsExon 20: T790M, S768I, 5 InsertionsExon 21: L858R, L861Q

    PI3KCA 1,4,7,9,20 17

    Exon 1: R88QExon 4: N345KExon 7: C420RExon 9: E542K, E545 (A, D, G, K); Q546 (E, K, L, R)Exon 20: M1043I; H1047 (L, R, Y); G1049R

    BRAF/NRAS RUO11 BRAF25 NRAS

    BRAF: V600 (E, E2, D, K, R); K601E; G466 (V,A), G469 (V,A,R)NRAS: G12 (A,C,D,R,S,V); G13 (A,C,S,D,R,V); A18T; A59 (T,D); Q61 (Ha, Hb, K,L,P,R); K117(Nt,C); A146 (T,V)

    KRAS V2 RUO 2,3,4 28

    Exon 2: G12 (S, R, C, D, A, V); G13 (S, R, C, A, V); G13D;

    Exon 3: A59 (T, S, G, E); Q61 (K, E, P, R, L,); Q61D;

    Exon 4: K117; A146 (T, P, V)

    - Dfinition de panels cibls faons de 10 50 gnes

    - Panels larges (300 gnes) ou approche whole exome ou whole gnome

  • F- Maitrise de la qualit des rsultats

    Contrles Internes de la Qualit (CIQ)

    Un contrle positif mutant

    Un contrle ngatif

    Permettent de valider la srie entire

    - La non-contamination avec le tmoin ngatif,

    - La qualit des ractifs et la performance du

    systme avec le tmoin positif

    Evaluation externe de la Qualit (EEQ)

    A chaque run

  • Programmes EQAInitiateurs des programmes qualit externes

    Le premier il y a dj 5 ans

    Avec Qualifications des chantillons

    initiaux sur technique COBAS

  • Programmes EQAParticipation aux diffrents EQA

    Nom EQA date Cible Test / Tests optionnels Anne

    ESP Colon EQA30/09/2015

    Cancer Colorectal KRAS & BRAF 2016/2017

    gen&tiss (afAQap)Juillet 2016

    Cancer Colorectal KRAS / BRAF, NRAS, MSI, PIK3CA 2016

    AdnocarcinomePoumon

    EGFR / KRAS, BRAF, PIK3CA, ERBB2amp 2016

    Mlanome BRAF / NRAS, KIT 2016

    UK NEQAS Edinburgh31/03/2016

    Cancer Colorectal KRAS / NRAS, BRAF, PIK3CA 2016/2017

    AdnocarcinomePoumon

    EGFR / ALK rearrangement, KRAS, BRAF, PIK3CA

    2016/2017

    Mlanome BRAF / NRAS, KIT 2016/2017

  • G1- Modalits pratiques

    Installation dans un laboratoire

    Taille du ou des automates

    Colis livraison : # x # x # cm

    Automate mont : 57.4 cm x 58.8 cm x 49.7 cm

    Connection

    Eau Eaux uses Gaz Electricit

    Onduleur climatisation Autres

    Connection SIL : oui (tiquetage spcifique: oui / non) non

    Conditions environnementales

    Tempratures danalyse : entre 15 et 32C

    Ventilation spcifique : non

    Automate isoler dans une pice spcifique : Pas de pice spcifique mais dfinition de 3 zones : Prparation du master mix, Extraction et PCR.

    Risque sant personnel

    La dparaffination doit tre effectue sous une hotte chimique (Xylne)

    Dtail des symboles de scurit et avertissements dans les fiches techniques

  • G2- Modalits pratiques

    Mise en service dans un laboratoire

    Installation

    Dure dinstallation : 30 min

    PV dinstallation : oui

    Mise en service

    Dure de mise en service : 2 heures

    PV de mise en service : idem prcdent

    Habilitation du personnel technique

    Formation initiale : 2 jours

    Notice fournisseur

    oui (en Franais) oui (langue trangre) non

    Obligatoire pour des tests CE-IVD

  • G3- Modalits pratiques

    Maintenance

    Gestion des dchets

    Modalit pratique :

    DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2, EGFR MC et DNA SD contiennent de l'azide de

    sodium. L'azide de sodium peut ragir avec les conduits en plomb ou en cuivre pour former des azides mtalliques trs

    explosifs. Lors de l'limination des solutions contenant de l'azide de sodium dans les viers du laboratoire, il convient de

    rincer la tuyauterie abondamment avec de l'eau froide afin d'viter la formation d'azides.

    liminer les ractifs inutiliss et les dchets conformment la rglementation nationale et locale applicable.

    Maintenance prventive interne

    Frquence et dure : Nettoyage de lanalyseur. Quelques minutes

    Il n'est pas indispensable de nettoyer rgulirement l'analyseur et ses accessoires. Au besoin, nettoyez le compartiment de l'analyseur, le bloc thermocycleur et le capot du thermocycleur avec de l'thanol 70 %.

    Maintenance prventive externe

    Frquence et dure : Annuelle pour le cobas 4800, pas de maintenance prventive pour el cobasz480

    Maintenance curative

    Dlai dintervention : 8 heures ouvres

  • H- Rendu du rsultat

    Mode dexpression du rsultat

    Mut / non-mut par variants selon les diffrents tests

    SQI : Index Semi-quantitatif partir de plasma

    Critres de rfrence

    Rapport crit qui donne automatiquement le rsultat. Connexion LIS

    Prestations de conseil / modalits dinterprtation

    Donnes bibliographiques tablies, disponibles dans les fiches techniques

    Rgles dinterprtation dcrites dans ce mme document

  • Conclusion

    La technique cobas

    Systme trs facilement intgrable dans lactivit

    de pathologie molculaire.

    Qualification COFRAC

    Technique trs complmentaire du

    squenage haut dbit qui se dveloppera de

    plus en plus dans les annes venir. Permet de

    se former simplement au poste de biologie

    molculaire

    Tests valids cliniquement

    Complmentarit des tests partir de tissus et

    plasma.Merci !

    v2

  • ANNEXES

  • Roche Automated Tissue Dissection System

    Systme de microdissection et prlvement.

    Morphologie et NGS au cur de la Pathologie Molculaire

    Sortie 2017

  • 25 Septembre 2013 - Partenariat

    PacBio a commercialis le 1er squenceur de 3eme gnration

    Partenariat sur une technologie de squenage Single Molcule ,

    en temps rel (SMRT).

    Fournir un squenceur de 3eme gnration Single Molcule pour

    des applications en diagnostic.

    Oncogntique, Gntique, Onco-hmatologie

    PACIFIC BIOSCIENCES

    Partenariat avec Roche

  • 02 Juin 2014 - Acquisition

    Genia dveloppe une technologie de squenage de 4eme

    gnration.

    Technologie unique base sur les nanopores utilisant un circuit

    semi-conducteur intgr sur une puce de silicium avec NanoTags

    Fournir une plateforme de squenage dADN "Single

    Molecule" base sur des semi-conducteurs qui exploite la

    technologie des nanopores.

    Genia

    Acquisition par Roche

  • Lorientation du testing en oncologie

    Biomarqueurs Panel Exome Whole Exome Whole Gnome

  • Amplification Slective par Amprase

    L'amplification slective des acides nucliques cibles de l'chantillon est assure grce l'enzyme AmpErase (uracile-Nglycosylase)

    et la dsoxyuridine triphosphate (dUTP) du test cobas EGFR7. L'enzyme AmpErase reconnat et catalyse la

    destruction des brins d'ADN contenant de la dsoxyuridine, mais pas ceux contenant de la thymidine. L'ADN naturel ne

    contient pas de dsoxyuridine, mais les amplicons en contiennent toujours du fait de l'utilisation de dUTP la place de la

    dTTP comme l'un des nuclotides triphosphates des master mix ; ainsi, seuls les amplicons renferment de la dsoxyuridine.

    La dsoxyuridine rend l'amplicon potentiellement contaminant susceptible d'tre dtruit par l'enzyme AmpErase

    avant l'amplification de l'ADN cible. L'enzyme AmpErase, qui fait partie des ractifs de master mix, catalyse le clivage de

    l'ADN contenant de la dsoxyuridine au niveau des rsidus de dsoxyuridine en ouvrant la chane de dsoxyribose en

    position C1. Lorsqu'elle est chauffe au cours de la premire tape du thermocyclage, un pH alcalin, la chane d'ADN de

    l'amplicon se casse au niveau de la dsoxyuridine, ce qui rend l'ADN contaminant non amplifiable. Lenzyme AmpErase

    est inactive des tempratures suprieures 55 C, cest--dire lors des tapes de thermocyclage, et ne dtruit donc pas

    lamplicon cible. Il a t dmontr que le test cobas EGFR dsactivait l'amplicon d'EGFR mutant contenant de la

    dsoxyuridine.

    Pour viter les contaminations par des amplifications prcdentes

  • Doing now what patients need next

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