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Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

Annales de Cardiologie et d’Angéiologie 62 (2013) 139–143

Article original

La restriction sodée prévient le remodelage cardiovasculaire dansl’insulinorésistance chez le rat

Sodium restriction prevents cardiovascular remodeling associated with insulin-resistance in the rat

C. Rugale , C. Oudot , C. Desmetz , C. Guzman , A. Lajoix , B. Jover ∗EA7288, groupe rein et hypertension, PRES Sud de France, institut universitaire de recherche clinique, 641, avenue du Doyen-Gaston-Giraud,

34093 Montpellier cedex 5, France

Recu le 31 janvier 2013 ; accepté le 8 mars 2013Disponible sur Internet le 28 mars 2013

ésumé

But de l’étude. – L’objectif de ce travail était d’évaluer l’influence de la restriction de l’apport alimentaire en sodium sur les changements de laorphologie cardiaque et vasculaire associés à une insulinorésistance.Animaux et protocoles. – À huit semaines d’âge, les rats recoivent soit un régime contenant 60 % de fructose avec (0,64 %) ou sans (< 0,01 %)

odium, soit une alimentation standard (0,64 % de NaCl) pendant 12 semaines.Résultats. – L’augmentation de l’HOMA index et de l’insulinémie à jeun confirme l’installation d’une insulinorésistance. Le régime fructose

’accompagne d’une hypertrophie cardiaque et vasculaire ainsi que d’une augmentation de la proportion de collagène indiquant une fibroseardiaque. Aucune variation significative de la pression artérielle ou de l’expression de l’ARNm de l’aldostérone synthétase n’est notée. Enevanche, on observe une augmentation du stress oxydant, évalué par la fluorescence du dihydroéthidium (DHE), dans le tissu cardiaque. Le régimeésodé prévient l’insulinorésistance, l’augmentation de la masse cardiaque et la fibrose cardiaque de même que l’élévation de l’aire de section dea carotide. Parallèlement, le marquage du DHE est normalisé dans le tissu cardiaque des rats nourris par le régime fructose sans sodium.

Conclusion. – La prévention de l’élévation du stress oxydant est très probablement l’un des mécanismes impliqués dans l’effet favorable de laéduction de la consommation de sodium sur les altérations cardiovasculaires associées à une insulinorésistance d’origine alimentaire.

2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

ots clés : Régime fructose ; Anion superoxyde ; Remodelage cardiaque ; Hypertrophie vasculaire ; Aldostérone synthétase

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Aim of the study. – In the present work, the objective was to evaluate the influence of a dietary sodium restriction on cardiovascular morphologyhanges associated with insulin-resistance.

Animals and protocol. – At 8 weeks of age, rats were fed for 12 weeks a 60%-fructose diet containing a regular sodium content (0.64%) orotally lacking in sodium chloride (< 0.01%). A group of rats fed a wheat starch-based diet with regular sodium content served as control group.

Results. – Elevated HOMA index and plasma insulin confirm the presence of insulin-resistance in fructose-fed rats. Concomitantly, an increase inardiac mass and in cardiac collagen (Sirius red staining) was detected without obvious change in arterial pressure or cardiac aldosterone synthaseRNA expression. In addition, cross-sectional area of the carotid artery was higher in fructose-fed rats. Production of superoxide anion, equated

ith dihydroethidium (DHE) staining, was enhanced in cardiac tissue of rats with insulin-resistance. Withdrawal of sodium from the fructose dietrevented all the cardiovascular effects of fructose consumption, including DHE staining.

Conclusion. – These results are in favor of the participation of oxidative stress normalization in the beneficial influence of dietary sodiumeprivation on cardiovascular remodeling in this model of insulin-resistance in rats.

2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

eywords: Fructose diet; Superoxide anion; Cardiac remodeling; Vascular hypertrop

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : bernard.jover@inserm.fr (B. Jover).

003-3928/$ – see front matter © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.ancard.2013.03.001

hy; Aldosterone synthase

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. Introduction

Chez l’homme, l’augmentation de la consommation de fruc-ose serait impliquée dans le développement de l’obésité et duyndrome métabolique [1]. Elle s’accompagnerait d’atteintesardiaques comme illustré par l’augmentation du contenu enollagène et d’une dysfonction diastolique chez des patientsnsulinorésistants [2]. L’augmentation de la consommation dee sucre simple provoque chez le rat de nombreuses altéra-ions métaboliques dont une résistance hépatique et musculaire

l’insuline. Chez le rat soumis à un régime enrichi en fructose,ette insulinorésistance s’accompagne comme chez l’homme deodifications cardiaques dont une augmentation de la masse car-

iaque [3,4]. Dans un modèle de diabète de type 2 non obèse, leat Goto Kakizaki, le remodelage du ventricule gauche précèdee diabète de type 2 [5], suggérant que l’altération débute dansa phase d’insulinorésistance. Ce remodelage est caractérisé parne hypertrophie marquée des cardiomyocytes et une augmenta-ion des dépôts de la matrice extracellulaire qui se traduit par uneugmentation de la taille du cœur en l’absence de changementsltrastructurels.

Divers facteurs peuvent intervenir dans les atteintes desrganes cibles de maladies complexes et chroniques. Dans’hypertension artérielle, l’ingestion de sodium apparaît commen modulateur des atteintes cardiaques tant chez l’homme [6]ue chez l’animal [7,8]. Dans l’insulinorésistance, nous avonsécemment montré que l’effet bénéfique de la restriction de’apport alimentaire en sodium prévenait aussi les atteintesénales [9,10]. Ces effets sont peu liés à un effet tensionnel etourraient être le résultat d’une amélioration de la sensibilité à’insuline comme observé chez l’homme à court terme [11] maisas chez l’animal où une diminution de la sensibilité à l’insulinest rapportée [12]. Plus probablement, l’effet bénéfique de la res-riction sodée est en rapport avec une prévention de l’installation’un stress oxydant et d’une inflammation au niveau des tissusoncernés.

L’hypothèse principale de cette étude est que les modifica-ions morphologiques cardiaque et vasculaire associées à unégime riche en fructose peuvent être prévenues par une restric-ion en sodium alimentaire. L’objectif spécifique est d’évaluera participation du stress oxydant au niveau du muscle car-iaque dans ce modèle représentant un stade précoce précédant’hyperglycémie et le diabète [13]. Parallèlement, une ana-yse biomoléculaire de l’expression cardiaque des gènes de’aldostérone a été réalisée.

. Animaux et méthodes

L’étude est réalisée en accord avec la réglementationrancaise et européenne sur l’utilisation et le conditionnementes animaux de laboratoire (Permis B-3417226 – EEA 34179).

.1. Animaux et protocole

Des rats mâles Sprague Dawley (n = 24) de 200–220 g auébut de l’étude (Charles River ; L’Arbresle, France) sont nour-is pendant 12 semaines avec une nourriture solide à base de

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ructose (60 %) contenant soit une quantité habituelle de sodium0,64 % NaCl, régime normosodé fructose [NSF], n = 8) soitotalement dépourvu de sodium (< 0,01 % NaCl, régime désodéructose [DSF], n = 8) et de l’eau en boisson. Un groupe de ratonsommant une alimentation standard (A04, UAR, Épinay-ur-Orge, n = 9) contenant 0,64 % de NaCl (régime normosodétandard [NSS], n = 8) sert de groupe témoin.

.2. Paramètres métaboliques, glycémiques et pressionrtérielle

La dernière semaine de l’étude, les animaux sont placés enage à diurèse individuelle avec un accès libre à l’eau et la nour-iture. Après trois jours de stabilisation, le poids corporel, laonsommation solide et hydrique et la diurèse sont mesurés quo-idiennement pendant 3 jours. La veille de l’expérimentation, unathéter polyéthylène est implanté sous anesthésie dans la caro-ide droite et placé sous la peau du cou. Les rats sont mis àeun toute une nuit. Le lendemain, le cathéter est externalisét la pression artérielle est mesurée chez l’animal vigil suivie’un premier prélèvement (200 �L) de sang pour la mesuree la glycémie (glucomètre Optium Xceed, Medesense) et de’insuline (kit Elisa, Millipore). La sensibilité à l’insuline estalculée par l’index HOMA : (insuline plasmatique à jeun enU/mL × glucose plasmatique à jeun en mg/dL)/2,430 [14].

.3. Morphologie cardiaque et vasculaire

L’artère carotide cathétérisée est préparée pour une perfusion-xation de formaline 10 % à la pression standard de 100 mmHg.près inclusion dans la paraffine, l’aire de la section de la caro-

ide est mesurée sur des coupes de 3 à 5 �m après marquage l’hématoxyline-éosine. Le cœur a été prélevé, nettoyé desissus adjacents et les différentes chambres ont été découpéesoreillettes, ventricule gauche avec septum, paroi du ventriculeroit) et pesées. L’index de masse cardiaque est calculé commee rapport entre les poids du cœur et du corps (mg de cœur/ge corps). Une section transverse du ventricule gauche (VG) estlacée dans une solution de formaline à 10 %. Après inclusionans la paraffine, les coupes de VG (3–5 �m) servent à diversarquages. Le collagène est déterminé par coloration au rougeirius (0,1 %) dans un champ donné et exprimé en pourcentagee la superficie totale du champ. Dix à 15 champs par coupe deœur et trois coupes de cœur par rat ont été analysés.

.4. Détection de l’anion superoxyde par le DHE

La présence d’anion superoxyde est appréciée à l’aide d’uneonde fluorescente : le dihydroéthidium (DHE, Invitrogen).près pénétration dans les cellules (2,5 �M, 30 minutes à 37 ◦Cans le noir), le DHE oxydé par l’anion superoxyde formen produit fluorescent qui s’intercale dans l’ADN. La fluores-

ence est visualisée (Nikon, microscope TM300 avec systèmee numérisation DXM1200), et la quantification s’effectue avece logiciel d’analyse d’image (ImageJ).

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Fig. 1. Hypertrophie cardiaque et aortique dans les groupes normosodé stan-dard (NSS), normosodé fructose (NSF) et désodé fructose (DSF). A. Index demasse cardiaque. B. Relation entre le poids corporel et la masse cardiaque. C.Ap

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.5. Expression cardiaque des gènes de l’aldostérone

L’expression de l’hydroxystéroïde déshydrogénase (11 �SD2) et de l’aldostérone synthétase (CYP11�2) ainsi que deuatre gènes de références (MGP, PPIB, HPRT et RPL) estéterminée dans le tissu cardiaque après extraction (QiagenNeasy) et rétrotranscription (kit SuperScript II Reverse trans-riptase, INVITROGEN). En raison de la faible fréquence desènes d’intérêt, une première PCR a eu lieu à 13 cycles avec desmorces externes suivie d’une qPCR à 40 cycles (PCR nichée)vec des amorces internes. Le niveau d’expression d’un gèneible est normalisé [15].

.6. Analyse statistique

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Une Anova un facteur a été réalisée pour chacune des variables mesurées.es comparaisons inter- et intragroupes ont été réalisées avec le

est de Fisher protected least significance difference (PLSD).

. Résultats

.1. Paramètres métaboliques, glycémiques et pressionrtérielle

Les caractéristiques générales des rats à la 12e semaine deégime sont présentées dans le Tableau 1. Le poids corporelnal est similaire dans les trois groupes. L’excrétion urinairee sodium est similaire dans les deux groupes NS et, commettendu, elle est pratiquement nulle dans le groupe en régimeans sodium (non présentés).

La glycémie est similaire dans les trois groupes alors que’insulinémie et l’HOMA index sont plus élevés en présence deructose. Toutefois, cette élévation est partiellement prévenueuand le chlorure de sodium est retiré de la nourriture fructose.

La pression carotidienne moyenne mesurée chez le rat vigil’est pas significativement modifiée par les manipulations ali-entaires.

.2. Morphologie cardiaque et vasculaire

Comme illustré sur la Fig. 1, la masse cardiaque et l’aire deection de la carotide sont plus importantes dans le groupe fruc-ose en apport standard de sodium comparé au groupe témoin. Enevanche, la suppression du sodium du régime fructose préviente remodelage cardiaque et vasculaire. Au niveau cardiaque,’effet de la restriction sodée est plus clair quand on envisagea relation entre la croissance pondérale et la masse cardiaque.omme illustré sur la Fig. 1, le régime fructose s’accompagne’une augmentation de la pente de la relation entre la masseardiaque et le poids corporel, qui est normalisée par le régime

ésodé. De plus, l’élévation du collagène cardiaque induit pare fructose est prévenue dans le régime fructose sans sodiumTableau 1).

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ire de section de l’artère carotide. * : p < 0,05 comparé au NS standard, † : < 0,05 comparé au NS fructose.

.3. Stress oxydant et expression cardiaque des gènes de’aldostérone

Aucune variation significative de l’expression de l’ARNme l’aldostérone synthétase ou de l’hydroxystéroïde déshydro-énase n’est retrouvée entre les trois groupes (Tableau 1).

L’intensité du marquage du DHE est plus marquée dans leroupe NSF que dans le groupe NSS. Le régime DSF normalisee paramètre du stress oxydant (Fig. 2).

. Discussion

Les résultats de la présente étude confirment l’induction parn régime enrichi en fructose d’une résistance à l’insuline avec

yperinsulinémie sans hyperglycémie chez le rat [4]. Cette insu-inorésistance s’accompagne d’une hypertrophie cardiaque etasculaire et d’une fibrose cardiaque, comme précédemment

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Tableau 1Influence du régime enrichi en fructose avec ou sans apport en sodium.

NS standard NS fructose DS fructose

Poids corporel (g) 463 ± 12 476 ± 18 451 ± 8PAM rat vigil (mmHg) 120 ± 4 125 ± 3 123 ± 5Glycémie à jeun (mg/dL) 118 ± 60 123 ± 30 109 ± 50Insulinémie à jeun (ng/mL) 1,23 ± 0,10 2,03 ± 0,30a 1,50 ± 0,23a,b

HOMA index 1,30 ± 0,21 2,61 ± 0,44a 1,82 ± 0,21a,b

Collagène (%) 1,5 ± 0,2 3,2 ± 0,7a 1,4 ± 0,1b

ARNm CYP11�2 (UA) 4,74 ± 2,73 4,99 ± 4,24 7,44 ± 3,06ARNm 11 �HSD2 (UA) 7,45 ± 1,70 12,52 ± 5,70 20,01 ± 12,02

NS : normosodé ; DS : désodé ; PAM : pression artérielle moyenne ; HOMA : Homeostasis Model Assessment.

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a p < 0,05 comparé au NS standard.b p < 0,05 comparé au NS fructose.

apporté [3]. L’observation principale de notre travail est la pré-ention des modifications cardiovasculaires quand le sodium estetiré de la nourriture fructose.

La réduction de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaque n’estas liée à la pression artérielle puisque celle-ci est similaire danses trois groupes expérimentaux. L’aldostérone a été impliquéeans le remodelage cardiaque dans diverses situations [16–18].omme suggéré ici par l’absence de variation de l’expressiones enzymes impliquées dans l’action de l’aldostérone, le miné-alocorticoïde ne semble participer ni à l’hypertrophie cardiaque

nduite par le fructose ni à l’effet bénéfique du régime sansodium. Ce dernier pourrait être, au moins en partie, dû à’amélioration de la sensibilité à l’insuline par un effet direct de la

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ig. 2. Influence des différents régimes sur le contenu myocardique en anion supeuorescence a été déterminée sur au moins dix coupes transverses du ventricule gauc

estriction sodée ou par la réduction de la masse adipeuse commebservé dans ce modèle [10]. Par ailleurs, une augmentationes récepteurs à l’insuline a été observée au niveau du musclequelettique et dans le tissu rénal quand le sodium est retiré dea nourriture standard mais cette stimulation disparaît dans leégime fructose [19]. La prévention de l’insulinorésistance para restriction sodée ne semble donc pas liée à une augmenta-ion des récepteurs à l’insuline dans ce modèle. De manière plusntéressante, la génération d’anion superoxyde, approchée iciar la fluorescence du DHE, augmente dans le régime fructose

ais pas si le sodium est absent de cette alimentation. Une telle

éduction du stress oxydant a été précédemment décrite dans’insulinorésistance au niveau plasmatique [4], cardiovasculaire

roxyde détecté par le marquage au dihydroéthidium (DHE). L’intensité de lahe. * : p < 0,05 comparé au NS standard, † : p < 0,05 comparé au NS fructose.

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20] et rénal [9,10] et dans l’hypertension artérielle [7]. Prisnsemble, ces résultats et ceux de la présente étude sont enaveur d’une implication du stress oxydant dans l’effet bénéfiquee la restriction sodée sur les atteintes de divers organes ciblesans la dysfonction métabolique à un stade précoce. Les effetsénéfiques de la restriction sodée sont vraisemblablement mul-ifactoriels avec une interaction entre insulinorésistance, stressxydant et inflammation dans laquelle le TNFα pourrait avoirn rôle important. En effet, cette cytokine est impliquée dans leéveloppement de l’hypertrophie cardiaque [21] et son inhibi-ion prévient la résistance à l’insuline induite par le fructose [22].l reste à démontrer au niveau cardiaque comme nous l’avonsécemment rapporté pour le rein [10] que la production de cyto-ines pro-inflammatoires est réduite par le régime désodé. Avecne baisse possible de l’inflammation, la diminution des espèceséactives de l’oxygène apparaît comme une cible majeure de’effet bénéfique de la restriction sodée et pourrait participer àa modulation de l’insulinorésistance [23] et des atteintes desrganes cibles dans ce modèle murin.

éclaration d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

emerciements

Ce travail a bénéficié d’un soutien de la Fondation deecherche sur l’hypertension artérielle et de la Société francaise’hypertension artérielle.

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