L'apport du laboratoire en vacclno/ogie

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i

Article

I' APPORT DU LABORATOIRE DANS LES ESSAIS CLINIQUES VACCINAUX

Emmanuel Vidor a,,, Denis Crevat b

R 6 s u m 6

Les essais cliniques vaccinaux sont de nature multiple et ont pour

objectif de g~n~rer les donn6es permettant de qualifier la tolerance

et I'efficacit~ de nouveaux vaccins ou de nouvelles modalit~s

d'utilisation de vaccins d~j& existants. Le laboratoire est impliqu~

tout au long de la c h i n e d'ex6cution de ces essais, soit en

participant & la selection des sujets destines & r enr61(}s dans

ces essais, soit en apportant des informations sur la tol6rance

biologique de la vaccination, soit enfin (et U s'agira I& d'une

contribution majeure et indispensable) en apportant des

informations sur I'effet pharmacodynamique princeps d'un vaccin

qui est d'induire une r~ponse immune. Dans certain cas, une

recherche d'agent infectieux compl~tera I'apport du laboratoire.

Les 6chantillons biologiques analys~s sont de nature diverse, mais

les s~rums repr~sentent la majorit6 de ceux-ci. La manipulation des

ces ~chantillons est soumise & des r~gles strictes et les techniques

mises en oeuvre sont diverses et ob~issent & des conditions d'ex~cution contraignantes afin de garantir la recevabilite des

r~sultats par les agences r~glementaires auxquelles ils sont soumis.

Les techniques d'exploration des r6ponses immunes & m6diation

cellulaires sont encore du domaine de la recherche et ne sont pas

encore utilis~es en routine. Un exemple de laboratoire central

d'immunologie clinique est d6crit dans un but de mise en

perspective.

Essai d i n i q u e - vaccin - laborato i re ,

a Sanofi Pasteur Campus M~rieux 1641, av. MarceI-M~rieux 69280 Marcy-I'l~toile

b Sanofi Pasteur Campus Connaught .Discovery Drive, Swiftwater, PA, 183"70-018'7 Etats-Unis

* Correspondance EmmanueI.Vidor@sanofipasteur.com

article re~J et accept6 le 31 mars 2006.

�9 Elsevier SAS.

S u m m a r y : R o l e o f t h e l a b o r a t o r y in v a c c i n e c l in ica l

t r i a l s

Vaccine clinical trials are of different nature, and their objectives are to generate the data in order to qualify the safety and to document the efficacy of new vaccines or new mode of use of already existing vaccines. The laboratory is a contributor all along the excecution of these trials, either during the subject selection phase, either by delivering data on the biological reactogenicity of the vaccination, and finally (and in that case it is its main role) by documenting the pharmacodynamic effect of the vaccine which is to induce an immune response in the vaccinees. In some instances, the identification of an infectious agent will complete the added value of the laboratory. Biological samples are of diverse nature, but sera represent the majority of them. They have to be handled under strict conditions, and the technics implemented are diverse and have to follow constraining rules in order to guaranty the acceptance of the results by regulatory authorities to which they are submitted. The technics aiming at describing cellular mediated immunity are still at a research stage, and are not yet routinely used. One example of a global clinical immunology laboratory is described for a perspective vision.

Clinical tr ial - vaccine - laboratory .

1. Qu'est ce qu'un essai clinique vaccinal ?

L es essais cliniques vaccinaux sont destines & gen6rer les donn~es prouvant qu'un nouveau vaccin en d~veloppement (ou qu'une nou-

velle association vaccinale (a) non encore document~e et donc non encore autoris6e) est bien to16r6 et efficace dans la pr6vention de la maladie cibl~e dans les diff6rentes populations, pour laquelle il est d6velopp~.

Contrairement aux vaccins v6t6rinaires pour lesquels I'efficacite peut 6tre directement d6montree par des 6tudes de vaccination/~preuve infectieuse (avec administration de I'agent pathog6ne chez deux groupes, vaccines ou non), I'efficacit6 des vaccins chez I'homme se documente le plus souvent au travers la d~monstration de leurs capa- cit6s & induire une r~ponse immunitaire dont on salt qu'elle est cor- r~l~e & I'existence d'une protection clinique. Dans un certain nombre

(a) Une association vaccinale est definie comme I'administration simulta- n~e de deux vaccins en deux sites d'administration s6par~s.

Revue Francophone des Laboratoires, avri12006, N = 381 4 7

L'apport du taboratoire en vaccinotogie

de maladies infectieuses, il a pu 6tre d6montr6 une relation entre une composante particuli~re de la r~ponse immune [qualitative : anticorps (isotypes ; circulants et/ou Iocaux) ; cellules B m~moire m~di~es par les lymphocytes T helpers ; fonctionnalit6 des cellules T et quantita- tive : titre en anticorps ; nombre et densit~ de cellules] et rexistence d'une protection vis-&-vis de I'agent infectieux consid6r~ [8]. Dans ce cas, on est dans la situation id6ale o0 I'on dispose d'un corr~lat irnmu- nologique (serologique ou non) de protection. L'utilisation de ce ~ sur- rogate marker - sera un moyen indirect de documenter refficacit6 du vaccin.

Dans les autres cas o0 I'existence d'un corr61at immunologique de pro- tection n'est pas connue (ou est discut6), seuls des essais cliniques avec une mesure d'incidence clinique (souvent confirm~e par un dia- gnostic microbiologique) dans les populations enr616es dans ressai clinique perrnettent de d6montrer I'existence d'une protection. Dans bien des cas, ces essais ont permis a posteriori de d~finir le (ou les) corr~lats immunologiques de protection en cornparant les profils de r6ponses immunes (s6rologiques) observes chez les sujets vaccines (avec le vaccin actif) et prot6g~s, de ceux observes chez les sujets vac- cin~s avec le vaccin contr61e ou le placebo et non prot6g6s [9]. Ces corr61ats de protection peuvent aussi ~tre ~tablis ou confirm~s a par- tir des donn6es des enqu~tes 6pid6miologiques (protection passive conf6r6e par les anticorps d'origine maternelle par exemple) ou des donn~es experirnentales obtenues avec des mod61es animaux perti- nents (vaccination/~preuve infectieuse, protection passive).

Cette notion de corr61at irnmunologique de protection est tr~s impor- tante en vaccinologie, car une fois 6tabli pour une infection donn6e, il sera utilis6 tout au long des essais cliniques contenant rantig~ne vac- cinal destin6 & pr6venir cette infection. En effet, du fait de I'extr~.me difficulte de conduire des essais vaccinaux avec mesure d'efficacit~ clinique (d61ai d'execution, coots, faisabilit6 6pid6miologique, 6thique .... ), ceux-ci ne sont gen6ralement pas reconduits une fois eta- blie la prerni6re d6rnonstration d'une efficacit~ clinique pertinente.

La grande rnajorite des essais cliniques r~alis6s avec les vaccins sont des essais ayant pour objectif de documenter la bonne tot6rance et rimmunog6nicit6 du produit sous investigation dans des protocoles experimentaux variables : essais descriptifs purs avec un groupe, essais randomis6s contre placebo, vaccin comparateur, etc.

Les essais cliniques de phase I sont g~n~ralement destines & quali- fier le produit en termes d'innocuit~ et de tolerance et ~. commencer & accumuler des donn6es d'immunog6nicit6 notamment dans le but de valider le concept du produit chez rhomme (peut-on induire une r~ponse immune qui semble avoir les caract6ristiques recherch~es ?).

Les essais cliniques de phase II permettent le plus souvent de justi- fier le choix d'un antig6ne (parmi plusieurs formulations d'un m~me anti- g~ne ou parmi plusieurs combinaisons diff6rentes d'une s~rie d'anti- g6nes), d'une dose antig~nique, d'une formulation vaccinale (nature et quantit~ d'adjuvant ... . ), d'un schema vaccinal optimal, d'une nou- velle voie d'administration, d'une combinabUit6 (absence d'interf6rence intra-produit), d'une ass0ciabilit~ (absence d'interf~rence inter-produit), etc.

Enfin, une fois ces reponses apportees, lesessais cliniques de phase III permettent d'accumuler des donn~es sur un grand nombre d'indivi- dus repr6sentant les populations cibles en 1) documentant & large ~chelle les futures associations vaccinales revendiqu~es en d~mon- trant rabsence d'interf6rences entre les vaccins co-administr~s, 2) documentant I'hornog~n6it6 des r~ponses immunes entre diff6rents lots de vaccin et 3) en accumulant des donn~es de tolerance sur le nombre requis d'individus afin de documenter avec suffisamment de pr6cision le profil de tolerance du produit.

De plus, Iorsqu'il n'existe pas de corr~lat immunologique (s~rologique) de protection reconnu, des essais de phase III ayant pour objectif de d~montrer I'efficacit~ clinique sont pratiqu~s.

2. Quelles sont les explorations biologiques mises en oeuvre ?

De nombreuses investigations biologiques peuvent ~tre mises en oeuvre tout au long des essais cliniques d'un vaccin.

2.1. Se lec t i on des sujets

Par nature, les vaccins sont des produits pharmaceutiques administr~s & des sujets sains (b) de tous &ges. Par consequent, ils s'administrent chez des sujets d6clar6s en bonne sant6, chez qui il est souvent et uniquement pratiqu6 un examen clinique avant vaccination, afin d'ex- clure I'existence d'une ou plusieurs contre-indications cliniques ~. cette vaccination. Celles-ci participent le plus souvent & la d~finition des crit~res d'exclusion a, I'enr61ement dans les essais vaccinaux. Pour certains essais cliniques, ces crit~res incluent I'exploration de para- rn6tres biologiques standards g6neraux (num6ration de la formule sanguine) ou plus sp6cifiques des organes cibles de I'infection natu- relle (fonction h~patique, renale, systeme immunitaire). Cette s61ec- tion peut aussi inclure un criblage s6rologique pr6alable pour iden- tifier des populations particuli6res (s6ropositifs ou s6ron~gatifs vis-~.-vis d'un agent ou d'un antig6ne donn6) ou exclure des sujets porteurs de certains virus (Hep B, HIV, ...) ou les femrnes enceintes (test de grossesse).

2.2. Exp lora t ion de la to le rance b i o l og i que

II est frequent Iors des essais cliniques de phase I (et notamment avec des produits de nature nouvelle) de documenter en plus de la tolerance clinique, la tol6rance biologique & la vaccination. Pour ce faire, des bilans biologiques standards mais souvent restreints sont pratiqu~s (numeration de la forrnule sanguine, transaminases h6patiques .... ) par- fois completes par la recherche de marqueurs d'inflammation non sp~- cifique, ou d'activation de certaines cascades biologiques.

2.3. Mesure de I ' immunogen ic i te des vacc ins

Dans la tr~s grande rnajorit6 des essais cliniques vaccinaux, la cible en ce qui concerne rimmunog6nicit6 des vaccins est constituee par la mesure des niveaux s~riques en anticorps (et souvent aussi de leur qualit~ fonctionnelle) dirig~s contre un ou plusieurs des antig~nes contenus dans le vaccin & I'~tude. Le principe est de doser & intervalle r6gulier ces anticorps. La plupart du temps, ces dosages interviennent sur des pr616vements effectu6s avant le d~but de la vaccination (g6n~- ralement le jour de I'administration de la premiere dose vaccinale pr~- vue par I'essai) et apr6s la fin de la vaccination (entre 3 et 4 semaines apres la derniere injection vaccinale pr~vue par le protocole). De plus, Iorsque I'objectif de I'essai est de documenter la persistance ~, long terme des anticorps, des pr~l~vements sont pratiqu~s & intervalle r~gu- lier (6, 9, 12, 24, 36 mois, etc.).

Dans certains cas, plus rares, des dosages d'immunoglobulines dans d'autres fluides biologiques peuvent 6tre amends & ~.tre pratiqu6s (salive, liquide nasal, selles, ...). Les modalit~s de dosage sont dans ce cas identiques & celles d~crites pr~c~demment.

La pratique de mesure d'autres effecteurs immunologiques (r6ponses immunes & m~diation cellulaires) sera abord~e plus loin et reste & I'heure actuelle encore peu r6pandue dans les essais vaccinaux.

(b) C'est pourquoi, d'un point de vue s6mantique, tout essai clinique vac- cinal (concernant un vaccin pr~ventif) se r6alise sur des = sujets - (et non des patients).

48 Revue Fran?aise des Laboratoires, avril 2006, N ~ 381

L'apport du laboratoire en vaccino/ogie Art ic le

2.4. Recherche de la presence d'un agent infectieux

Dans le cas des essais vaccinaux realises avec des vaccins vivants attenues (le plus souvent des virus), il est important de documenter le devenir et la diffusion de I'agent vaccinal chez I'individu vaccine : ~. quel niveau et dans quels tissus biologiques se replique I'agent vac- cinal ? Des prelCvements sont pratiqu~s dans les jours qui suivent la vaccination, generalement pour suivre la virCmie ou la replication virale dans un organe cible awes vaccination parenterale (ex. : virus des oreillons dans la salive), ou dans les selles awes vaccination orale (ex. : poliovirus). Dans les essais cliniques oe I'objectif principal est une mesure d'efficacitr clinique (et oe la definition des cas cliniques fait appel & la confirmation de I'infection par diagnostic direct), la detec- tion d'agent infectieux dans les fluides biologiques appropries est pra- tiqu~e chez le sujet participant ~. I'essai.

Les techniques utilisees font frequemment appel & la biologie mold- culaire (technique PCR) et aux techniques de culture des microor- ganismes (par exemple culture virale sur un support cellulaire sensible pour isolement, quantification et/ou identification serotypique, ...).

3. Quels sont les dchantillons biologiques collectds dans les essais cliniques vaccinaux ?

3.1. Nature des pre levements

La majorite des ~chantillons destines & mesurer la presence d'anticorps IgG/M est represent~e par du sang total & partir duquel le serum est prepare afin de realiser les dosages serologiques ou les mesures de paramCtres biologiques.

Dans certains cas, des ~chantillons de salive, d'ecouvillonnage (nasal ou pharynge), ou des prdlevements de selles peuvent r pratiquds afin de rr des dosages d'anticorps de type IgA dans le but de mesurer I'existence de reponses immune locales. De plus, des pre- levements tissulaires divers peuvent ~tre pratiques ~ des fins dia- gnostiques afin de detecter la presence (et/ou d'isoler) un germe (virus, bacterie, parasite) ou pour suivre le devenir d'un microorganisme vac- cinal vivant attenue.

3.2. Preparation, conservat ion des prelevements

II est necessaire de suivre les rr tres strictes precisees dans le protocole de I'essai clinique, pour les modalitCs de prelevement, de preparation et de conservation des echantillons biologiques. La qua ~ lite des rdsultats des tests mis en oeuvre en depend.

Pour les tests immunologiques sur serum, un prelevement sur tube sec est recommande, de preference sans surfactant ni gel sCparateur de serum qui pourrait relarguer des composants interferents ou induire une desorption des immunoglobulines au cours de certains tests [2]. II dolt Ctre de preference realise chez des sujets ~ jeun, les lipides inter- ferant dans les tests biologiques et immunologiques. Toutefois, cette condition est difficile & satisfaire en pratique pour les essais vaccinaux chez les nourrissons ou les jeunes enfants.

Awes coagulation et centrifugation douce, le serum est collecte et reparti en tube soigneusement identifi6, sous un volume adequat pour les tests & mettre en oeuvre, et le volume residuel conserve comme echantillon de reserve (tube de retention). Cette etape de preparation dolt Otre realisee avec le plus grand soin, prelr par prelevement pour r de melanger les echantillons provenant de sujets differents ; rapidement aprr collecte du serum pour eviter I'hemolyse ; et dans des conditions stCriles (sous hotte & flux laminaire) pour r toute contamination du serum.

Pour les echantillons de salive, il est possible de stimuler la salivation avec le systeme de la salivette.

Tousles pr~l~vements doivent 6tre imm~diatement congeles, g~n~- ralement ~ - 20 ~ sauf les prel~vements destinds & un diagnostic viro- Iogique qui peuvent requdrir une conservation & basse temperature (- 70 ~ pour ~viter toute d~gradation du materiel viral. II faut garan- tir la chatne du froid depuis le site investigateur (pdriode de stockage temporaire) jusqu'au laboratoire en charge des analyses (expedition, stockage final) et garder tousles enregistrements appropries. Afin de limiter les risques lids & une dventuelle rupture de chaine du froid affec- tant les transferts, le tube de retention est en general transmis au labo- ratoire par envoi s~pard.

Apr~s analyses, le volume de serum residuel (tube de retention) est conserve dans les conditions ad~quates, pour parer & toute deman- de d'analyse complementaire requise par les autorites de sante. Conserver les echantillons biologiques collectes au cours d'un essai clinique est une obligation et la duree est variable en fonction des pays consideres (ex. : la Food and Drug Administration impose de les conserver au minimum 5 ans apres la date d'enregistrement du pro- duit aux I~tats-Unis).

3.3. Volume de I 'echanti l lon b io log ique

Les essais cliniques reatises chez les nourrissons en premiere annee de vie repr~sentent encore la majorit6 des essais cliniques vaccinaux. La plupart du temps, ces essais concernent des vaccins multivalents (c) de plus en plus souvent co-administres (jusqu'& quatre administrations simultan6es en des sites s~pares) avec d'autres vaccins eux aussi mul- tivalents. De ce fait, sur chaque prelevement sanguin, il pourra ~tre pra- tique jusqu'& 20 determinations differentes d'anticorps, n~cessitant par consequent un volume de serum qui peut aller jusqu'~. 2 ~. 3 ml. On imagine aisement la difficulte technique d'obtenir un prel~vement sanguin d'un tel volume chez un nourrisson de 2 mois, voire moins (6 semaines), Age or3 est generalement initie le demarrage des immu- nisations pddiatriques. Cette contrainte est aussi de plus en plus fid- quemment rencontr~e dans les essais vaccinaux pratiques chez les jeunes enfants, adolescents et adultes du fait d'un calendrier vacci- nal s'enrichissant de plus en plus des nouvelles vaccinations recom- mandees en routine. La miniaturisation des tests et la mise en oeuvre de nouvelles technologies apportent des solutions & ce probl~me.

4. Quels sont les dosages s~rologiques mis en oeuvre ?

4.1. Types de techniques

Deux grandes categories de techniques sont utilisr pour mesurer la r~ponse vaccinale humorale : les m6thodes immunochimiques ou immunoenzymatiques et les tests fonctionnels.

Les mCthodes immunoenzymatiques de dosage des immunoglobulines totales (ou de certaines sous-classes d'immunoglobulines) ont, pour la plupart des antigr vaccinaux, remplace les techniques radio-

(c) La notion de vaccin multivalent regroupe plusieurs concepts : pre- mi~rement des vaccins prot~geant contre plusieurs infections (un exemple est repr6sente par le vaccin p~diatrique pentavalent diphth~rique, t6ta- nique, coquelucheux acellulaire, poliomy~litique, et polysaccharidique conjugu~ contre les infections dues & Haemophilus influenzae type b), soit deuxi~mement & des vaccins (ou & une valence antigenique) protd- geant contre un seul type d'infection mais contenant plusieurs antig6nes correspondant & plusieurs s6rotypes/s~rogroupes de I'agent infectieux en question (des exemples sont repr~sent~s par le vaccin p~diatrique hep- tavalent pneumococcique polysaccharidique conjugu6 (qui contient des antig6nes provenant de 7 s6rotypes diff6rents de S. pneumoniae), ou le vaccin anti-grippal).

Revue Fransaise des Laboratoires, avri12006, N" 381 4 9

L'apport du laboratoire en vaccinologie

immunologiques, trop contraignantes du fait de la manipulation des radio61~ments. Elles pr6sentent I'avantage majeur de leur simplicit6 de mise en oeuvre et des possibilit~s d'automatisation, et sont, de ce fait, bien adapt~es aux dosages sur de grandes s~ries d'6chantillons bio- Iogiques. Ces techniques sont 6galement souvent reconnues par les autorit6s de sant~ publique, du fait de I'existence d'une d~monstra- tion de corr61ation avec des tests fonctionnels (in vitro ou in vivo).

Certaines technologies nouvelles commencent & ~tre appliqu~es dans le contexte du d~veloppement des vaccins, par exemple la technolo- gie Luminex qui permet le dosage simultan6 d'anticorps diriges contre plusieurs s~rotypes de m~ningocoques ou de pneumocoques, ou contre differents antigenes de Bordetella pertussis.

Les tests fonctionnels mesurent la sous-population d'anticorps capa- bles d'induire une activit~ protectrice in vitro, g~n~ralement corr~l~e avec une protection in vivo. IIs sont bas~s sur des principes tr6s varies d'action de ces anticorps, dont voici quelques exemples : capacit6 & inhiber I'h~magglutination virale (ex. : IHA avec le virus grippal), & neu- traliser des toxines bact~riennes (ex. : sOroneutralisation de la toxine dipht6rique), & neutraliser I'infection virale d'un tapis de cellules sen- sibles (ex. : seroneutralisation du poliovirus ou du virus de la fi6vre jaune), induction de la lyse bact6rienne d~pendante ou non du com- pigment et de cellules effectrices (ex. : test de bact~ricidie des m~nin- gocoques, ou d'opsonophagocytose des pneumocoques).

4.2. C o n d i t i o n s de m ise en o~uvre d e s d o s a g e s

Quelle que soit la nature du test, celui-ci dolt ~tre r~alis~ dane lee condi- tions requises pour g~n~rer des donn6es acceptables par les auto- rit6s de sant6, dans le cadre d'une soumission r~glementaire (dossier en rue de I'enregistrement du produit-vaccin). Le test dolt suivre les recommandations de standardisation, dolt 6tre pr6alablement valid~, et mis en oeuvre en conformite avec lee r~f~rentiels d'assurance de la qualitd.

Dans de tr~s nombreux cas, il a ~t~ mis en place des r6seaux de labo- ratoire afin de d6velopper les moyens de standardiser un certain nombre de tests s6rologiques utilis~s dane lee essais cliniques vac- cinaux. Un exemple est repr~sentd par le R~seau europ~en de sero- 6pid6miologie (ESEN) mis en place en 1996 [7], qui a d~j~. apport~ sa contribution dane plusieurs tests [1,4].

UOrganisation mondiale de la Sant~ (OMS) et le National institute for biologicals standardization and controls (NIBSC) apportent leur sup- port soit pour la preparation de documents techniques visant ~. stan- dardiser les tests et soit pour la s61ection/validation des s~rums de r~f~- rence [1 1]. Lorsqu'il existe une r6f~rence internationale reconnue, les titres anticorps sont rapport~s id6alement en unit~s internationales. Dans le cas contraire, lee titres sont rendus en unit6 arbitraire (d~pen- dant alors de chaque laboratoire). C'est ainsi que dane la plupart des tests mesurant une activit6 biologique mddi6e par les anticorps, les titres sont rapport6s en inverse de dilution.

Disposer d'une technique analytique standardis~e et d'un serum ~ta- Ion sont les conditions id~ales pr~-requises pour permettre 1 ) de corn- parer les donn~es g~n6r~es par diff6rents laboratoires pour diff6rents vaccins, et 2) de comparer lee donn~es s~rotogiques gen t r ies lore des differents essais cliniques tout au long du d~veloppement du vac- cin pour un laboratoire donn6.

La standardisation pr~alable d'un test est 6galement critique dans I'ob- jectif de d6finir un corr61at de protection solide.

Avant son utilisation pour 6valuer la r6ponse immune humorale dane le contexte du d~veloppement clinique d'un vaccin (et au plus tard avant lee 6tudes de phase III), les performances du test doivent avoir 6t~ ~valu6es et estim~es acceptables darts le contexte d'utilisation cibl6. Pour chaque param~tre ~tudi6, un ou des crit~res d'acceptation sont propos6s dans un protocole de validation, 6tablis ~ I'aide de don-

nees d'~valuation pr~liminaire (qualification de la technique). La vali- dation d'un test s~rologique quantitatif s'intdresse aux param~tres sui- vants [3, 5] : - I'exactitude : capacit~ du test ~. g~n6rer une r6ponse requi~rant une r~f~rence internationale, ou une m6thode de ref6rence pour ~tablir un titre conventionnel en anticorps & comparer avec le titre observ~ ; - la precision de la mesure (intra- et inter-test) : capacit~ du test ~ g~n~- rer une r~ponse la moins variable possible. Param~tre pour lequel des performances sont classiquement requises (ex. : coefficient de varia- tion inf~rieur & 20 % pour les tests immunochimiques) ; - la sp~cificit~ du test, avec des 6preuves de neutralisation du serum avec divers antig~nes homologues ou h~terologues ; - la lin~aritd de la r~ponse : capacit~ du test ~ g~n~rer une r~ponse proportionnelle au titre/concentration en anticorps ; - la limite de d~tection : concentration en anticorps minimale donnant une rdponse d~tectable par rapport au bruit de fond du test ; - lee limites de quantification haute et basse : concentrations en anti- corps maximale et minimale pouvant ~tre quantifi6es avec precision et exactitude ; - la robustesse de la technique : impact sur la r6ponse de diff6rents lots de r~actifs, de variations des temps d'incubation . . . . - I'absence d'interf~rence de certains composants de la matrice serique (lipides, hemoglobine, bilirubine . . . . ) et la stabilit~ des anticorps doivent ~tre ~valu~e.

I 'ensemble de ces donn6es de validation est document6 dans un dos- sier de validation, partie int~grante du dossier de soumission en vue de I'enregistrement du produit-vaccin.

Si les performances du test doivent ~tre initialement ~tablies, elles doi- vent ~galement ~tre suivies et document~es tout au long de I'ex~cu- tion d'un programme de ddvetoppement clinique. Des contr61es internes de qualite, generalement constitues par des panels de 10- 20 s6rums test~s reguli~rement, permettent d'~tablir des cartes de contr61e et de r~aliser des analyses de tendance, pour identifier/pr~- venir toute d~rive inacceptable des performances du test. Des contr~les compl~mentaires, propres ~ chaque technologie mise en oeuvre, sont egalement realises pour garantir la concentration de virus ou de toxine d'~preuve employee dans le test, pour s'assurer de I'ab- sence de facteur interf~rant dans chaque ~chantillon biologique teste, pour ~valuer la coherence de deux titres Iorsque le protocole requiert deux titrages ind~pendants pour chaque ~chantillon.

La non-conformit~ d'un de ces contrbles entraine I'invalidation du test, ou du r~sultat de I'~chantillon ; ainsi jusqu'& 25 % des ~chantillons peu- vent ~tre retest~s dans le cadre des programmes de routine de vali- dation technique du test.

Dane certain cas, une procedure dite de = validation biologique ~ des r~sultats (identification de s~rums pr~sentant un titre anormalement ~lev~ ou faible, ou discordant par rapport au protocole clinique) peut ~tre mise en oeuvre et donner lieu & des retests d'~chantillons.

Toute modification du protocole d'exdcution, ou tout changement de reactif ou de I'environnement du test doivent ~tre evalues. Si une tech- nique dolt ~tre mise en oeuvre dans deux laboratoires diff~rents, et que la technique est dOj& op~rationnelle dans Pun des deux, un transfert formel d'un laboratoire & I'autre est recommand~ pour s'assurer et documenter que les performances sont identiques dans I'environne- ment sp~ciflque de chaque laboratoire (donc lee r~sultats s~rologiques g~n~r~s comparables). Si la technique est ddj~ disponible dans les deux laboratoires, une ~tude de concordance sera r~alis~e avec le m(~me objectif.

Enfin, le test dolt ~tre mis en oeuvre dans un laboratoire a minima conforme aux exigences des bonnes pratiques de laboratoire, et de preference dans un environnement qualit~ conforme aux exigences des laboratoires d'essai, disposant d'un syst~me d'assurance de la qua- lit~ [6].

50 Revue Fran?aise des Laboratoires, avri12006, N ~ 381

Dossier scientifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H ,H , , , , , H , ,

L'apport du laboratoire en vaccinolog~e Art ic le

Dans ce contexte, les donn6es g6n~r~es par le laboratoire (non seu- lement les r6sultats des tests) mais aussi tousles documents et don- nees relatifs & la validation de la m~thode analytique, ~ la qualification des techniciens en charge du travail, & la qualification des equipements et mat6riels, aux r~actifs et contr61es utilis6s, et 6galement leur main- tenance et gestion, devront ~.tre conserv(~s au moins deux ann~es apr~s la derni~re raise sur le marche du produit [6].

4.3. Paramet res ut i l ises pour decr i re les reponses an t i co rps

Quelle que soit la technique utilis~e pour doser une population d'an- ticorps, tes r~sultats obtenus g~n~ralement sur un grand nombre d'in- dividus (jusqu'& 500 par groupe pour certains essais de phase III) sont d6crits en calculant plusieurs param~tres.

Le param6tre le plus fr~quemment utilis~ est le calcul de la moyenne g6om~trique des titres en anticorps (MGT) permettant ainsi d'utiliser les principales techniques statistiques de base pour analyser les r6sul- tats.

Ce param~tre est toujours complet6 par le calcul du pourcentage de sujets ayant d~velopp~ un titre au-dessus d'un seuil 6tabli - ou consi- d~r~ - comme protecteur (taux de s~roprotection), et/ou d'un seuil donn~. Parfois ce parametre sera remplac6 par le calcul du pour- centage de sujets ayant multipli~ leur taux d'anticorps entre deux pre- I~vements (g~n~ralement pre-vaccination et post-vaccination) par un facteur pr~-6tabli (g6nOralement 2 ou 4) (taux de seroconversion).

Enfin, la construction et I'~dition de figures repr6sentant les courbes de distribution cumul~e inverse des titres en anticorps pour les dif- ferents groupes de sujets & 1'6tude et en fonction des diff~rents temps de pr~l~vements sont gen6ralement pratiqu~es.

5. Perspectives futures : le r01e du suivi des r ponses immunes

mediation cellulaires dans les essais cliniques vaccinaux

Diff6rentes techniques de mesure sont dej& aujourd'hui utilis~es pour documenter la r6ponse immune cellulaire : tests de lymphoprolif6ra- tion ou de cytotoxicit~; dosage immunoenzymatique des cytokines darts le s~rum, ou dans le surnageant de culture de lymphocytes des sujets vaccin6s apres stimulation avec I'antig~ne vaccinal ou I'agent patho- g~ne, ou encore avec des peptides synth~tiques simulant des 6pitopes T connus ; techniques de numeration des lymphocytes producteurs de cytokines (Elispot) [10].

U~tude de I'activation de I'expression de certains g6nes (et/ou la repression de certains autres) par technique PCR ou par analyse des ARN messagers sur bio puces, commence & voir quelques applica- tions, notamment dans le domaine des vaccins th~rapeutiques (ex. : stimulation du systeme immunitaire en canc6rologie).

La mise en oeuvre de ces techniques est cependant brid~e par de nom- breuses contraintes dont les plus importantes sont 1 ) la qualit~ et la fraicheur des pr~l~vements sanguins, 2) la qualit6 de la procedure d'ex- traction des cellules immunocomp6tentes, 3) & I'absence de stan- dardisation, 4) ~. la variabilit~ de la qualite des antig~nes utilises dans les tests de stimulation cellulaire et 5) ~ la haute technicit~ requise pour manipuler ces 6chantillons.

Les difficult6s dans I'interpr~tation des r~sultats sont aussi nom- breuses. Elles sont repr~sent~es par 1 ) le nombre g~n~ralement limit~ d'6chantillons (et donc de points de mesure disponibles pour un m~me sujet), 2) la faible connaissance de la variabilit~ naturelle des rdponses individuelles chez des sujets sains (variabilit~ intrins~que individuelle),

3) la forte variabilit~ des r~ponses inter-individuelle, 4) I'absence de corr~lat de protection (voire de connaissance scientffique approfon- die du r61e des effecteurs de la r~ponse immune cetlulaire dans la pro- tection vis-~.-vis d'un agent pathog6ne donn~).

Uensemble de ces facteurs fait que ces techniques sont pour le moment utilis~es principalement dans les essais de phase I impliquant un nombre restreint de sujets, et pour lesquels les param~tres mesu- r~s sont le plus souvent utilis6s pour r~pondre & des objectifs secon- daires voire tertiaires (purement descriptifs) dans ces ~tudes.

6. Un exemple de laboratoire impliqud dans des essais vaccinaux

L e laboratoire central d'immunologie clinique de Sanofi Pasteur (Global clinical immunology or GCI US) a ~t~ mis en place il y a

quelques annees et assure le traitement des echantillons biologiques et les dosages routiniers g~n~r~s dans le cadre des essais cliniques vaccinaux de Sanofi Pasteur.

Ce laboratoire est ~quipe pour pratiquer I'ensemble des tests s~rolo- giques (techniques immunochimiques et tests fonctionnels) et comporte des laboratoires de niveau de confinement allant de 1 & 3, pour r~pondre aux exigences de la manipulation de diff~rents agents pathog6nes.

Actuellement, plus d'une trentaine de tests y sont op~rationnels dans I'environnement qualite et securit6 requis pour soutenir les d~velop- pements cliniques.

Outre les dosages de routine, une des missions importante de ce labo- ratoire est de mettre au point, qualifier et valider les methodes analy- tiques s6rologiques (voire I'application de nouvelles technologies de pointe) requises dans le contexte du developpement de nouveaux vac- cins, et de s'assurer de leur acceptation par les autorites de sant6.

Du fait que plusieurs dizaines de nouveaux essais cliniques sont initi6s chaque annie par Sanofi Pasteur mobilisant plusieurs dizaines de mil- liers de sujets, chacun d'eux pouvant g6nerer de deux & cinq preleve- ments sanguins sur lesquels jusqu'& vingt d~terminations s~rologiques seront pratiqu~es, il est facile d'imaginer que I'organisation et la ges- tion des activites sont les param6tres cl6s de succ~s du laboratoire.

Deux plates-formes se partagent les activit6s techniques de dosage, et le developpement et la validation des tests. Deux fonctions trans- versales leur apportent leur support.

�9 Une fonction = Clualit~ et op6rations - qui comporte : 1 ) une unit~ d~di6e aux activites amont (reception et gestion des ~chantillons cli- niques) en interface avec le departement, Operations cliniques - ; 2) une unit6 pour les activites aval (pr6paration des fichiers de donnees ~. exporter vers le d6partement, Management des donnees et statis- tiques -). Un groupe - Bio statistiques - est en charge de I'analyse des donn~es g~n~r~es soit Iors des tests de routine (validations technique et biologique), soit dans le contexte de la qualification/validation des m~thodes analytiques ; 3) une unit6 d~di~e & la gestion de la qualite et de la documentation.

�9 Une fonction ,, Support aux projets de developpement de vaccin - regroupe un ensemble de collaborateurs qui assurent I'interface entre le laboratoire d'immunologie clinique et les ~quipes projets et/ou les 6quipes de d~veloppement clinique. La gestion de rensemble des acti- vites (planification) est confiee & du personnel dedi~, soutenu par un syst~me informatique de gestion du laboratoire.

Remerciements pr~cieuse & Les auteurs remercient Bernard Cornet pour son aide a f na sation de ce manuscrit.

Revue Franqaise des Laboratoires, avril 2006, N a 381 5 1

L'apport du laboratoire en vaccino/ogie

[1] Andrews N., Pebody FEG., Berbers G., and al.,

industry perspective, J. Pharm. Biomed. Anal. 21 (2000) 1249.12731 [4] Giammanco A., Chiarini A., Maple P,A.C. and al., European sero-epidemiology network: atandardisa- tion of the assay results far pertussis, Vaccine 22

induced by vaccination, Pediatr. infect. Dis. J. 20 (2001) 6S-~5. [9] Siber G.R., Methods for estimating serological co.elates of protection, in: Brown F., Greco D., Mastrantonio R, Salrnaso S., Wassitak S. (Eds),

[2] Bo~bh R., Chan Y., Ruddel M. and al.,

factant Silwet L-720, Clin. Chem. 51 (2005) 1874- 1882. [3] Findlay J., Smith W., Lee J. and aL, Validation of imrnuncessays for bioanalysis: a pharmaceutical

1908. [6] Guide de bonne ex6cution des analyses de bio- logic m6dicale, J.O. 1 ? (1994) 172-193. ment of tFN-g production by ELISA, EUSPOT, flow [?] Osborne K., Weinburg J~, Miger E, The European cytornetry and real-time PCR, J. Immunol. Methods sero-epidemiology network Eurosurveiltance 2 305 (2006) 188-19•. (1997)29-31. [11] The k~nmurm, logical basis for immunization, [8] Rotkin S.A., Immunologic correlates of protection ~ + f o r WHO/ER 1993. WHOIER/GEN193.3.

52 Revue Fran~aise des Laboratoires, avd12006, N ~ 381