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Les contrbles microbiologiques de I'environnement hospitalier P. HARTEMANN, M.-E BLECH et L. SIMON * Rf=SUM~ = La mise en place d'une surveillance microbiologique de l'environnement hospitalier par un laboratoire ou une autre unit~ sp~cialis~e en biologie appliqu~e ~ l'hygi~ne hospitali~re est une activit~ dont le volume d'actes est tr~s variable selon les ~quipes. Les limites m~thodologiques li~es ~ la difficult~ de r~ali- ser des pr~l@vements et des analyses representatives de la r~alit~ de la contamination de l'environnement ne sont malheureusement pas toujours connues et la simple transposition des m~thodes de biologie clinique (~cou- villons et milieux de culture) induit des biais tr~s impor- tants. C'est pourquoi les contr61es microbiologiques de l'envi- ronnement hospitalier doivent ~tre r~alis~s par une ~quipe form~e et dot~e de moyens ad~quats, lls doivent reposer en priorit~ sur une analyse des risques et des points critiques pour leur maftrise (syst~me HACCP en anglais) pour un suivi des mesures preventives. Par ailleurs, ils permettent de prouver l'efficacit~ des proce- dures sous r~serve d'une strat~gie d'~chantillonnage et de m~thodes analytiques adapt~es. MOTS-CLf=S environnement - h6pital - surveillance microbiologique - pr~l~vements de surface - m~thodes analytiques. SUMMARY The organization of a microbiological survey of the hospi- tal environment made by a laboratory or an unit speciali- zed in applied biology for hospital hygiene is a very variable activity according to different teams around the world. The methodological limits due to the difficult realization of sampling and analysis really representative of the envi- ronmental contamination are not sufficiently known. The simple transposition of clinical biology methodology (swabs, culture media for example) may induce very important bias. Thus microbiological controls of the hospital environ- ment have to be done by a skilled team using adequates methods. These controls have to be considered in the scope of Hazard Analysis Critical Control Point System for the follow up of preventive measures. They also allow to prove the efficacy of procedures if both sampling stra- tegy and analytical methods are adequate. KEY-WORDS environment - hospital - microbiological survey - surface sampling - analytical methods. Introduction La part des infections nosocomiales li~es ~ une conta- mination d'origine environnementale est difficile appr~cier. Tr~s variable selon les auteurs (6, 7), ce pourcentage refl~te plus probablement les mauvaises habitudes de travail de certains personnels pour les- quels la notion de respect de protocoles de soins semble tr~s imparfaite, ainsi que le terrain immuni- taire des patients, puisque une augmentation de ia prevalence de patients atteints de pathologies lourdes ne peut qu'accro~tre le risque d'infection nosocomiale germes opportunistes environnementaux. De nombreux auteurs se sont donc d~j~ interrog~s sur l'int~r~t d'une surveillance microbiologique de * Service d'hygi~ne hospitali~re CHU de Nancy - HOpitaux de Brabois Rue du Morvan 54511 VANDQ~UVRE CEDEX TIRE.S A PART : M. le Pr P. HARTEMANN article regu le 2 septembre 1996, accept~ le 20 janvier 1997. Revue franqaise des laboratoires, mars 1997, N ° 291 43

Les contrôles microbiologiques de l'environnement hospitalier

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Les contrbles microbiologiques de I'environnement hospitalier

P. H A R T E M A N N , M . - E B L E C H e t L. S I M O N *

Rf=SUM~ =

La mise en place d 'une surveillance microbiologique de l 'environnement hospitalier par un laboratoire ou une autre unit~ sp~cialis~e en biologie appliqu~e ~ l'hygi~ne hospitali~re est une activit~ dont le volume d'actes est tr~s variable selon les ~quipes.

Les limites m~thodologiques li~es ~ la difficult~ de r~ali- ser des pr~l@vements et des analyses representatives de la r~alit~ de la contamination de l 'environnement ne sont malheureusement pas toujours connues et la simple transposition des m~thodes de biologie clinique (~cou- villons et milieux de culture) induit des biais tr~s impor- tants.

C'est pourquoi les contr61es microbiologiques de l'envi- ronnement hospitalier doivent ~tre r~alis~s par une ~quipe form~e et dot~e de moyens ad~quats, lls doivent reposer en priorit~ sur une analyse des risques et des points critiques pour leur maftrise (syst~me H A C C P en anglais) pour un suivi des mesures preventives. Par ailleurs, ils permet ten t de prouver l'efficacit~ des proce- dures sous r~serve d 'une strat~gie d'~chantillonnage et de m~thodes analytiques adapt~es.

MOTS-CLf=S

environnement - h6pital - surveillance microbiologique - pr~l~vements de surface - m~thodes analytiques.

SUMMARY

The organization of a microbiological survey of the hospi- tal environment made by a laboratory or an unit speciali- zed in applied biology for hospital hygiene is a very variable activity according to different teams around the world. The methodological limits due to the difficult realization of sampling and analysis really representative o f the envi- ronmental contamination are not sufficiently known. The simple transposition of clinical biology methodology (swabs, culture media for example) may induce very important bias. Thus microbiological controls o f the hospital environ- men t have to be done by a skilled team using adequates methods. These controls have to be considered in the scope of Hazard Analysis Critical Control Point System for the follow up of preventive measures. They also allow to prove the efficacy of procedures if both sampling stra- tegy and analytical methods are adequate.

KEY-WORDS

environment - hospital - microbiological survey - surface sampling - analytical methods.

Introduction

La part des infections nosocomiales li~es ~ une conta- mination d'origine environnementale est difficile appr~cier. Tr~s variable selon les auteurs (6, 7), ce pourcentage refl~te plus probablement les mauvaises habitudes de travail de certains personnels pour les- quels la notion de respect de protocoles de soins semble tr~s imparfaite, ainsi que le terrain immuni- taire des patients, puisque une augmentation de ia prevalence de patients atteints de pathologies lourdes

ne peut qu'accro~tre le risque d'infection nosocomiale germes opportunistes environnementaux.

De nombreux auteurs se sont donc d~j~ interrog~s sur l'int~r~t d'une surveillance microbiologique de

* Service d'hygi~ne hospitali~re CHU de Nancy - HOpitaux de Brabois Rue du Morvan 54511 VANDQ~UVRE CEDEX

TIRE.S A PART : M. le Pr P. HARTEMANN

article regu le 2 septembre 1996, accept~ le 20 janvier 1997.

Revue franqaise des laboratoires, mars 1997, N ° 291 43

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l 'environnement hospitalier (1, 2, 3). Une telle acti- vit~ est cofiteuse en main d'oeuvre pour effectuer les pr~l~vements et les analyses ainsi qu'en materiel et produits, la strat~gie d'~cbantillonnage n'est pas ~vi- dente et fortement discutable. Les r~sultats parfois difficiles ~ interpreter car le germe isol~ de l 'environ- nement est-il l 'origine ou le reflet de l ' infection constat~e chez le patient ? 11 n'est possible de donner une r~ponse valable ~ cette question que si l 'on dis- pose d'une s&rie de r~sultats dans le temps permet- tant d'affirmer l 'ant~riorit~ de la presence du germe dans l 'environnement par rapport ~ l'entr~e du patient. Cette situation est rare car, sauf ~ r~aliser des pr~l~vements it~ratifs et donc disposer de moyens tr~s importants, les "instantan~s" fournis par des pr~l~vements al~atoires ne pourront donner au mieux qu'une id le du niveau de contamination. Dans un article r~cent (4), l '~quipe du Centre hospita- lier de Montfermeil (CHG de 4 0 0 lits) pr~sente l 'acti- vit~ du Laboratoire d'hygi~ne pour un budget de l 'ordre de 3 0 0 000 francs (salaires non compris), toutes activit~s confondues (environnement, st~rilisa- tion, etc.). Notre ~quipe, dont l'anciennet~ est sup~rieure ~ vingt ans pour I'activit~ de iaboratoire, utilise sur les m~mes bases de calcul un budget de l 'ordre de 130 000 francs pour un CHU de 2 5 0 0 lits. 11 est clair que les strategies different assez fondamentalement et rien ne permet d'aff irmer od est la v4rit~. Dans un cas, des pr~l~vements environnementaux sont r~ali- s~s syst~matiquement darts tousles services avec une fr~quence d'au moins une fois par an ; dans l 'autre, les contr61es ne visent que les points critiques ou sont utilis~s dans des enqu~tes ~ vis~e ~pid~miologique ou op~rationnelle. A Montfermeil, on contr61e la r~animation mensuelle- ment, les chambres de malades (sept ~ neuf pr~l~ve- ments dans la saUe de bains : siphon, lavabo, cuvette de toilettes, poign~e de chasse d'eau, etc.), les blocs op~ratoires, etc. ; ~ Nancy, nous n'avons jamais envi- sag~ ce type de surveillance.., qui d'ailleurs n~cessite- rait une ~quipe et des moyens tr~s importants pour un int~r~t qui ne nous apparalt pas ~vident, bien que biologistes. Dans les deux cas, ces attitudes ont ~t~ prises & la demande du Comit~ de lutte contre les infections nosocomiales (CLIN) qui joue un r~le d~ci- sif dans la d~flnition des activit~s de surveillance et de prevention des complications infectieuses, dont de toute ~vidence les membres n'ont pas la m@me approche. Dans cet article, nous envisagerons successivement le type de surveillance de l 'environnement que nous estimons utile de pratiquer et sa place au sein du laboratoire de biologie du service d'hygi~ne hospita- li~re puis les raisons scientifiques et les interroga- tions pos~es par le contr~le microbiologique de l'envi- ronnement en essayant de montrer son int~r~t mais aussi ses limites.

1. Activit du laboratoire de biologie appliqu e I'hygi ne hospitali re

au CHU de Nancy

Pour des raisons de moyens humains et mat4riels limit,s, nous avons fix~ le nombre d'analyses & effectuer annuellement environ 13 000, soit une moyenne mensuelle de l'ordre de 1 100. Dans ce cadre g~n6ral, nous avons 6galement d~cid~ d'affecter les deux tiers de ces analyses & des activit6s dites de "routine", soit environ 8 500 par an pour garder pour le tiers restant, soit environ 4 500-5 000, la totale ma~trise des indi- cations pour pouvoir r6aliser des 6tudes et des enqu~tes.

Parmi les analyses de "routine", nous distinguons : - le contr61e du personnel : coprocultures, pr41~vements de gorge et de nez du personnel des cuisines et de certains per- sonnels particuliers (en collaboration avec le Service de m~de- cine du travail), environ 300 annuellement ; - les contr61es de st~rilisation et de d4sinfection : 4rude de charge initiale, contr61es de st6rilit4, etc. (en collaboration avec le pharmacien responsable), environ 1 200-1 500 ; - le contr61e de qualit~ microbiologique des aliments : produits bruts et finis, aliments sondes, etc. (en collaboration avec les responsables des cuisines et les di~t~ticiennes), environ 1 200 ; - le contr61e des eaux : eaux de dialyse, eaux filtr6es, eaux pour la boisson et fontaines r4frig~rantes, etc., environ 4 000 ; - le contr61e de l'air : contr61e des ambiances aseptiques (blocs op~ratoires, flux laminaires) et mesures particulaires de v~rification des installations, environ 1 500. Compte tenu de ces possibilit6s, il est pr~par6 avec les res- ponsables des activit~s en cause un programme de pr~16ve- ments n~cessitant la fixation de priorit6s. Dans ce cadre, la r6flexion porte sur les points critiques de processus de fabrica- tion ou de traitement (cuisine, dialyse, st6rilisation) ou les sec- teurs les plus & risque. Chaque responsable conserve ainsi la possibilit6 d'utiliser une partie de son quota de pr61~vements et d'analyses & sa guise en fonction de param~tres propres d'opportunit~ ou de contraintes techniques. Les activit6s de type ~tude et enqu@tes pour lesquelles nous disposons d'un potentiel d'environ cinq mille analyses annuelles sont tr~s diverses et d6cid~es collectivement au sein du service, parfois sur demande de |a direction ou d'un service clinique ou technique. On peut par exemple citer parmi les derni~res : la validation de nouveaux proc~d~s pour le traite- ment des eaux en h~modialyse, la recherche de porteurs de SAMR au niveau rhinopharyng6 chez le personnel de services volontaires, la d~termination de proc6dures ad~quates pour le nettoyage et la d~sinfection de materiel, l'6tude de la tol6rance au chlore et aux d6sinfectants de bact~ries issues de niches 4cologiques particuli4res, l'4tude de l'efficacit4 in vivo de savons antiseptiques, l'6valuation de la contamination des sur- faces avant et apr~s divers protocoles d'entretien et de d6sin- fection, etc. Nous r6alisons ~galement quelques op6rations de style "coup de poing" darts les services cliniques ou m6dico-techniques au cours d'audits sur la qualit6 des soins, oe des pr~l~vements d'environnement tr6s cibl6s pouvant servir & la fois d'outil p~dagogique et de validation d'hypoth~ses ou de protocoles de travail. Ainsi, sauf pour des milieux tr~s & risque (eau pour la dialyse, aliments, air dans des secteurs aseptiques) ou Iors de ces op& rations d'audit dans des services, nous n'effectuons aucune analyse de suivi d'environnement. Si ce type de contr61e peut ~tre utile au d~but de l'existence d'une ~quipe d'hygi~ne, pour l'assurance de son activit4, pour des raisons p~dagogiques et pour conna~tre l 'environnement de son h6pital, il nous est apparu que leur p~rennisation dans le temps ne pr~sentait pas un rapport co0t/efficacit6 suffisant. Ce type de contr61es doit faire partie d'une strat~gie de ma~trise de la qualitY. En milieu industriel, ils servent 6 v~rifier le maintien des Iocaux dans un ~tat de contamination en deq& des valeurs limites fix6es ; ceci est parfaitement pertinent car il n 'y a qu'une activit~ pratiqu~e et donc peu de secteurs critiques & contr61er. En milieu hospi- taller, n0s activit~s sont tr~s diverses, les flux des personnes sont importants dans les secteurs non "ma~trisables" ; seule la bonne application de protocoles de travail permet une preven- tion efficace et dans ce cadre les pr~l~vements d'environne- ment n 'ont nul besoin d'@tre syst6matiques : une operation "coup de poing" en appui d'un audit des pratiques est la mesure la plus raisonnable. En revanche, dans les secteurs les plus & risques, & environnement ma~tris~ ou pour les points critiques, une surveillance microbiologique (et chimique) r6gu- li~re est un excellent moyen de valider le maintien d'un niveau de contamination fix~ & l'avance. Toute d6rive constat6e ser- vant de signal d~alerte (ex. eau de dialyse, aliments, st~rilisa- tion, etc.) Si nous restreignons l'activit~ biologique du service, c'est en raison de notre souhait de ne pas diffuser d'informations limi- t6es, pour des raisons m6thodologiques que nous allons expo- ser, & des utilisateurs non conscients de ces limites et qui pour- raient en tirer des conclusions h&tives, voire parfois erron6es.

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2. Int r6t et limites techniques de la surveillance microbiologique

de l'environnement

En effet, les techniques de surveillance de l'environnement doivent permettre d'avoir une connaissance fiable de la conta- mination de ce dernier ; afin de montrer les limites de cette fiabilit~, il nous semble utile de rappeler les principaux m~ca- nismes conduisant ~ cette contamination qui expliquent que ces m~thodes d'analyse, d'ailleurs non normalis~es, sont actuellement dans leur p~riode de grande jeunesse d'abord pour des raisons de r~cup~ration, puis pour des limites aux m~thodes de d~tection.

1. M~canismes d'adh~sion et d~crochage des microorganismes

La contamination des surfaces a d e u x s o u r c e s : le d~p6t de microorganismes presents dans l'air, et l 'apport direct par des objets ou mains porteurs de microorganismes. La contamination de l'air est li~e ~ un "bruit de fond" prove- nant de l'air ext~rieur, & l'apport par les personnes et & la g~n~ration d'a~rosols par le fonctionnement de machines et mat&riel. Le mouvement de l'air dans "l'ilot de chaleur" pr~- sent autour de tout ~tre vivant va arracher des microorga- nismes et les disperser dans l'atmosph~re. L&, selon l'effet Coanda, une veine d'air se d~plagant dans une enceinte cr~e une zone de d~pression & sa partie sup~rieure qui tend ~ la plaquer contre les parois. L'air ainsi contamin~ va "ruisseler" le long des murs, et d'apr~s les theories de l'impact abandon- nera les particules en suspension dans les filets d'air & chaque d~viation de flux. Cette contamination des surfaces sera donc fonction de l'importance des sources ~mettrices, de la vitesse des filets d'air, de l'attraction des bact~ries sur les parois. Les microorganismes tels que bact~ries et fungi se d~velop- pant parfaitement dans certains milieux liquides (eau, solutes divers, r~sidus de fluides alimentaires, huile, etc.), de nom- breuses machines poss~deront des circuits techniques conta- min~s et leur fonctionnement pourra g~n~rer des a~rosols qui disperseront ces microorganismes. A l'int~rieur de ces a~ro- sols, selon la taille des gouttelettes, certaines pourront se des- s~cher tr~s vite et constituer alors des noyaux de condensation (droplet-nuclei) de tr~s petite taille, donc capables de d~place- ments importants. Les microorganismes vont ensuite se fixer sur les parois et les surfaces ; on distingue classiquement plusieurs phases : la fixa- tion, ph~nom~ne purement physique, l'adh~sion qui implique des ph~nom~nes chimiques et biologiques, et enfin la coloni- sation, ~tape biologique. La f ixa t ion sera li~e ~ des forces d'interaction entre mol~- cules des microorganismes et des surfaces. Ces forces provo- quent l'adh~sion entre les mol~cules diff~rentes ou la cohesion entre mol~cules identiques. Elles sont dues par ordre d'~nergie de liaison d~croissante, & : - la liaison ionique, attraction entre ions positifs et ions n~ga- tifs, - la liaison covalente, liaison entre atomes partageant leurs ~lectrons (en g~n~ral les liaisons sont partiellement ioniques et partiellement covalentes), - la liaison m~tallique, formant un r~seau cristallin o0 les ~lec- trons se d~placent librement, - la liaison entre dip61es, - la liaison hydrog~ne, - la liaison faible par partage d'~lectrons, - la liaison entre dip61e et dip61e induit, - la force de dispersion de London, entre molecules apolaires, dues aux variations instantan~es de configuration des ~lec- trons. Lorsque les forces ci-dessus s'exercent en milieu liquide, elles entra~nent ~ proximit~ des surfaces solides des modifications de la concentration des solutes, en fonction de la fagon dont ils agissent sur la tension de surface du solvant. Ce ph~no- m~ne d~pend notamment du potentiel de surface. I1 se traduit par des modifications du pH et du potentiel d'oxydor~duction.

L'adh~sion des microorganismes aux surfaces d~pend des facteurs ~num~r~s ci-dessus, cumulus ~ des facteurs biolo- giques. Toutefois, elle n'a lieu que si la distance microorga- nisme-surface devient suffisamment petite, du fait des ph~no- m~nes suivants : s~dimentation, mouvement brownien, mouvements flagellaires, mouvements chimiotropes, effet hydrophobe, dessiccation, etc. Elle peut donc ~tre passive (on parle de collage) ou active, c'est-~-dire li~e ~ l'activit~ m~tabo- lique (accrochage).

L'adh~sion peut @tre plus ou moins ferme, selon les forces d'interactions qui entrent en jeu. Ceci d~pend de la composi- tion de la solution (presence d'~lectrolytes), du m~tabolisme cellulaire (formation de compos~s susceptibles de provoquer l'adh~sion) et de la surface (caract~re hydrophobe). Enfin, au sein d'une population, certains microorganismes adherent plus que les autres (presence d'une capsule, synth~se d'exopo- lysaccharides de type "slime", etc.). Ceci ne doit pas ~tre confondu avec les differences d'adh~sion dues & la forme de la surface (fissures, craquelures, etc.). La combinaison de ces processus chimiques et biologiques permettra au microorga- nisme de se d~velopper, car il semble que l'aptitude & la proli- f~ration soit sup~rieure pour beaucoup de bact~ries en cas de presence d'un support plut6t que fibres dans l'environnement. La colonisat ion de la surface sera fonction de l'aptitude des germes ~ se d~velopper ou & survivre, ce qui d~pend des conditions ~cologiques locales (humiditY, temperature, nature de la surface, presence de substances protectrices ou inhibi- trices, etc.) et des caract~ristiques m~taboliques des microor- ganismes pouvant agir en synergie. Lorsque les conditions sont favorables, les microorganismes presents vont se d~ve- lopper et coloniser progressivement la surface pouvant former un "biofilm" compos~ de plusieurs couches plus ou moins fix~es sur la surface.., et donc difficiles & d~crocher. De plus, en raison des nombreux facteurs qui influent sur l'adh~sion au sein d'une population de microorganismes, il existe une distri- bution de l'intensit~ de l'adh~sion. Aucun proc~d~ ne permet donc de d~tacher simultan~ment toutes les bact~ries qui adherent & une surface. Si l'on admet que la m~thode de pr~l~vement utilis~e a un rendement constant dans des conditions donn~es, le nombre de bact~ries d~tach~es Iors de pr~l~vement it~ratifs au m~me endroit varie Iogarithmiquement et l'~quation de la cin~tique de d~tache- ment est donc:

log Ni= log N O + x log b o0 N ies t le nombre de bact~ries d~croch~es sur pr~l~ve-

ment i log N o l'ordonn~e & l'origine et log b la pente de la droite.

On d~montre (5) que le nombre total de bact~ries pr~sentes sur l'emplacement des pr~l~vements (NT) est th~oriquement ~gal & :

N T = N 1 1-b

ok N 1 est le nombre de bact~ries d~tach~es lors du premier pr~l~vement. Si la technique de pr~l~vements comporte un support inter- m~diaire (ex. ~couvillon) dont il faudra extraire les micro-orga- nismes, il faudra calculer un deuxi~me rendement de r~cup~- ration ~ partir du support de pr~l~vement et le r~sultat de contamination apparente mesur~ sera & affecter des deux ccefficients de rendement pour ~valuer la contamination de la surface. Bien que ces donn~es aient ~t~ diffus~es depuis pros de vingt ans (5, 8), il est malheureux de constater que de nombreux exp~rimentateurs n~gligent ou ignorent totalement ces phi- nom~nes et "travaillent" sur des r~sultats de contamination apparente qui dans les faits peuvent ne representer que quelques pourcents de la contamination r~elle, alors que ce biais r~duit ~ n~ant toute interpretation de leurs travaux.

2. Les limites des m~thodes de mise en culture Un autre ph~nom~ne induit un biais tout aussi important, c'est l'incapacit~ dans laquelle nous sommes de cultiver les microorganismes r~ellement presents dans l'air ou sur une surface. En effet, un microorganisme present dans l'environ- nement n'est pas dans des conditions physiologiques iden-

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tiques & celles off i] peut exercer son pouvoir pathog~ne 37 °C chez l 'homme. On parle de bact6ries "stress~es" voire de bact~ries "bless6es" en cas de traitement de d6sinfection pour lesquelles des conditions de culture de type microbiologie clinique sont un v6ritable arr6t de mort. Ainsi, par rapport aux bact6ries pr6sentes dans un biofilm, et en supposant le rende- ment de la m~thode de pr61~vement de 100 % pour toutes les esp~ces pr6sentes, seul un tr~s faible pourcentage (de 1 % quelques pourcents) sera capable de se d6velopper en culture par rapport & la numeration obtenue par des m~thodes de visualisation par 6pifluorescence avec des fluorochromes ad~- quats repr6sentant la vraie flore totale des bact6ries vivantes. De plus, les conditions exp~rimentales vont induire des biais compl6mentaires li~s & l'extraction et & la raise en suspension (si n6cessaire), & la dilution ou 8 la concentration avant d6nombrement. L'extraction et la mise en suspension des bact~ries est proba- blement la partie des manipulations qui a fait l'objet du plus petit nombre d'investigations et qui reste, en cons6quence, le plus souvent & l'6tat de recettes plus ou moins arbitraires, rapi- dement d6crites dans les chapitres m6thodologiques. Le choix d'une m6thode de dispersion des agr~gats est rarement justifi6 exp6rimentalement (comparaison d'efficacit6), alors qu'en pratique, chaque 6chantillon constitue un cas particulier. Les m~thodes les plus couramment mises en oeuvre sont l'agita- tion m6canique, manuelle ou non, et le traitement mod6r~ aux ultrasons (quelques dizaines de watts sous une fr6quence de 20 kHz). La dur6e des traitements varie, selon les 6tudes, de quelques minutes & une demi-heure. Dans le cas d'un traite- ment chimique, le liquide de dispersion est une solution de tween ou de potasse ou de pyrophosphate de sodium dont il faut v6rifier la compatibilit6 avec la viabilit6 des bact6ries. L'6tape suivante est une agitation m6canique de plusieurs minutes (5 & 30) suivie d 'une d6cantation dont la dur~e est d6finie, elle aussi, plus ou moins arbitrairement (5 30 minutes). La suspension bact~rienne est pr~lev~e ~ l'aide d'une pipette sterile & une distance d6termin6e de la surface du liquide. Certains auteurs r~alisent la s6paration des deux phases par une centrifugation. La d6finition arbitraire des dur~es d'agitation et de d6cantation explique probablement une grande partie des variations de l'incertitude sur les r~sul- tats d'un exp~rimentateur & un autre. Que ce soit pour des motifs techniques ou statistiques, la plu- part des m6thodes de d6nombrement exigent que la concen- tration des bact~ries dans la suspension ~tudi~e se situe dans une gamme bien d~termin~e. II est donc n6cessaire de proc~- der, selon les milieux, soit ~ la dilution, soit & la concentration de la suspension m~re. Les dilutions sont tr~s souvent r6ali- s6es directement dans de l 'eau distill~e sterile ou dans des solutions de chlorure de sodium. Un substrat nutritif de type peptone est parfois ajout6 en faible concentration (1%). Ces solutions artificielles semblent avoir des effets inhibiteurs sur certaines bact6ries ; aussi, pour les d6nombrements de types culturaux, il faut leur pr~f~rer l 'eau du milieu ~tudi~ st~rilis~e et filtr6e. La concentration des bact~ries est souvent n~cessaire quand leur nombre est faible, mais aussi dans le cas de la recherche de types bact6riens particuliers. Cette operation est g~n~rale- ment r6alis6e par filtration sur membrane en polycarbonate (type nucl6pore 0,2 pro). Ces membranes permettent une reprise des cellules bien plus compl~te que les membranes en ac6tate de cellulose. II est preferable d'ailleurs de ne pas mener la filtration ~ son terme et d 'op6rer la remise en sus- pension ~ l'int6rieur m~me du buchner de filtration. Lorsqu'un grand nombre de particules annexes encombre la suspension m~re et risque de provoquer le colmatage des filtres, la concentration est r6alis~e par centrifugation. Les caract~ristiques en sont variables et de l'ordre de 4 000 G pendant 5 minutes pour un volume de 10 ml. Cette m6thode a pour consequence une perte de mat6riel cellulaire plus importante que la filtration. Quant aux m6thodes de d~nombrement des bact6ries, nous distinguerons les m~thodes directes, dans lesqueUes les d6nombrements s'effectuent par l 'observation individuelle des cellules et l 'ensemble des autres m6thodes, qualifi~es d'indi- rectes.

Parmi les m~thodes indirectes, le d6nombrement des bact6ries par culture conduit au d6nombrement des bact6ries viables susceptibles de se multiplier dans les conditions de culture impos6es par les modes op6ratoires. Cette d6finition implique qu'une s~lection & deux niveaux peut 6tre op~r6e parmi les cellules : sur un plan particulier, certains types m6taboliques peuvent @tre privil6gi6s & l'int6rieur de chacun des deux groupes : bact6ries actives et bact6ries quiescentes. Cette s61ection parmi les bact6ries r6ellement potentiellement actives du milieu aura pour cons6quence de fausser l 'impor- tance relative des diff6rentes populations. La s~lection est intentionnelle (culture sp6cifique) dans le cas off le d~nombre- ment doit porter sur un groupe bact6rien physiologiquement particulier. En revanche, plus la sp~cificit~ requise est faible, plus le biais introduit par la m~thode sur l'estimation des populations est grand. La s~lection s 'op~re & travers les trois caract~res fondamentaux des cultures : caract~re physique (temperature, ~tat physique du milieu, dur6e de ]'incubation), caract~re chimique (nature et disponibilit6 des nutriments, pH, oxyg~ne, etc.) et environnement biocoenotique avec routes les relations intersp6cifiques qu'il implique. Ces cultures vont se faire soit sur milieux solides, par 6talement ou par incorpora- tion & la g61ose et numeration des "unit~s formant colonies" apr~s incubation, soit sur un milieu liquide de fa~on qualitative ou quantitative. Les autres m6thodes indirectes sont spectrophotom6triques, n6ph~16m6triques et micro-autoradiographiques. Dans le cas des m~thodes directes, on utilise toute la gamme des moyens mis & disposition par la microscopie : microscopie optique, en lumi~re transmise apr~s concentration et addition de fluorochromes, etc. et microscopie 61ectronique, en trans- mission ou, de plus en plus fr~quemment, en balayage, ce qui fournit d'extraordinaires images et des renseignements fort pr6cieux sur la morphologie en trois dimensions des contami- nants mais surtout renseigne sur la quantit6 r~elle de micro- organismes vivants presents.

3. Comment le biologiste peut tenir compte de ces ph nom nes

Compte tenu de tous ces param~tres, un biologiste, techni- quement competent mais scientifiquement malhonn~te, pourra sans aucune difficult~ montrer l 'absence de contamina- tion d'un milieu donn~ en utilisant toutes les "astuces" qui, d'un mauvais pr~l~vement & une m~thode de culture euthana- siante, permettront d'aboutir ~ un r~sultat faussement n~gatif teUement plus satisfaisant pour le donneur d'ordre ! Heureusement ce cas est rare ; & l'inverse il y a beaucoup de biologistes pleins de bonne volont~ mais ignorants de ces phi- nom~nes qui produisent en toute bonne foi des r~sultats tout aussi biais~s. Ceci est particuli~rement vrai lorsque l 'on utilise les techniques et les milieux de la bact~riologie m~dicale qui sont totalement inadapt~s & la microbiologie de l'environne- ment. Ainsi, certains appa~eils d'~tude de la contamination micro- bienne de l'air sont plus aptes & faire des "trous dans la g~Iose" et & "br01er la bact~rie" compte tenu de la vitesse d'impaction et de l'~nergie & dissiper lots de la capture de la bact~rie... comme une capsule spatiale rentrant dans l 'atmosph~re ter- restre. Combien contr61ent encore la "sterilitY" de l 'eau ou des liquides de dialyse avec des "sucettes g~Ios~es" totalement inadapt~es ~ cet usage ? Qui ne publie pas des r~sultats d'6tude de la contamination de textiles alors que le rendement de la m~thode de pr61~vement est de l'ordre de 1 % seule- ment, sans parler du biais Ii6 ensuite & la culture. Cet expos6 de nos lacunes m~thodologiques ne doit pas nous d6courager et nous faire abandonner toute surveillance micro- biologique de l 'environnement. II convient cependant de bien cibler ce type de contr61e pour en tirer des informations perti- nentes. Pr61ever dans un siphon de lavabo permet, compte tenu de l'6cologie de cette niche, d'avoir un r6sultat positif avec isolement de germe(s) (... dans le cas contraire, il faut se

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poser de grosses questions sur les methodes du laboratoire). Mais que veut dire ce resultat ? Cette contamination est-t-elle la cause d'une possible infection nosocomiale (le bacille pyo- cyanique peut-il passer du siphon au patient ? Si oui, les pro- tocoles de travail sont vraiment & revoir !) ou le simple reflet de l'61imination legitime de divers effluents liquides dans ce lavabo ? Les &tudes de la biocontamination de l 'environnement hospi- talier doivent avoir deux objectifs : - de fagon semi quantitative juger d'un niveau de base de la contamination en secteur ou point critique, la constatation d'un gros &cart par rapport & l'habitude devant conduire & une &tude plus approfondie ; - de faqon quantitative, avec une strat6gie d'echantillonnage et de m6thodes de laboratoire ad&quates, prouver l'efficacit& de procedes de traitement. Dans ce cadre, la surveillance biologique de l 'environnement garde une place int&ressante dans l'ensemble de la sur- veillance mise en place dans un &tablissement : donn&es epi- d6miologiques, donn6es du laboratoire de biologie clinique uti- lis6es avec un objectif epidemiologique ainsi que l 'ont soulign& r&cemment VASSAL et coll. (10). A titre d'exemple, pour un contact de deux minutes, sous une force de 200 g avec une bo[te Rodac remplie de gdose nutri- tive standard pour numeration, les facteurs par lesquels on peut multiplier |e chiffre de la flore numeree sur la premi&re bo~te appliqu&e sur une surface pour estimer la flore cultivable presente (et non la flore viable) sont, dans notre etablissement, de l'ordre de 2,5 & 3,5 pour des carrelages, de 4 & 5 pour des dalles PVC, 8 & 10 pour le bois, 2 & 3 pour l'inox. Si l 'on reste dans les limites de ce type de demarche, on 6vitera pro- bablement de faire de trop grosses erreurs d'interpretation, malgre des surprises qui peuvent parfois ~tre d~sagr~ables. Ainsi, WYPKEMA et ALDER (11) trouvaient malgre une m&thodologie a priori satisfaisante, moins de germes sur les murs d'un h6pital apr~s prel&vement par la methode d'ecou- villonnage standardise par la NASA que PUELO et coll. (9) n 'en mettaient en evidence sur les parois des capsules Appolo pourtant mont&es avec un maximum de precautions et des ouwiers travaillant en scaphandre, ce & quoi nous ne sommes pas encore habitues dans nos 6tablissements [ Aussi, il nous faut bien noter que sauf pour la surveillance de qualit6 des aliments pour laquelle existent des m&thodes stan- dardis&es, aucun autre milieu ou produit n 'a fait l'objet de nor- malisation tant pour la methode d'etude de sa contamination que pour des valeurs de r&ference permettant de juger de son ad&quation par rapport & un usage d6fini. Ainsi, la surveillance du linge, de l'air, de l'eau, des surfaces, des savons et autres

produits reposera sur des m&thodes plus ou moins empiriques selon le laboratoire, rendant toute comparaison inter&tablisse- ments vaine, ainsi que la proposition de classes de contamina- tion. Ainsi, pour l'air, selon l'appareil, le milieu de culture et la technique d'incubation utilis&s, le r~sultat quantitatif pourra varier facilement d 'un facteur 5 & I0 . C'est pourquoi les pro- positions de d&finition de classes de contamination n 'ont aucun int&ret pratique si elles ne s 'accompagnent pas d'une methodologie de ref&rence ce qui n 'a jamais &t~ le cas jusqu'& present. De m&me, l'etude des antiseptiques, des surfaces ou de tout autre support contenant ou ayant mis en contact avec un agent antimicrobien doit &tre r&alise en utilisant un neutra- lisant de celui-ci et apr&s verification de l'absence de biais methodologique (toxicit& de neutralisant, interaction des pro- duits ou de leur combinaison avec la methode de culture, etc.). Ainsi, le biologiste dans son propre etablissement pourra avec profit etudier l'evolution quantitative dans le temps de la contamination d'un milieu puisqu'il utilisera en permanence la re&me methodologie. II pourra bien sQr utiliser avant tout les donnees qualitatives car l'apparition de tel ou tel germe est un facteur tr&s important. En revanche, la comparaison avec d'autres sources de donnees reste & manipuler avec beaucoup de precautions.

Conclusion

La surveillance microbiologique de l'environnement hospitalier est indispensable. Elle doit reposer sur une m~thodologie adapt~e tant pour la strat~gie d'~chantillonnage que pour le pr~l~vement et sa mise en culture au laboratoire. Elle dolt reposer avant tout sur une analyse des dangers pour le patient men~e selon la m&thodologie dite HACCP, analyse de points critiques, dans les secteurs les plus exposants de fagon & presenter, & une ~poque o~ nos ~tablisse- ments doivent absolument tenir compte des para- rn~tres ~conomiques, un rapport coQt/efficacit~ et co~t/b~n~fice satisfaisants. Mais dans l'~tat de nos connaissances, on ne peut que proposer de hi~rarchi- ser la fr~quence des contr61es et la rigueur des crio t~res d'appr~ciations de qualit~ en fonction du niveau de risque (de 1 & 4 de l'administration aux blocs op~ o ratoires) sans y associer de r~fhrences nationales ou internationales.

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