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L e jeudi 10 octobre, dons les Salons de Le Doyen, s'est tenu le 9 e Club des laboratoires. Claude Naudin avait retenu comme th~me les marqueurs s6riques et tissulaires pr6dictifs et pronostiques de la maladie. Pour traitor des diff6- rents sujets de cette actualit6 serologique, il avait invit6 les personnalit~s suivantes :

• le D r Fr~d6rique Spyratos, biologiste au laboratoire d'oncobiologie, centre Ren6-Huguenin, Saint-Cloud, • le D r Susy Scholl, oncologue, Institut Curie, Paris (elle avait trait~ de I'immunoth~rapie dans le cancer du sein au Club

pr6c~dent), • le D r Michel Sala, biologiste & LCL, Ivry, "̀ le D r Henri Magdel~nat, chef du d6partement de biologie des tumeurs, Institut Curie, Paris.

Comme& rhabitude, le public ~tait assur6 par la pr6sence de nos soci~t6s membres : Biohit, Biodirect, Bmd, DPC, Roche Diagnostics, Sebia et Tosoh-Biosciences. I~taient ~galement invites nos futurs membres : BioTest, Brahms et Diasorin.

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Cancer du sein (KS) : statistiques et rati0nnet

• C'est le cancer le plus souvent rencontre chez la femme de race blanche.

• Son incidence est comprise entre 80 et 90 nouveaux cas/lO0 000 femmes.

,25 000 cas sont diagnostiqu6s en France chaque annie (180 000 aux I~tats-Unis).

• Le risque de KS augmente avec ]'gge, au-del~, de 50 ans (la mala- die est rare avant 35 ans).

• Los femmes ayant d6j& eu un KS ont un risque accru d'en avoir un second D, I'autre sein

°Les diagnostics d'hyperplasie atypique ou de carcinoma lebulaire in situ augmentent le risque de KS

• Une contribution g6n6tique au risque de KS est probable dons un contexte familial (forme autosomale dominante par mutation des

i i u l | i i , i h i m ,

genes bcrA1 et bcrA2) ; toutefois ces mutations sont rares et n'int6ressent pas plus de 5 & 10 % de I'ensembie des KS.

,,Six autres genes - impliqu6s dans l'an6mie de Fanconi -, qui interviennent dans la vole commune ~ bcrA1 et bcrA2 de reparation de I'ADN, pourraient etre des genes candidats de susceptibilit6 au KS.

oLes femmes ayant une Iongue duree d'exposition aux estrogenes (m6narche pr6coce et menopause tardive), nullipares ou primi- pares tardives (~ 30 ans) augmentent leur risque de d6vetopper un KS cependant il sembte que le risque de d6ces par KS ne soit pas major6 par la @ule 5 ans apres I'arret de la prise,

oLa pfupart des femmes atteintes d'un KS ne pr6sentent cependant aucune des caract6ristiques cit6es ci-dessus, en dehors du risque associ6 au vieillissement.

I II I IIIIIIII I IIIIIIII II

Marqueurs sbriques du cancer du sein (KS) IIs sont globalement d6cevants (encadr~ 1). De plus, trois r~gles doivent 6tre imp6rativement respectees : • Effectuer, pour un patient donn6, les dosages de mar-

queurs clans le m6me laboratoire et par la m~me tech-

Le CA 15-3

UACE (antigOne carcinoembryonnaire) a longtemps ~t~ le seul marqueur s6rique & disposition. Dans les ann6es 1990, il a ~t~ substitu6 par te 15-3 (carbohydrate antigone), qui est un antigone de diff6renciation, de 1'6pith61ium mammaire. C'est le produit du g6ne muc-1 dont deux anticorps reconnaissent le m6me motif

nique. En effet, il n'existe pas de standardisation inter-" ~(encadr# 2). nationale notamment pour les produits du g~ne muc-l. Les calibrages sont donc trousses-dependants. V6rifier sur un autre pr61~vement un premier r6sultat sup~rieur aux valeurs usuetles. Interpr6ter les r6sultats en fon~ion de la cliniclUe:d'Une part, des r6sultats anatomo 3athologiques et tom0den- sitom6triques d'autre part.

Dans le-cadre d'un d6pistage ou d'un diagnostique pr6coce, ~£appela le D r Sala, les caract6ristiques du 15-3 sont pauvres • 2 & 7 % des sujets sains ont un taux ~lev6, il peut ~tre augment6 au-del& de 100 U/mL aussi bien dans des affections b~nignes qua dons d'autres ¢athologies malignes (encadr6 3). Peu sp6cifique, il est ~galement peu sensible. La litt6rature montre que seuls 7 & 34 % des KS non m6tastatiques (tous stories confondus) ont Un taux de 15- 3 au-del& de la borne sup~rieure des valeurs usuelles (< 30 U/mL). Les caract6ristiques biochimiques de ce marqueur soluble sont rappel~es dans I'encadr~ 4. Attention aux valeurs observ~es dans le cancer colorectal (formes ~volu6es) !

CA 15-3 et anticorps monoclonaux ,,115 P8 : obtenu par hybridation des cellules d'un my61ome murin avec des cellules spl6niques de souris immunis6s par du lait humain. • DF3 : obtenu par hybridation de cellules d'un my61ome murin avec des cellules de carcinome mammaire humain. Seules les trousses labellis~es 15-3 utilisent ces deux anticorps monoclonaux.

Causes d'dldvations du 15-3 (h0rs KS) Affections bdnignes Affections malignes

Affections mammaires H6patopathies Bronchopneumopathies Inflammations digestives Pathologies endocrines Maladies auto-immunes

Ovariennes Colorectales (+ + +) H6patobiliaires Gastriques, pancr6atiques Thyroidiennes Pulmonaires

Bi0chimie du pr0duit du g~,ne muc-1 • Pr0t6ine transmembranaire avec :

- un d0maine cyt0plasmique de 69 AA ; -un d0maine extracellulaire c0nstJtu6 de 30 ~ 100 unit6s

de s6quences r6pet6es en tandem d'une 10ngueur de 20 AA hydr0xyl6s (s6rine, thr60nine, pr01ine), permettant la fixation des sucres.

• Lhypoglycosylation a 6t6 consid6r6e comme 1'616ment essentiel reconnu par le syst~me immunitaire (s6quence TAPPA). Tr~)s r6cemment, d'autres 6pitopes plus immunog~nes ont 6t6 d6cou- verts darts ia partie non r6p6titive de la s6quence.

Le TPS

Le tissue polypeptide specific antigen (TPS) est un fragment soluble de la cytok6ratine 18 qui pr6sente dans la r6gion 2 de rh61ice alpha la s6quence M3, 6pitope reconnu par I'anticorps monoclonal utilis6 dans les trousses de dosage. Le TPS, bien que d6pourvu de toute sp6cificit6 d'organes ou de tissu tumoral, est particuli6rement sensible darts la d6tection des formes progressives, m~tastatiques du KS. C'est en effet le seul marqueur (compar~ & I'ACE, ie CA 15-3 ou ie MCA) dont la concentration chute immediatement en pr6sence d'une th6rapeutique efficace, alors que des taux stables ou en augmentation d~montrent une r6ponse th6rapeutique inadequate. Une ~tude europ6enne multicentrique [A. Van Dalen et al, Int J. Biol. Markers 13 (1) (1998) 10-15] a conclu que le TPS indiquait le devenir ciinique (remission ou progression) plus rapidement et plus exactement que ne le font I'ACE et/ou le CA 15-3.

Marqueurs tissulaires pronostiques et predictifs du KS

D(~finitions

Un facteur est dit pronostique 1'6volutivite de la maladie, le

quand il p~se sur devenir du patient

ind6pendamment de la th6rapeutique mise en oeuvre, et quand il pese sur le degr6 de r6ponse & une th6rapeutique sp6cifique. Certains facteurs poss6dent ia double potentialit6 : ainsi, les r6cepteurs aux estrog6nes (RE) presents dans le tissu malin, sont & la fois un facteur pronostique favorable et une forte indication de bonne r6ponse & I'hormonoth~rapie (encadr# 5). Le D r Fr~d6rique Spyratos a fait une revue g~n6rale de ces marqueurs.

Les r6cepteurs aux estrogenes

C'est Antoine Lacassagne qui, en 1932, a d~montr6 que I'administration d'estrog~nes & fortes doses & des souris m&les provoquait des cancers de la mamelle. De m6me, Huggins proposa en 1941 I'orchidectomie bilat6rale comme traitement du cancer de la prostate. Ainsi naquit I'hormonoth6rapie, dont le but est d'emp6cher, dans le KS, les cellules canc6reuses d'6tre stimul~es par les estrog~nes. II convient donc de bloquer cette stimulation : • par blocage du r~cepteur & I'aide d'un anti-estrogCne

(tamoxif~ne) ; • de supprimer la synth~se d'estrogenes par I'adminis-

tration d'inhibiteurs de I'aromatase (chez la femme m6nopaus6e) ou par des agonistes de la LH RH (chez la femme encore r6gl6e) ;

• d'effectuer une ovariectomie, une radioth6rapie ou une chimioth6rapie visant & enlever ou & d6truire les cel- lules ovariennes productrices d'estrog~nes.

II existe depuis 1996, un 2 e r6cepteur aux estrog6nes. IIs sont appel6s respectivement RE-alpha et RE-b6ta. Initialement, les taux de recepteurs 6talent mesur6s & partir des tissus m6tastatiques, afin de4pr6dire la r6ponse & I'hormonoth6rapie (encadr6 6). Les m6mes mesures effectu6es sur les tumeurs primaires peuvent 6galement pr6dire la probabilit6 d'6chappement pr6coce (double potentialit6 des r6cepteurs aux estrog~nes, & la fois marqueurs pr~dictifs et pronostiques).

Marqueurs de prolif(~ration

Une tumeur prolif6rative est un facteur p~joratif darts les KS trait6s chirurgicalement, notamment ceux qui sont class6s ganglions n~gatifs chez qui, le caract~re prolif6ratif peut 6tre utilis6 pour reconnaftre ceux associ6s au plus haut risque de m6tastases. Diff6rents marqueurs peuvent 6tre consid6r~s : • d6tection immunohistochimique des PAA (proliferation

associated antigens) ; • dosage de la thymidine kinase ; • d6termination de la fraction des cellules en phase << S ,,

par cytom6trie de flux, qui fournit en m6me temps le degr6 de I'ADN-plo'/die ;

• d6nombrement des mitoses (grade histologique):-

P r o t o - o n c o g ~ ) n e her~2 nee

Localis6 sur le chromosome 17q, ce proto-oncog~ne code pour une prot6ine de 185 kd, transmembranaire, & activit~ tyrosine kinase et appartenant & la famille des r6cepteurs de facteur de croissance (encadr6 7).

F, Spyratos

Horrnonothdrapie en bref... • Anti-estrog~nes, tarnoxifene : molecule non steroTdienne (noyau triphenylethylene), antagoniste estr0genique dans le KS (action agoniste sur I'end0metre) par competition avec ie recepteur nucleaire. Les effets secondaires principaux sont de type << flare up >>, avec p0tentiatisati0n de I'effet anticoagulant type warfarine et augmentation du risque de cancer de I'endometre • Anti-aromatases de nouvelle g~neration (Arimidex ®, anastrozole) : inhibiteur de la secretion estrogenique surrenalienne (production par aromatisation extraglandulaire de precurseurs provenant du cortex surrenalien chez la femme menopausee). Cette molecule inhibe I'aromatase qui transf0rme les androgenes en estrogenes. Par liaison competitive avec le cytochrome p450, il modifie de fa£0n importante le metabolisme de nombreux medicaments.

La famille des g~nes her comprend quatre genes : her1 (c-erbB-1) ; her2 (c-erbB-2) ; her3 (c-erbB-3) ; her4 (c- erbB-4). La surexpression de her2 est retrouv~e dans 60 % des carcinomes canalaires in situ (CCIS) ; la positivit~ de her2 est significativement associ~e au CCIS de haut grade et au type de comedocarcinome. Un faible taux de reponse, voire une r~sistance au tamoxif~ne, sont associ~s & la positivit~ de her2. II n'y a pas de donnees consensuelles sur la relation entre la surexpression de her2 et la reponse & la chimiotherapie. her2 est & I'heure actuelle essentiellement utilis6 comme facteur pr~dictif puissant de la reponse au traitement par anti-her2 monoclonal (trastuzumab ou herceptine). Les anti-her2 peuvent s'opposer aux proprietes de signalisation de la croissance cellulaire du systeme her et empecher ainsi la multiplication des cellules cancereuses.

M a r q u e u r s d e r(~gulat ion du c y c l e c e l l u l a i r e et d e la m o r t ce l lu la i re

• Gene p53 : situ~ sur le chromosome 17, ce g~ne sup- presseur de tumeur exprime la proteine P53 qui r~gule la transcription de nombreux autres genes. Elle est capable d'induire un arret du cycle cellulaire en ,, G1 ,,, et si les mecanismes de reparation sont insuffisants, d'induire I'apoptose. Les mutations de ce g~ne sont parmi les alterations genetiques les plus fr~quentes dans tousles cancers chez I'homme. Des mutations ou des d~l~tions se ren- contrent jusqu'& 50 % des KS.

• La famille bcl.2 et rapoptose : le proto-oncog~ne Bcl-2 correspondant & une translocation chromoso- mique t(14 ; 18), d'abord identifiee dans un lymphome folliculaire, est un inhibiteur de I'apoptose. Cependant, de nombreuses ~tudes ont montr6 que la surexpres- sion de Bcl-2 est un marqueur de bon pronostic et de r~ponse au tamoxif~ne.

Immunoth( rapie dans le cancer du sein Le D r Suzy Scholl nous avait 6galement entretenu de cet aspect Iors de sa derni~re intervention. Plusieurs etudes ont ~t~ conduites (phases I et ll), dans lesquelles I'expression des g~nes humains mucl et il2 est sous le contrSle de g~nes vecteurs viraux de type Poxvirus. L'injection se fait en sous-cutanee. Le virus infeste

tumoraux sont presentes aux cellules dendritiques qui migrent vers les ganglions drainant ce site et induisent une r~ponse immunitaire. Ace jour, les r~sultats montrent une bonne tolerance de ces vecteurs, mais il n'existe toujours pas de correlation entre reponse clinique et reponse immune. Dans une ~tude de phase II, deux r~ponses cliniques partielles ont pu 6tre demontrees, dont I'une a pu 6tre complet~e chirurgicalement. La patiente est toujours en r~ponse complete de ses m~tastases h~patiques, ~ pros de 4 arts du d~but de son traitement de vaccination.

Genomique et cancer du sein

Dans les tumeurs solides de I'adulte, les alterations gen~tiques s'accumulent avant la transformation maligne et sont donc & la fois nombreuses et tr~s diverses dans une tumeur donn~e. C'est & ce challenge que Henri Magdelenat a brillamment repondu en abordant & ce Club les nouvelles techniques permettant une etude, en principe exhaustive, de I'ensemble des alterations des g~nes au niveau de leur structure comme au niveau de leur expression ou de leur fonction. Le suffixe ,< -ome ,, caract~rise ces nouvelles approches globales. Ainsi, le genome concerne les alterations stucturales de tousles g~nes connus, celle du transcriptome concerne les profils de transcription (ARNm) de I'ensemble des g~nes, le ,, spliceome ,, analyse le repertoire de I'ensemble des variants d'epissage des ARNm et le prot~ome analyse I'expression de proteines d'un 6chantillon. L'outil de base de ces nouvelles techniques est, le plus souvent, la ,, biopuce ,, support solide de dimension restreinte (lame de verre ou de silice, membrane de nylon...) de quelques centim~tres carres, o0 sont alignes des milliers de capteurs moleculaires individuels, chacun 6tant specifique d'un 616ment de chromosome (puce d'hybridation genomique comparative), d'une s~quence d'ARNm (transcriptome), d'un variant d'epissage (,, spliceome ,,), ou d'une proteine (prot~ome).

Recepteurs nucleaires hormonaux aux estrog~,nes • RE alpha est Iocalise sur le chromosome 6, RE-beta sur le 14, • II existe des homologies de structure entre ies deux recepteurs. • Les deux se Iient aux estr0genes et aux antiestrogenes (tamoxifene et 4-0H tamoxifene) • Les deux s0us-types modulent la transcription de 2 fa§0ns :

- par la voie classique de ERE (estrogen responsive element) ; - par la voie d'un activateur proteique API. Quand le << signa-

ling >> apparatt au site AP1, RE-alpha et RE-beta agissent de fa§on oppos6e : ainsi, li6s a RE-alpha, les estrogenes activent la transcription, mais celle-ci est inhibee en presence de RE-beta.

La presence de I'ARNm de RE-beta semble predire une resistance au tamoxifene. Le rele de RE-beta au niveau du sein normal ou mann n'est pas encore clairement etabli. I/expression de RE-beta pourrait etre un signe de mauvaise reponse au tamoxif~ne en thd- rapeutique adjuvante,

H. Magdek~nat

toutes les

Transcriptome L'utilisation des puces permettant I'analyse du transcriptome est la plus avanc6e. II existe deux types de puces selon le capteur d6pos~ sur le support : • les puces oa sont d6pos6es des batteries de cDNA

(ADN compl6mentaires de s6quences nucl6otidiques correspondant chacun & un gene donne) ;

• les puces o5 sont d6pos6es des batteries d'oligonu- cl6otides sp6cifiques des s~quences d'ARNm & d6tec- ter (type Affymetrix TM avec oligonucleotides courts - 20 mers -, ou type Agilent TM avec des oligonucl6otides longs - 60 mers).

Les 6tudes de transcriptome publi~es r6cemment ont ~t6 r6alis6es sur des puces de 25 000 g~nes ou plus. L'analyse des ARNm d'une tumeur se fait en extrayant puis en marquant globalement les ARNm avec un traceur soit radioactif, soit fluorescent. Ces ARN marques sont hybrid6s sur la puce : chaque ARN contenu clans 1'6chantillon est ainsi capt6 par son liguant sp6cifique, proportion de sa concentration darts la tumeur dont il est extrait. L'intensit6 de chaque ,, spot ,, (radioactive ou fluorescente) correspondant & un g~ne donn6 est compar6e g rintensit6 du m6me spot mesur6e sur une autre puce hybrid6e avec les ARNm extraits de tissu normal et marqu6s de la m6me fa(~on. On peut 6galement hybrider sur une m~me puce, de fa~on comparative, un melange en quantit6s 6gales de I'ARN total de la tumeur marqu6 avec une fluorescence rouge et de I'ARN total de tissu normal marque avec une fluorescence verte. Un , spot (= un g~ne) ,, verra dominer la couleur du transcrit le plus abondant (rouge si c'est dans la tumeur, vert si c'est dans le tissu normal, neutre si les transcrits sent 6galement exprim6s). L'~tude du transcriptome permet donc d'etablir un profil d'expression pour chaque tumeur, par rapport & un ARN , normal ,,. Les profils d'expression ne sont jamais identiques d'une tumeur & I'autre mais des methodes , biostatistiques ,, permettent de grouper les profils par similitude (les m6mes g~nes ,, souvent ,, surexprim6s ou sous-exprimes) dans un m~me groupe de tumeurs. Par ranalyse d'une centaine de tumeurs, on peut, sans hypoth6se a priori (l'analyse est alors dite ,, non supervisee ,,), obtenir, grace & ces methodes de regroupements, des tumeurs & profils semblables. Des classifications mol~culaires (et non plus histologiques) sont ainsi obtenues. Pour les cancers du sein, des classifications ont 6t6 d6crites par P6rou et al. [Nature,

her2 et cancer du sein -her2 est impliqu~ dans les ph~nomenes de croissance tumorale, - 20 % des cancers primitifs pr~sentent une amplification g~nique ou une surexpression du r~cepteur her2, aboutissant a une activa- tion permanente des r~cepteurs her2 et donc ~ une hyperstimula- tion de la croissance cellulaire qui echappe ainsi ~ sa r~gulation, - les patientes ~ tumeurher2+ ont une survie sans progression et une survie globale inf~rieures ~ celles ~. tumeur her2-.

406 (2000) 747-52], Soerlie et al. [PNAS 98 (2001) 10869- 10874], Van't Veer et al. [Nature 415 (2002) 530-536]. On peut 6galement rechercher les combinaisons de g~nes anormalement exprim6s qui permettent de discriminer les sous-groupes de tumeurs qui ont un comportement clinique diff6rent, par exemple celles qui sont rapidement devenues m6tastatiques de celles qui ont un tr~s bon pronostic. Darts une analyse dite , supervis~e ,, de ce type (les conditions sont d~finies a priori), 1'6quipe de Van't Veer [NEJM 347 (2002) 1999- 2009] a caract6ris6 une combinaison de 70 g~nes dont I'expression d6termine le pronostic des cancers du sein & 10 ans, bien mieux que ne le font les indicateurs clinico- biologiques actuels. Ainsi, les patients avec le - bon ,, profil d'expression ont 95 % de chance de survie & 10 arts contre 55 % pour ceux avec le ,, mauvais ,, profil.

Spl iceome

Les ARNm varient quantitativement mais aussi qualitativement, en ce qu'apres avoir 6t6 transcrits & partir de leur matrice d'ADN (qui comprend des exons transcrits et des introns non transcrits) ils subissent une , maturation ,, ou ~pissage, qui d~l~te les s6quences introniques. L'epissage peut 6galement 61iminer des sequences exoniques et ce, avec une tr~s grande variabilite (6pissage alternatif), ce qui conduit & une multitude d'ARNm de taille variable, traduits ensuite en une multitude de prot6ines de taille variable, avec des propri6t~s biologiques variables, voire antagonistes. Ce polymorphisme mol6culaire existe & 1'6tat normal (diversification ph6notypique), mais il accompagne 6galement des 6tats pathologiques et prend une importance croissante en canc6rologie. Des puces de variants d'epissage, constitu6es de milliers de s6quences specifiques d'6pissages alternatifs trouv6s darts les tumeurs malignes, sont actuellement d6velopp~es par ExonHit, soci6t6 fran~aise de biotechnologie. Une premiere 6tude conduite & rlnstitut Curie a montr6 qu'un profil compos6 d'une dizaine d'6pissages alternatifs permettait de distinguer les patientes qui r6pondent & une premiere ligne de chimioth6rapie pour KS, de celles qui ne r6pondent pas ou peu. Ces methodes ouvrent de nouveiles voies pour explorer la complexit6 biologique des cancers et mieux la comprendre. La confrontation des r6sultats des analyses des alt6rations gen6tiques (par hybddation genomique comparative) consid6r6es comme, causales ,, et ceux des analyses d'expression des g6nes (transcriptome et spliceome notamment) devrait 6clairer les mecanismes de leur r6gulation et de leurs dysfonctionnements dans les tissus canc~reux.

Pour en savoir plus :

(1) Prognostic and predictive markers in breast cancer. In : Tumor markers physiology ; Pathobiology, technology and clinical appictions, EP Diamants. AACC Press, 2002, p. 189.

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