MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES

EXPERIMENTALES

Biologie clinique – prélèvements méthodes -

valeurs

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES

Biologie clinique - domaine

analyses de base• urgentes, souvent de caractère vital• nombre limité (20 à 30)• part importante de l'activité des laboratoires au plan économique• 8 analyses biochimiques essentielles représentent 1/3 des analyses

remboursées (lipides, NF, glycémie, urée créatinine, VS, bilan électrolytique, coagulation (temps de Quick), transaminases, acides urique et microbiologie de base)

analyses spécialisées• grande valeur informative, rarement vitales• nombre > 1000 mais demande faible• domaine privilégié de l'innovation

analyses non validées • transfert technologique non fait ou analyse abandonnée• résultat de l'échange d'informations entre scientifiques, industriels, cliniciens,

biologistes• témoins de la vitalité de la recherche en biologie clinique


Biologie clinique – évolution technologiques

• Disparition presque totale des techniques chimiques au profit des techniques enzymatiques pour les paramètres courants automatisation complète et performante

• Explosion des techniques immunologiques au dépend des techniques de radioanalyse automatisation

• Explosion des techniques de biologie moléculaire simplification des techniques et formation des personnels des laboratoires privés

• Développement des analyses délocalisées (méditests, autotests, tests rapides d'orientation clinique TROC) utilisant chimie sèche, automates portables, immunotests simples

• Diversification des procédures de séparation et analyses de mélanges complexes


Biologie clinique - qualité d'une analyse biologique

la qualité de l'analyse biologique correspond à la qualité de l’acte médical

qualité technique proprement dite : précision, exactitude, sensibilité, spécificité valeurs les plus précises et exactes possibles

qualité chronologique (réponse à l'urgence)qualité informative :

dépend en partie des 2 premièresdépend du contexte scientifique et médical valeurs significatives et utilisables Valeurs obtenues à comparer aux valeurs de références Nécessaire maîtrise de la variation analytique et des variations biologiques

qualité économique paramètre de + en + important !!

la biologie clinique = discipline de nature quantitative existence déjà ancienne de méthodes chiffrées d'évaluation de la qualité contrôle soigneux de tous les facteurs.


Biologie clinique - qualité d'une analyse biologique

Référentiels :Guide des bonnes pratiques de laboratoire (UPPL)Guide de bonne exécution des analyses (GBEA)Référentiel d'accréditation et/ou de certification

Les différents types de contrôlePool de sérumMéthode économique (études de précision, dérives analytiques, erreurs fortuites)Contrôles commerciauxPool de sérums lyophilisés, contrôlés et garantis ( la sécurité)Contrôles par les résultats des patientsPool des valeurs obtenues sur les patients "tout venant" (exemple : bilan d'entrée)Contrôles interlaboratoires : 3 catégories- interhospitaliers- régionaux (Région Rhône-Alpes : Pro Bioqual)- national de qualité (CNQ, obligatoire depuis 1976, sous l'égide de l'Agence du

Médicament et sous contrôle de la SFBC depuis 1993, peut avoir pour conséquence des sanctions).


matériel biologique

SANGConditions de prélèvement

sujet à jeun depuis 10hprélèvement entre 7h et 10h (si possible après 7 à 8h de sommeil)pas d’exercice intense pendant les 2 jours précédant le prélèvementpas de tabac pendant les 2 heures précédant le prélèvementrepos assis 15 mn

Modes de prélèvement : veineux : veines superficielles, garrot éventuel peu serré, veinotubescapillaire : pulpe doigts, lobe oreille, talon, vaccinostyles, microtubes

sang artériolisé par massage du doigt, attention couveuses!!artériel : artères fémorale ou humérale (gaz du sang, ammoniaque)

ParticularitésVariations nycthéméralesClinostatisme, orthostatismeEtat pathologique ou physiologique particulier

Conservation : froid, obscurité, déprotéinisation



SANGEtapes du prélèvement

Se préparer (habillage, désinfection des mains, gants stériles)Installer le patient pour le prélèvement,Recueillir et/ou vérifier les informations administratives, physiopathologiques et thérapeutiquesChoisir le matériel de ponction,Poser le garrot,Désinfecter le matériel de ponctionRéaliser le prélèvement,Éliminer le matériel de ponctionIdentifier les tubes de prélèvement,Poser un pansement,Viser la fiche de prélèvement,Transmettre les tubes et le dossier patient pour analyse

Important : étiquetage, choix du tube (granules de séparation, anticoagulant), penser à éviter l’hémolyse



Ponction de sang veineux









SANG - EchantillonsSérum

Coagulation spontanée du sang sans anticoagulant : qques minutesRisques liés au contact prolongé avec éléments figurés

actuellement réduits (billes séparatives, silice activatrice)Intérêts : protéines spécifiques (immunochimie), lipides

électrophorèse des protéines ou lipoprotéinesplasma

intérêts : manipulation aisée, risques réduits d’hémolyse risques : interférence avec anticoagulants

sang totalvalable pour l’analyse si substance en concentration identiquedans globules rouges et plasma

sang deprotéinisélactate, pyruvate

éléments figurés séparation par sédimentation, centrifugation, gradients de densité

Interférences dans les dosages effectués sur sang et échantillons hémolyse, bilirubine, triglycérides, médicaments



URINESDe 24 heures ou échantillon uniqueConditions de recueil standardisées

boire correctement le jour précédentélimination de la première urinenettoyage local soignéflacon ou cantine prévus à cet effet

Conservation : mercaptoethanol, HCLContrôle du débit (créatinine)Modification du pH

AUTRES LIQUIDESLarmes, sueur, saliveLiquides de ponction

Transsudats (pauvres en protéines)Exsudats (riches en protéines = perméabilité membranaire)

SELLES



TISSUS

Ponction biopsieTraitements - préservant la structure tissulaire

perfusion organe entierfragments ou tranches tissulaires (congelés ou en survie, Warburg 0,2 nm)coupes fines de tissus fixés (froid, paraformaldéhyde, glutaraldéhyde)

broyats (mixage)- modifiant la structure tisssulaire

homogénats (cylindre en verre + piston – Potter)destruction tissulaire (ultrasons, froid, tensio-actifs)isolement des constituants subcellulaires

centrifugation différentiellepurification par identification de marqueurs (enzymes)

Culture cellulaire


méthodes préparatives et/ou séparatives

DISSOCIATION CELLULAIREObtenir les informations métaboliques spécifiques de chaque type cellulaire nécessite

l’obtention de suspensions monocellulaires dont l’analyse est directe ou après prolifération en culture

Dissociation des tissusRupture mécanique (broyage, tamisage, fragmentation fine)Rupture de la MEC et des jonctions intercellulaires

Enzymes protéolytiquesAgents chélatantsMéthodes combinées

Prélèvements de suspensions cellulaires (sang, liquide amniotique…)Séparation cellulaire

Méthodes classiques de centrifugation (+ ou- gradients de densité)Différences d’adhésion au support

nature : verre, plastiquemodifié : chimie, immunochimie

Différences de croissance en culture (milieu sélectifs)Tri des cellules marquées (FACS, MACS)



CULTURE CELLULAIRE

Définition système ex-vivo où les cellules, la plupart du temps isolées, survivent, se multiplient, expriment des propriétés différenciées

MéthodologieFragments tissulaires ou suspensions cellulairesSupports de culture (parfois, enceintes)Conditions environnementales

stérilitéatmosphère contrôléetempérature contrôléemilieu de culture (nutritif, stimulant)



CULTURE CELLULAIRE

Systèmes cellulairesPrimoculture ou culture primaireCulture secondaire : souches ou lignées non définies

lignées continuesInterférences

Autres cellulesSupportContaminations

Conservation des cellulescryopréservation (-80°, - 196°)quiescence

Transport des cellulesen culturecongelées

Applications

Documents

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